司原成,任晨晨,陳 波,張二偉,康朝霞,李志菊,高璐琪

(貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550025)

肥胖的問題日趨嚴(yán)重,已成為全球流行的慢性疾病[1-2],其形成發(fā)展與脂質(zhì)代謝關(guān)系密切[2]。研究表明,單純性肥胖癥患者存在一定程度血脂異常,血清中脂肪細(xì)胞分泌的脂肪細(xì)胞因子顯著高于正常人[3]。中醫(yī)名家朱丹溪《丹溪心法》闡明“肥人多痰濕”[4],《黃帝內(nèi)經(jīng)》詳載過食肥甘、膏粱厚味等物,易于阻礙脾胃運化功能,導(dǎo)致肥胖出現(xiàn)[5]。針灸是中醫(yī)學(xué)中重要的治療方法之一,電針是針刺方法之一[6]。針灸治療單純性肥胖從健脾、益氣、化痰等角度入手,治療單純性肥胖癥,選擇中脘、關(guān)元、天樞、足三里等四穴疏通經(jīng)絡(luò)、通調(diào)腑氣,降脂化痰,調(diào)控脂質(zhì)代謝途徑[7]。

課題組在肥胖研究過程中,利用新科學(xué)技術(shù)探尋肥胖治療的有效方式,在電針治療肥胖顯效的基礎(chǔ)上,比較治療前后脂肪酸合成酶(Fas)代謝調(diào)控的顯著變化,深入研究揭示單純性肥胖癥的機制?，F(xiàn)將課題組研究成果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只SPF級C57BL/6小鼠,8周齡,體質(zhì)量(30±2)g,購買于長沙天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(湘)2019-0013],飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院實驗動物房內(nèi),溫度23～25℃,濕度40%～60%,晝夜各半,7∶00-19∶00開燈,19∶00-7∶00關(guān)燈。自由攝食飲水。實驗符合貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會實驗動物福利和倫理相關(guān)規(guī)定,倫理編號:20210022。

1.1.2 實驗試劑 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司的脂聯(lián)素(ADPN)試劑盒(批號:57KIPS 7RAG)和瘦素(LEP)試劑盒(批號:Q263T2L4IP);南京建成生物工程研究所的CHO試劑盒(批號:20210629)和TG試劑盒(批號:20210629)。

1.1.3 實驗儀器 全自動酶標(biāo)儀(型號:ELX808 IU-P;廠家:美國寶特公司);小型高速臺式冷凍離心機(型號:Multiskan X1R;廠家:美國THermoScientic公司);快速核酸提取儀(型號:FastPrep-24;美國MP Biomedicals公司);電子針灸治療儀(型號:G6805-Ⅱ型;青島鑫生實業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 課題實驗參照高脂飲食誘導(dǎo)肥胖,建立C57BL/6小鼠肥胖癥模型[8-9]。將購買得到的50只小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)5d,隨機選取10只作為正常組,其余40只飼以高脂飲食8周,得到體質(zhì)量顯著高于正常組均值20%的肥胖小鼠20只。正常組小鼠,繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料,肥胖鼠繼續(xù)飼養(yǎng)高脂飲食。

1.2.2 分組及干預(yù) 將復(fù)制得到的20只肥胖小鼠均分成模型組和電針組。電針組,所選穴位參照2021版《實驗針灸學(xué)》[10],斜刺天樞4mm,斜刺關(guān)元5mm,直刺足三里3mm,直刺三陰交4mm,施以捻轉(zhuǎn)手法,得氣后,接通電針儀,疏密波,30～150Hz之間,強度1～2mA,以局部輕微顫抖為度,留針10min,日1次,左右交替取穴,正常組與模型組不予電針干預(yù),以相同方式固定10min。

1.2.3 取材 每周定期測量所有小鼠體質(zhì)量、體長等指標(biāo)。實驗治療干預(yù)后,股動脈采血,脫頸椎處死,無菌操作剖開腹腔,剪取腎周脂肪組織和肝臟組織,稱重后,剪取1cm×1cm大小的組織,放置于無菌無酶的2mL平底EP管中,-80℃冰箱保存,用于檢測Fas代謝相關(guān)指標(biāo)的差異變化。

1.2.4 檢測 (1)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA):參照ELISA試劑盒操作說明書,測定實驗鼠血清血脂CHO、TG、LEP、ADPN及脂肪組織中Fas含量的差異變化。

(2)HE染色:參照HE染色的說明書和操作方法,觀察選擇400倍視野下上、下、左、右四個脂肪細(xì)胞的直徑進(jìn)行分析,觀察各組脂肪組織直徑的差異變化。

(3)油松染色:使用200倍成像的顯微鏡,使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測量每張切片中三個視野脂滴像素面積和對應(yīng)的組織像素面積,計算公示如下:脂滴面積占比(%)=脂滴像素面積/組織像素面積×100%。

(4)Fas基因及蛋白的相對表達(dá)量:檢測Fas基因采用Rt-PCR方法進(jìn)行[11]。利用Trizol法提取組織總RNA,通過提取試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,再通過目標(biāo)引物(5′-AGCCCGGCCAGCGATACAGA-3′;3′-TGGATACCGGGCCCACCAGG-5′)測定Fas基因的相對表達(dá)量。檢測Fas蛋白采用Western blot(WB)方法進(jìn)行。參照蛋白提取試劑盒說明書,提取小腸中段組織的總蛋白,通過Fas的單克隆抗體檢測其在各組實驗鼠中的含量水平。Rt-PCR和WB方法檢測,重復(fù)3遍。

2 結(jié)果

2.1 電針對營養(yǎng)性肥胖鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)的影響

如表1所示,治療前,模型組和電針組實驗鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)均顯著高于正常組;經(jīng)電針干預(yù)21d后,電針組的實驗鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)均明顯降低。

表1 電針對營養(yǎng)性肥胖鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)的影響

2.2 電針對營養(yǎng)性肥胖鼠血脂及血糖的影響

如表2所示,模型組血清CHO、TG、LDL-C含量均明顯高于正常組,經(jīng)電針干預(yù)21d后,電針組實驗鼠血清CHO、TG、LDL-C均明顯降低。各組血清HDL-C和血糖均無明顯變化。

表2 電針對營養(yǎng)性肥胖鼠血脂及血糖的影響

2.3 電針對營養(yǎng)性肥胖鼠脂肪細(xì)胞因子ADPN及LEP的影響

如表3所示,模型組腎周脂肪組織中ADPN明顯低于正常組,而LEP含量均明顯高于正常組;經(jīng)電針干預(yù)21d后,電針組實驗鼠腎周脂肪組織中ADPN明顯升高,LEP含量均明顯降低。

表3 電針對營養(yǎng)性肥胖鼠脂肪細(xì)胞因子ADPN及LEP的影響

2.4 電針對營養(yǎng)性肥胖鼠腎周脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

圖1所示,模型組腎臟周圍脂肪組織的質(zhì)量(圖1d)、細(xì)胞形態(tài)直徑(圖1 b)的均值顯著高于正常組(圖1a),電針治療后腎臟周圍脂肪的質(zhì)量和細(xì)胞直徑(圖1c、圖1e)明顯減少。

圖1 各組腎臟周圍脂肪組織的形態(tài)、脂肪細(xì)胞直徑的變化

2.5 電針對營養(yǎng)性肥胖鼠肝臟組織中脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2所示,模型組肝臟組織中油粒大小的分布(圖2b)的均值顯著高于正常組(圖2a),電針治療后肝臟組織中油粒分布明顯降低(圖2c)。

圖2 各組肝臟組織中油粒分布的差異變化

2.6 電針對營養(yǎng)性肥胖鼠各組脂肪組織中Fas含量、Fas基因及蛋白的相對表達(dá)的變化

如圖3a所示,模型組脂肪組織中Fas的含量顯著高于正常組,經(jīng)電針干預(yù)治療后,肥胖鼠脂肪組織中Fas的含量均顯著下降(P<0.01)。如圖3b所示,模型組脂肪組織中Fas基因的表達(dá)的顯著高于正常組,經(jīng)電針干預(yù)治療后,肥胖鼠脂肪組織中Fas基因的表達(dá)顯著下降(P<0.01)。如圖3c所示,模型組脂肪組織中Fas蛋白的表達(dá)顯著高于正常組,經(jīng)電針干預(yù)治療后,肥胖鼠脂肪組織中Fas基因的表達(dá)顯著下降(P<0.01)。

圖3 各組脂肪組織中Fas含量、Fas基因及蛋白的相對表達(dá)的變化

3 討論

目前,單純性肥胖癥已成為健康問題,是健康的高危影響因素,其與眾多疾病關(guān)系密切,如糖尿病、高血壓、高脂血癥、關(guān)節(jié)炎及部分癌癥等[12]。單純性肥胖癥在形成發(fā)展進(jìn)程中,與機體脂質(zhì)代謝異常關(guān)系密切,常伴隨有血脂異常升高,脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(ADPN、LEP等)明顯升高,這些細(xì)胞因子是調(diào)整機體脂質(zhì)代謝平衡的重要內(nèi)分泌激素,其水平的高低直接關(guān)系機體脂質(zhì)代謝調(diào)控[13]。此外,有研究表明[14],單純性肥胖癥的發(fā)展還與機體脂肪細(xì)胞的堆積有關(guān),進(jìn)一步造成肥胖癥患者體型的異常發(fā)展[15]。

在傳世的中醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作中,單純性肥胖癥的形成病因與痰、濕、虛、瘀四大因素有關(guān),體現(xiàn)為本虛(氣虛)、標(biāo)實(膏脂、痰濁)的證候。先天稟賦不足,嗜以膏粱厚味,脾失健運,導(dǎo)致痰濕蓄積而發(fā)肥胖[16]。通常運用健脾、益氣、祛濕、化痰的方法進(jìn)行治療,整體調(diào)節(jié)臟腑功能,促進(jìn)脂質(zhì)代謝分解。針灸是中醫(yī)學(xué)干預(yù)疾病的重要治療手段之一,通過疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)理腸腑、祛濕化痰等作用治療單純性肥胖癥[17]。電針是針刺療法常用且可量化實施的方法之一,目前廣泛應(yīng)用于治療針灸適宜病種,如單純性肥胖癥[18]。電針將電信號以波的形式輸送到針刺部位,持續(xù)為針刺腧穴行針,提高針刺治療效果,而且電針輸送生物電信息,通過針體直接作用于脂肪層,促進(jìn)脂肪組織的脂質(zhì)代謝,更好達(dá)到減肥消脂的目的[19]。電針選取中脘、關(guān)元、天樞、足三里四穴進(jìn)行治療,中脘是“腑會”和“胃之募穴”,調(diào)理腸胃,促進(jìn)代謝;天樞是“大腸募穴”,疏調(diào)水道,消脂減肥;關(guān)元是“小腸募穴”,調(diào)解腸腑功能;足三里是胃“下合穴”,治療胃腸疾患;四穴合用,共奏健脾、益氣、減肥、消脂功效[20]。

本實驗選用近交系C57BL小鼠,其較容易建立穩(wěn)定的營養(yǎng)型肥胖模型[21],通過60%的高脂飼料喂養(yǎng),約有50%的小鼠能夠肥胖。通過觀察不同組別實驗鼠的整體水平數(shù)據(jù),課題組發(fā)現(xiàn)電針顯著降低肥胖鼠體質(zhì)量和體脂;進(jìn)一步研究表明,模型肥胖鼠血清CHO和TG顯著高于正常組,經(jīng)過治療后,顯著降低肥胖鼠血清CHO和TG的含量。脂肪組織分泌特有激素脂肪細(xì)胞因子ADPN和LEP是調(diào)解脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵激素,合成及堆積脂肪,通過活化肌肉組織中腺苷酸激活蛋白激酶途徑及過氧化物酶體增殖物激活受體α,增加脂肪酸氧化,抑制脂肪脂質(zhì)代謝[22]。模型肥胖鼠腎臟周圍脂肪組織中分泌的ADPN和LEP均顯著高于正常鼠,經(jīng)過治療后,肥胖鼠的脂肪組織中的ADPN和LEP也得到有效改善。在單純性肥胖的形態(tài)學(xué)研究中,模型肥胖鼠腎臟周圍脂肪細(xì)胞的直徑和體積顯著增加,肝臟組織細(xì)胞中的脂肪油粒比重顯著高于正常小鼠,經(jīng)過治療后,肥胖鼠腎臟周圍脂肪細(xì)胞直徑及肝臟組織細(xì)胞中脂肪油粒明顯減小。

在脂質(zhì)代謝中,Fas起關(guān)鍵作用,在脂肪組織儲存和運輸能量,維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,提供多種激素合成所需的中間產(chǎn)物等方面起到重要作用[23]。模型肥胖鼠腎周脂肪組織中Fas含量顯著高于正常鼠,并腎周脂肪組織中的Fas基因和蛋白的表達(dá)顯著高于正常鼠,經(jīng)治療后,肥胖鼠腎臟周圍脂肪組織中Fas含量及基因蛋白的表達(dá)顯著降低,表明電針具有調(diào)整Fas基因及蛋白表達(dá)的重要作用。

綜上所述,電針良性調(diào)控對營養(yǎng)型肥胖癥小鼠的體質(zhì)量、血脂(CHO、TG)、脂肪細(xì)胞因子(ADPN、LEP)、脂肪組織的形態(tài)及油粒分布。在機體脂質(zhì)代謝上,電針顯著調(diào)節(jié)脂肪組織中的FAS含量及基因和蛋白的表達(dá)功能,進(jìn)而調(diào)整機體脂質(zhì)代謝。課題組會在進(jìn)一步的研究中確認(rèn)其更密切的作用關(guān)系。電針改善肥胖癥的脂質(zhì)代謝有重要意義。