曲 磊，魏 天，王成宇，王思月，肖 丹，張芳毓，王永志

吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，吉林長(zhǎng)春 130118

羊衣原體病是由衣原體引起的一種亞急性、感染性疾病，在我國各地均有發(fā)生，任何品種、日齡和性別的羊均能感染，母羊和羔羊的易感性相對(duì)較高。該病主要通過排泄物（如糞便、尿液）、分泌物（如淚液、鼻液）、流產(chǎn)胎兒、呼吸道（污染的塵埃、氣溶膠）及破損的皮膚、黏膜等感染其它健康羊只。另外，羊的自身免疫機(jī)能強(qiáng)弱也是患羊衣原體病的原因之一，免疫能力越弱，患病概率就越大，免疫能力弱可能與飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境衛(wèi)生不良、攝取營養(yǎng)不均等有關(guān)。羊感染后體內(nèi)持續(xù)帶菌，感染初期無明顯臨床表現(xiàn)，懷孕母羊通常在妊娠后期流產(chǎn)、產(chǎn)弱羔或死胎等，臨床上還較多見關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎或胸膜肺炎等癥狀，嚴(yán)重制約了養(yǎng)羊業(yè)的快速健康發(fā)展。

為了有效遏制羊衣原體病的廣泛傳播、擴(kuò)散，開展早期檢測(cè)意義重大。目前，針對(duì)羊衣原體病的檢測(cè)方法主要為病原學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)及核酸檢測(cè)3 個(gè)方面。本文就上述檢測(cè)方法逐一論述，為檢測(cè)羊衣原體病提供參考。

1 病原學(xué)檢測(cè)

1.1 病原分離培養(yǎng)

病原分離培養(yǎng)主要為雞胚分離法、細(xì)胞培養(yǎng)法和小鼠接種等方法。雞胚分離法技術(shù)成熟，將處理后的0.4 mL 樣品接種到7日齡雞胚卵黃囊中，置37 ～38.5 ℃環(huán)境下孵育，收集接種后4 ～7 d 出現(xiàn)規(guī)律性死亡的卵黃囊膜涂片，觀察是否有衣原體染色顆粒。

細(xì)胞分離法對(duì)細(xì)胞生存環(huán)境非常嚴(yán)格，流產(chǎn)衣原體常用McCoy、BGM 和BHK 細(xì)胞分離，將處理后的病料接種至單層細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件下孵育2 h，2 ～3 d 后染色鏡檢鑒定。

遇污染嚴(yán)重病料，可選擇3 ～4 d 的小白鼠，采用腹腔注射0.5 ～1 mL、腦內(nèi)接種0.02 mL 或滴鼻2 ～3 滴方式接種，腹腔注射4 ～7 d 后，剖檢取臟器表面淡灰黃色、黏稠的滲出液染色鏡檢鑒定，以腦、肺、肝、脾涂片也可觀察到衣原體。

病原的分離始終被認(rèn)為是診斷衣原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”和最敏感的檢測(cè)方法，也可以對(duì)毒株進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆中停秉c(diǎn)是對(duì)生物樣本的采集、儲(chǔ)存及運(yùn)輸要求較高，需要依靠專業(yè)技術(shù)人員及培養(yǎng)設(shè)施，確診時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)需要考慮安全問題。

1.2 病原的鑒定

無菌條件下，將可疑病畜的胎盤、流產(chǎn)胎兒、陰道拭子等組織直接涂片，通過染色鏡檢法鑒定病原，常用方法有姬姆薩氏染色法、碘染色法等。姬姆薩染色技術(shù)簡(jiǎn)單，特異性較高。采集的樣本涂片甲醇固定，用稀釋后的姬姆薩染色液染色，無菌生理鹽水沖洗，自然風(fēng)干，通過光學(xué)顯微鏡的油鏡觀察到包涵體中的原生小體呈紫紅色，不具有感染性的網(wǎng)狀體呈藍(lán)紫色。碘染色法與姬姆薩染色類似，樣本涂片后經(jīng)甲醇固定，碘染后，油鏡觀察可以看到紫紅色的原生小體顆粒和藍(lán)色的網(wǎng)狀體顆粒。直接染色鏡檢觀察較直觀，但缺點(diǎn)是靈敏度很低，適用于感染較嚴(yán)重的組織。此外，流產(chǎn)衣原體的染色特征與柯克斯體相似，存在誤檢、漏檢的可能，不適合大規(guī)模的檢測(cè)。

直接免疫熒光試驗(yàn)，將熒光標(biāo)記的多克隆抗體或單克隆抗體滴到涂片上，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 遍，自然晾干后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的包涵體即可確診為陽性。該方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高、操作簡(jiǎn)單、用時(shí)較短；缺點(diǎn)是對(duì)儀器要求較高，敏感性較差。

酶免疫測(cè)定法（EIA）利用衣原體抗原與酶標(biāo)抗體的特異性反應(yīng)，當(dāng)加入酶的底物出現(xiàn)特征性的反應(yīng)即判定為陽性，優(yōu)點(diǎn)是時(shí)間短，適合批量檢測(cè)；缺點(diǎn)是易與其它微生物發(fā)生交叉反應(yīng)。

2 血清學(xué)檢測(cè)

2.1 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)(CFT)

CFT 是最常用的血清學(xué)檢測(cè)方法之一，該檢測(cè)方法操作繁瑣特異性強(qiáng)，也常用作于衣原體性質(zhì)識(shí)別以及抗原（抗體）研究。該試驗(yàn)原理包括反應(yīng)系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)和指示系統(tǒng)。首先，反應(yīng)系統(tǒng)與補(bǔ)體作用，隨后，指示系統(tǒng)利用剩余補(bǔ)體反應(yīng)。若反應(yīng)系統(tǒng)中有抗體或抗原，則形成免疫復(fù)合物而固定和消耗補(bǔ)體，使隨后加入的指示系統(tǒng)無多余補(bǔ)體可利用，則無溶血反應(yīng)發(fā)生，反之亦然。不溶血為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽性。但由于參與反應(yīng)的成分多，影響因素復(fù)雜，運(yùn)用該方法有時(shí)候會(huì)得到假陽性的結(jié)果。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA）

ELISA 主要是用已知酶標(biāo)記的抗體或抗原去檢測(cè)與某種固相載體表面結(jié)合的未知抗體或抗原，根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺做定量或定性分析。在用此方法檢測(cè)羊衣原體時(shí)，由于衣原體脂多糖（LPS）抗原與一些革蘭氏陰性菌上的表位一致，故會(huì)出現(xiàn)假陽性的可能。為防止假陽性的出現(xiàn)，可以考慮用含有特異性單克隆抗體的ELISA 試劑盒，但此試劑盒靈敏度較低，需樣本濃度較高。

2.3 間接血凝試驗(yàn)(IHA）

將羊衣原體抗原(抗體)包被于綿羊紅細(xì)胞表面，成為致敏的載體，然后再加入相應(yīng)的抗體（抗原）結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集，即為IHA。IHA 的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)效率高、敏感性好，在臨床上得到廣泛應(yīng)用，在羊衣原體血清學(xué)調(diào)查方面起到至關(guān)重要的作用。

2.4 膠體金免疫層析技術(shù)(GICA）

GICA 是一種成本低、易操作、高特異性、肉眼判定的檢測(cè)方法。它是以膠體金為顯色媒介，應(yīng)用于抗原抗體特異性結(jié)合的一種新免疫標(biāo)記技術(shù)，它需要在層析過程中完成這一反應(yīng)，原理與ELISA試劑相似，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，結(jié)果可迅速判定。

3 核酸檢測(cè)

3.1 基因探針檢測(cè)法

基因探針即核酸探針，是已知且?guī)в袡z測(cè)標(biāo)記的，與目的基因互補(bǔ)的DNA 或RNA 片段。其檢測(cè)方法操作繁瑣、靈敏性較高?，F(xiàn)已有上市的商品化試劑盒。用基因探針檢測(cè)法來檢測(cè)衣原體，主要是檢測(cè)羊衣原體單鏈RNA。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR）

PCR 是實(shí)驗(yàn)室最常用的核酸檢測(cè)方法，應(yīng)用于體外擴(kuò)增目的基因片段，此方法經(jīng)過三個(gè)基本反應(yīng)（變性、退火、延伸），用于定性或半定量檢測(cè)。PCR 以速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外衣原體的檢測(cè)中。

3.3 熒光定量PCR(qPCR)

qPCR 是在傳統(tǒng)的凝膠電泳PCR 方法的基礎(chǔ)上，極大提高了檢測(cè)的特異性和敏感性，適用于定量分析。它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。此方法在檢測(cè)衣原體的外膜主要蛋白基因和多形態(tài)膜蛋白基因方面得到廣泛應(yīng)用。

3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP）

LAMP 不僅是一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，而且在分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，它是一種成本低、特異性強(qiáng)、不依賴任何儀器設(shè)備、適合臨床大批量檢測(cè)的高通量快速檢測(cè)方法。它的特征是根據(jù)靶基因上的六個(gè)區(qū)域來設(shè)計(jì)的四條引物，利用鏈置換Bst DNA 聚合酶進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，15 ～60 min可實(shí)現(xiàn)指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增，通過反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無來判斷靶基因是否存在。

3.5 限制性片段多態(tài)性分析(RFLP）

RFLP 是一種操作復(fù)雜、成本高、檢測(cè)結(jié)果可靠、適合小規(guī)模檢測(cè)的DNA 標(biāo)記技術(shù)。它是檢測(cè)DNA 在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小，再將這些片段電泳、轉(zhuǎn)膜、變性，與標(biāo)識(shí)標(biāo)記過的探針進(jìn)行雜交，洗膜，即可分析其多態(tài)性結(jié)果。

3.6 DNA 微陣列

DNA 微陣列是將大量的探針分子固定于載體上后與標(biāo)記的待測(cè)樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度從而獲得待測(cè)樣品分子的數(shù)量和序列信息。該技術(shù)能進(jìn)行高通量的檢測(cè)，但不能在多細(xì)胞類型組織中對(duì)待檢的基因精確定位進(jìn)行判斷。目前，檢測(cè)流產(chǎn)衣原體的DNA 微陣列商品化產(chǎn)品很多。該技術(shù)主要流程為芯片的制備、樣品的制備、雜交反應(yīng)及芯片信號(hào)的檢測(cè)與分析。

4 小結(jié)

羊衣原體病不僅給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還是重要的人畜共患傳染性疾病，危害著人類和家畜的健康安全。檢測(cè)羊衣原體病的方法非常重要，它可以有效地遏制傳染源、降低患病風(fēng)險(xiǎn)。羊衣原體檢測(cè)技術(shù)經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查、分離鑒定、免疫學(xué)檢測(cè)到現(xiàn)在的分子生物學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)技術(shù)越來越多。本研究主要講述病原學(xué)、血清學(xué)及核酸檢測(cè)方法在檢測(cè)羊衣原體方面發(fā)揮的作用，雖部分檢測(cè)方法存在一些缺點(diǎn)，但可為檢測(cè)羊衣原體病提供參考。