張濱爍，趙婉婷，張嘉嘉，李青峰，張璐璐，梁雪玉，蘇安玉，于振海，李松竹，武小霞，趙瑩**

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省依安縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，黑龍江 齊齊哈爾 161500；3.黑龍江省蘿北縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，黑龍江 鶴崗 154100）

大豆作為植物蛋白、食用油脂和蛋白飼料，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植[1]。隨著人們生活水平提高和養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，我國(guó)豆油和飼料需求量逐年攀升，亟需提高大豆產(chǎn)量滿足需求。傳統(tǒng)育種方法耗時(shí)長(zhǎng)、改良效果不確定，難以滿足實(shí)際生產(chǎn)需求[2]。轉(zhuǎn)基因生物育種技術(shù)可縮短育種年限，實(shí)現(xiàn)大豆定向改良，為大豆產(chǎn)量提高提供了新思路[3]。

Sharma 等[4]研究表明，植物再生通過(guò)一系列定向細(xì)胞的分裂和細(xì)胞壁擴(kuò)張完成。不同大豆品種再生能力與其細(xì)胞壁擴(kuò)張能力和細(xì)胞分裂分化密切相關(guān)。因此，深入探究大豆再生分子機(jī)制，對(duì)實(shí)現(xiàn)大豆轉(zhuǎn)基因有效應(yīng)用和大豆定向育種改良，提高大豆產(chǎn)量具有重要意義。

植物細(xì)胞壁為動(dòng)態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可為植物提供機(jī)械支撐、維持細(xì)胞形狀，還可控制細(xì)胞擴(kuò)增[5]。纖維素伸展方向決定細(xì)胞形狀和生長(zhǎng)方向[6]。Roudier 等[7]研究發(fā)現(xiàn)COBRA 基因在纖維素生物合成中發(fā)揮重要作用，可影響細(xì)胞擴(kuò)展方向。COBRA 基因家族通過(guò)編碼糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定蛋白參與細(xì)胞定向生長(zhǎng)和纖維素生物合成[8]。作為GPI 錨定蛋白，COBRA 蛋白除包含CCVS 結(jié)構(gòu)域、N-末端信號(hào)肽和纖維素結(jié)合位點(diǎn)外，還含有關(guān)鍵疏水C-末端GPI 錨定位點(diǎn)ω[9]。當(dāng)GPI 修飾位點(diǎn)被修飾后，GPI 錨定蛋白被分泌至高爾基體囊泡中，后在質(zhì)膜上調(diào)節(jié)纖維素鏈的組裝及合成[5]，一些GPI 錨定蛋白通過(guò)蛋白水解酶水解最后被釋放于細(xì)胞膜外[10]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，COBRA 家族基因的多個(gè)成員參與細(xì)胞壁纖維素生物合成，在多種細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。如COBRA 基因參與根的伸長(zhǎng)和根毛生長(zhǎng)，參與花粉管伸長(zhǎng)等過(guò)程[11-12]。在玉米中，COBRA 基因參與次級(jí)細(xì)胞壁生物合成，其缺失可影響細(xì)胞壁中纖維素合成，對(duì)bk2-Mu7突變體的研究表明，該基因突變可影響纖維素在細(xì)胞壁中的沉積，從而影響玉米莖的強(qiáng)度[13]。在水稻中，Bc1 和纖維素合成酶在纖維素合成不同生物過(guò)程中均發(fā)揮作用，Bc1 與纖維素合成酶相互作用，共同影響纖維素結(jié)晶度，從而影響纖維素組裝過(guò)程[14]。在棉花中，GhCOBL8A 可促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞壁增厚[15]。此外，在番茄中，過(guò)表達(dá)COBRA 基因可增強(qiáng)果實(shí)厚度并延長(zhǎng)保鮮期[16]。在楊樹(shù)的芽尖器官中發(fā)現(xiàn)COBRA 基因高度表達(dá)，表明其可能參與植物細(xì)胞擴(kuò)增[17]。以上研究表明COBRA 基因在不同植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有多種不同功能，為深入研究其作用機(jī)制提供了新思路。

最新研究表明，COBRA 基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育及再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前已在擬南芥[9]、水稻[18]、玉米[19]等植物中鑒定出一定數(shù)量的COBRA 家族基因成員，但對(duì)大豆COBRA 家族成員的研究報(bào)道較少。本文利用生物信息學(xué)方法對(duì)大豆COBRA 家族基因（GmCOBRAs）進(jìn)行全基因組水平鑒定，對(duì)COBRA 家族基因成員理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、保守結(jié)構(gòu)、種內(nèi)共線性及組織表達(dá)量等進(jìn)行分析，以期為深入探究COBRA 基因在大豆生長(zhǎng)發(fā)育和再生過(guò)程中的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

大豆東農(nóng)50、Keburi 和煙草（本氏煙草（Nicotiana benthamiana））均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SIM）：3.21 g B5 鹽+0.6 g MES + 30 g 蔗糖，pH 5.6 滅菌后加入0.321 g/L B5 維生素和1.67 mg/L 6-BA；（2）叢生芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基（SEM）：4.33 g MS + 0.6 g MES + 30 g 蔗糖，pH 5.6滅菌后加入0.321 g/L B5 維生素、0.1 g/L IAA、0.1 g/L GA3、0.1 g/L Glu 和0.1 g/L Asp。

1.1.3 儀器材料

試劑盒（OMEGAPlantRNAKit（50），R6827-01），上海索萊寶科技有限公司； 超微核酸分析儀（Nanodrop 2000），美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；諾唯贊HiScript R II Q RT SuperMix for qPCR（+ gDNA wiper）試劑盒（R223-01），南京諾唯贊生物科技有限公司；羅氏LightCycler480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)羅氏制藥有限公司；諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒（Q711-02），南京諾唯贊生物科技有限公司； KOD One 酶（KMM-101），上海根生生物科技有限公司。

1.1.4 其他材料

試驗(yàn)中的氨基酸序列、基因組注釋文件和基因組序列分別來(lái)自以下網(wǎng)站：大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（www.soybase.org）；植物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Phytozome（doe.gov））； NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih .gov）；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（SIB Swiss Institute of Bioinformatics|Expasy）；CELLO2.5（www.csbio.sjtu.edu.cn）；Williams 82。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆COBRA 基因家族成員鑒定

（1）以已發(fā)表的擬南芥COBRA 基因氨基酸序列為查詢目標(biāo)在植物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Phytozome（doe.gov））和NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行BLAST 比對(duì)。下載具有高度一致性（＞90%）和最低值（e＜10-10）的大豆COBRA 基因氨基酸序列。（2）進(jìn)一步確認(rèn)大豆COBRA 基因家族成員。檢索PFAM 數(shù)據(jù)庫(kù)中COBRA 結(jié)構(gòu)域的存在[20]，按照大豆COBRA 家族基因在大豆染色體組上從小到大的位置進(jìn)行排序。（3）從大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（www.soybase.org）收集大豆COBRA 基因家族成員所有遺傳信息，包括染色體位置、CDS 長(zhǎng)度、蛋白質(zhì)長(zhǎng)度。（4）使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（SIB Swiss Institute of Bioinformatics|Expasy）分析大豆COBRA 基因家族成員分子量和等電點(diǎn)大小。（5）采用CELLO2.5（www.csbio.sjtu.edu.cn）對(duì)大豆COBRA 蛋白亞細(xì)胞位置進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.2 大豆、水稻、擬南芥和玉米COBRA 基因家族進(jìn)化樹(shù)分析

從植物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Phytozome（doe.gov））下載大豆、水稻、擬南芥和玉米的COBRA 基因家族氨基酸序列，采用Clustal W 進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)[21]。采用MEGA5.0 軟件將比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行1 000 次重復(fù)構(gòu)建無(wú)根進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)iTOL（https://itol.embl.de/）網(wǎng)站進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)美化和保守結(jié)構(gòu)域分布可視化處理。

1.2.3 大豆COBRA 基因家族基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守基序分析

從植物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Phytozome（doe.gov））下載大豆基因組.gff3 注釋文件，通過(guò)基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器對(duì)大豆COBRA 外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，使用TBtools 軟件對(duì)大豆COBRA 基因家族進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)可視化處理[22]。采用MEME 在線網(wǎng)站對(duì)大豆COBRA 基因家族成員蛋白質(zhì)保守基序進(jìn)行分析（參數(shù)為maximum number of motifs = 10，optimum width = 6～100）[23]，使用TBtools 對(duì)其進(jìn)行可視化處理[22]。

1.2.4 大豆COBRA 基因家族組織表達(dá)量分析

從植物基因組學(xué)網(wǎng)站（Phytozome（doe.gov））下載大豆COBRA 基因家族成員的根、莖、葉、花、種子和莢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用Excel 表格進(jìn)行處理。表達(dá)量數(shù)據(jù)使用Log2進(jìn)行均一化處理，采用TBtools 熱圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理[22]。

1.2.5 大豆COBRA 基因家族實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以再生能力強(qiáng)的東農(nóng)50 和再生能力弱的Keburi叢生芽誘導(dǎo)第0、3、14 d（SIM-0、SIM-3、SIM-14）和叢生芽伸長(zhǎng)第3、5、14 d（SEM-3、SEM-5、SEM-14）為材料，選取6 個(gè)在種子中表達(dá)量較高的基因進(jìn)行qRT-PCR 分析。

使用試劑盒（OMEGA Plant RNA Kit（50），R6827-01）進(jìn)行組織部位RNA 提取，使用超微核酸分析儀（Nanodrop 2000）對(duì)提取的RNA 進(jìn)行濃度和純度測(cè)定。對(duì)提取的RNA 利用諾唯贊HiScriptRII Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒（R223-01）反轉(zhuǎn)錄成cDNA 單鏈。使用Primer 3 Plus（Primer3Plus-Pick Primers）中的Primer-BLAST 工具對(duì)大豆COBRA 基因進(jìn)行特異性引物篩選，隨后使用BLAST 工具驗(yàn)證序列。采用羅氏LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀和諾唯贊ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒（Q711-02）對(duì)不同時(shí)期大豆組織部位COBRA 基因表達(dá)水平作相對(duì)定量分析。以ACTIN4 為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品3 次重復(fù)，以叢生芽誘導(dǎo)第0 d 為對(duì)照，采用2-ΔΔCT方法[24]分析qRT-PCR 結(jié)果。所用引物見(jiàn)表1。

表1 目的基因擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物

1.2.6 大豆COBRA 基因家族共線性及染色體位置分析

在大豆基因組網(wǎng)站（Phytozome（doe.gov））獲得大豆全基因組序列文件，使用TBtools 對(duì)其進(jìn)行共線性分析，采用TBtools 進(jìn)行可視化處理[22]。在Williams 82 大豆參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中確定24 個(gè)大豆COBRA 基因在染色體上的位置，采用TBtools進(jìn)行可視化處理[22]。

1.2.7 GmCOBRA21 基因擴(kuò)增及煙草亞細(xì)胞定位

利用Snapgene 軟件確定EcoRⅠ和BamHⅠ這2 個(gè)酶切位點(diǎn)，將目的基因CDS 片段完全連接至Fu28 載體上。去掉目的基因CDS 終止密碼子后利用諾唯贊同源重組網(wǎng)站（入門(mén)克?。╲azyme.com））設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1）。以東農(nóng)50 種子cDNA 為模板，使用KOD One 酶（TOYOBO，上海）進(jìn)行擴(kuò)增（PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表2）。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后同源重組連接至Fu28 線性化入門(mén)載體上，使用大腸桿菌DH5α 進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，菌落PCR 鑒定后選取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒。將陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)LR 反應(yīng)連接至pSOYⅠ表達(dá)載體上，經(jīng)菌落PCR 鑒定將陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105 中，將構(gòu)建好的載體命名為pSOYⅠ-GmCOBRA21。

表2 KOD One PCR 反應(yīng)條件

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建好的表達(dá)載體pSOYⅠ-GmCOBRA21 轉(zhuǎn)入本氏煙草（Nicotiana benthamiana）進(jìn)行蛋白表達(dá)。在培養(yǎng)箱中對(duì)本氏煙草培養(yǎng)2 d后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況[25]。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

使用T 檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，其中“**”代表P＜0.01，“*”代表P＜0.05，I-0 時(shí)期為試驗(yàn)對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆COBRA 基因家族鑒定及分析

利用擬南芥COBRA 蛋白氨基酸序列在大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，刪除重復(fù)序列后進(jìn)行Pfam 分析，最終獲得24 個(gè)大豆COBRA 基因家族成員。

按照其在染色體上位置從小到大順序分別命名為GmCOBRA1-24（見(jiàn)表3）。

表3 大豆COBRA 基因家族蛋白質(zhì)信息及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

24 個(gè)GmCOBRAs 序列長(zhǎng)度為630～2 016 bp ，編碼氨基酸個(gè)數(shù)為210～672，分子質(zhì)量大小為22.7～74.7 ku，蛋白理論等電點(diǎn)為5.56～9.64。其中等電點(diǎn)大于7 的為19 個(gè)，等電點(diǎn)小于7 為5 個(gè)，表明GmCOBRAs 酸性氨基酸家族成員數(shù)量低于堿性氨基酸家族成員數(shù)量，該基因家族具有多樣性。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，24 個(gè)GmCOBRAs 均定位于細(xì)胞膜。

由圖1 可知，COBRA 基因家族的24 個(gè)成員不均等地分布在14 條染色體上，分別為Gm01、Gm02、Gm04、Gm05、Gm06、Gm07、Gm08、Gm09、Gm11、Gm12、Gm13、Gm17、Gm18 和Gm19。其中Gm04、Gm05、Gm06、Gm09、Gm11、Gm17 和Gm19 號(hào)染色體上的COBRA 基因位于染色體前端，Gm01、Gm07、Gm12、Gm13、Gm18 號(hào)染色體上的COBRA 基因位于染色體尾端。Gm18 號(hào)染色體上的GmCOBRA20、GmCOBRA21和GmCOBRA22 位置接近；Gm08 號(hào)染色體上的GmCOBRA11 和GmCOBRA12 位置接近；Gm06 號(hào)染色體上的GmCOBRA8 和GmCOBRA9 位置接近。

2.2 大豆COBRA 基因家族多序列比對(duì)分析

由圖2 可知，利用大豆基因組.gff3 文件在大豆中鑒定出的COBRA 基因多數(shù)具有Cys-Cys-Val-Ser保守結(jié)構(gòu)域（CCVS），這一結(jié)構(gòu)域在COBRA 家族蛋白中起關(guān)鍵作用。僅GmCOBRA6 基因無(wú)CCVS 結(jié)構(gòu)域，這表明該基因可能與COBRA 基因家族中其他成員功能不同。此外，除GmCOBRA2 外，大豆COBRA 基因含有N 末端信號(hào)肽，這表明由這些基因編碼的蛋白質(zhì)可能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入分泌途徑，或者定位于質(zhì)膜。

圖2 大豆COBRA 基因家族氨基酸多序列比對(duì)

2.3 大豆COBRA 基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖3 可知，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，大豆COBRA蛋白可分為與擬南芥、玉米和水稻的COBRA 家族基因相同的2 個(gè)亞家族[11,14,26]。第Ⅰ亞家族（CLUSTERⅠ）共有7 個(gè)GmCOBRA 基因，第Ⅱ亞家族（CLUSYER Ⅱ）共有17 個(gè)GmCOBRA 基因。其中，第Ⅰ亞家族與AtCOBRA8、AtCOBRA5、AtCOBRA10、AtCOBRA7 和AtCOBRA4 相似度較高； 第Ⅱ亞家族與AtCOBRA9、AtCOBRA11、AtCOBRA2、AtCOBRA6、AtCOBRA12、AtCOBRA1和AtCOBRA3 相似度較高。結(jié)果表明，大豆COBRA家族基因數(shù)目約為擬南芥COBRA 基因的2 倍。

圖3 大豆、擬南芥、玉米和水稻COBRA 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 大豆COBRA 基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

為深入了解大豆COBRA 基因家族結(jié)構(gòu)多樣性與系統(tǒng)發(fā)育之間關(guān)系，研究采用TBtools 工具繪制GmCOBRAs 基因內(nèi)含子和外顯子模型（見(jiàn)圖4）。由圖4 可知，GmCOBRAs 亞族的外顯子和內(nèi)含子大小和數(shù)量不同。第Ⅱ亞族外顯子平均長(zhǎng)度較長(zhǎng)，且包含6 個(gè)外顯子；第Ⅰ亞族外顯子較短，數(shù)量較少，為2～3 個(gè)。同時(shí)，同一亞族成員均具有相似外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，這種高度保守基因結(jié)構(gòu)影響其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果表明，COBRA 基因家族在大豆中具有較高的結(jié)構(gòu)多樣性和進(jìn)化分化，說(shuō)明這些基因在大豆中具有重要的生物學(xué)功能。

圖4 大豆COBRA 基因家族基因結(jié)構(gòu)分析

2.5 大豆COBRA 基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

由圖5 可知，大豆COBRA 家族基因包含10 個(gè)保守基序，分別為Motif 1-10。24 個(gè)大豆COBRA家族基因均包含Motif 2 和Motif 6，其中Motif 2保守基序中含有一個(gè)高度保守的CCVS 氨基酸序列。

圖5 大豆COBRA 基因家族蛋白質(zhì)保守基序分析

結(jié)果表明，大豆COBRA 基因家族多樣性與保守基序分布及結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.6 大豆COBRA 基因家族共線性分析

在植物進(jìn)化過(guò)程中，基因復(fù)制和現(xiàn)存基因保留使得植物基因組不斷擴(kuò)大。由圖6 可知，在20 條大豆染色體上，大豆COBRA 家族基因共發(fā)生23 次復(fù)制事件。由基因位置分析可知，GmCOBRA21 是由串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生的，其中GmCOBRA2 基因未發(fā)生基因復(fù)制事件，表明在大豆COBRA 基因擴(kuò)增中，片段復(fù)制比例大于串聯(lián)復(fù)制比例。

圖6 大豆COBRA 基因家族共線性分析

2.7 大豆COBRA 基因家族組織表達(dá)模式分析

由圖7 可知，GmCOBRAs 具有不同表達(dá)模式。例如GmCOBRA7 和GmCOBRA24 在根、莖、葉、花、種子和莢這6 個(gè)器官和組織中均有表達(dá)。GmCOBRA20、GmCOBRA18 和GmCOBRA10在所分析的組織中表達(dá)水平較低。GmCOBRA4、GmCOBRA6 和GmCOBRA13 在種子中高度表達(dá)，表明其在種子發(fā)育中具有重要作用。GmCOBRA14、GmCOBRA1 、GmCOBRA13 、GmCOBRA18 、GmCOBRA7 、GmCOBRA22 、GmCOBRA19 、GmCOBRA2、GmCOBRA16 和GmCOBRA23 在根中高度表達(dá)，表明其在根的伸長(zhǎng)和根毛生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮作用。GmCOBRA12、GmCOBRA22 和GmCOBRA14 在所分析的組織中表達(dá)水平較高，表明這些基因在大豆整個(gè)發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。結(jié)果表明，24 個(gè)GmCOBRAs 至少在一個(gè)組織中表達(dá)，表明COBRA 基因家族在不同大豆組織和器官中均發(fā)揮功能。

圖7 大豆COBRA 基因家族表達(dá)模式分析

基因調(diào)控對(duì)植物再生起關(guān)鍵作用。東農(nóng)50 器官發(fā)生叢生芽誘導(dǎo)和叢生芽伸長(zhǎng)表型圖如圖8 所示。由圖9 可知，6 個(gè)GmCOBRAs 在叢生芽誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)不同時(shí)期存在表達(dá)差異，其中GmCOBRA9、GmCOBRA13 、GmCOBRA4 、GmCOBRA20 和GmCOBRA6 在叢生芽伸長(zhǎng)階段的表達(dá)量較高，GmCOBRA21 在叢生芽誘導(dǎo)和叢生芽伸長(zhǎng)階段顯著表達(dá)。在叢生芽誘導(dǎo)第14 d 和叢生芽伸長(zhǎng)第14 d時(shí)，GmCOBRA21 表達(dá)量顯著上調(diào)。結(jié)果表明，大豆COBRA 基因在大豆再生過(guò)程中發(fā)揮作用。

圖8 東農(nóng)50 器官發(fā)生叢生芽誘導(dǎo)和叢生芽伸長(zhǎng)表型圖

圖9 大豆COBRA 家族基因叢生芽誘導(dǎo)和叢生芽伸長(zhǎng)qRT-PCR 結(jié)果

2.8 GmCOBRA21 基因克隆及亞細(xì)胞定位分析

通過(guò)qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，GmCOBRA21 基因在叢生芽誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)階段的表達(dá)量顯著上升，因此選擇該基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)東農(nóng)50 種子cDNA進(jìn)行克隆，成功獲得預(yù)期大小條帶（見(jiàn)圖10（a）），將回收產(chǎn)物連接至Fu28 入門(mén)載體中，再轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α（見(jiàn)圖10（b））。采用序列比對(duì)過(guò)濾出比對(duì)正確質(zhì)粒，通過(guò)LR 反應(yīng)構(gòu)建pSOYⅠ-GmCOBRA21 表達(dá)載體，最終將pSOYⅠ-GmCOBRA21 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105 中（見(jiàn)圖10（c））。

圖10 GmCOBRA21 基因克隆與PCR 檢測(cè)

pSOYⅠ-GmCOBRA21 載體如圖11（a）所示。隨后，在本氏煙草中瞬時(shí)表達(dá)該載體。通過(guò)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，GmCOBRA21 定位于植物細(xì)胞膜（見(jiàn)圖11（c）），與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖11 pSOYⅠ-GmCOBRA21 載體構(gòu)建及GmCOBRA21 蛋白亞細(xì)胞定位

3 結(jié)論與討論

COBRA 基因是細(xì)胞擴(kuò)增和纖維素合成的關(guān)鍵基因，也是植物特有基因家族[27]。前人已對(duì)擬南芥、玉米和水稻等作物中的COBRA 基因家族進(jìn)行深入研究，但在大豆中的研究較少。本研究中，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系將GmCOBRA 家族基因分為2個(gè)亞族，與擬南芥和玉米的COBRA 基因家族分類(lèi)相似。GmCOBRA 家族基因第Ⅰ亞族成員為7 個(gè)，第Ⅱ亞族成員為17 個(gè)，類(lèi)似于擬南芥COBRA 基因家族，說(shuō)明COBRA 基因在不同作物中的進(jìn)化相似。第Ⅰ亞族COBRA 基因與第Ⅱ亞族COBRA 基因在進(jìn)化上不同，其在N 末端增加了170 個(gè)氨基酸。在基因結(jié)構(gòu)上，第Ⅰ亞族外顯子數(shù)量少于第Ⅱ亞族，結(jié)果與擬南芥相似[9]。本研究中大豆COBRA基因數(shù)量約為擬南芥COBRA 基因的2 倍（見(jiàn)圖3），該基因在大豆基因組的擴(kuò)增源于片段復(fù)制。在已鑒定的24 個(gè)大豆COBRA 基因中，11 個(gè)大豆COBRA基因?yàn)槠涡灾貜?fù)，這一結(jié)果與之前發(fā)現(xiàn)大豆基因組的復(fù)制主要為片段性重復(fù)一致[28-29]。

目前對(duì)于大豆再生基因報(bào)道較少，因此篩選提高大豆再生能力基因?qū)ωS富大豆再生基因網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。COBRA 基因編碼糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，在細(xì)胞壁擴(kuò)張和纖維素沉積中發(fā)揮作用。作為模式植物，擬南芥COBRA 家族基因可廣泛調(diào)節(jié)花、葉片和種子的形態(tài)建成。相關(guān)研究表明，AtCOBRA10 基因突變導(dǎo)致花粉管變短，證實(shí)COBL10 對(duì)花粉管的定向生長(zhǎng)具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本研究中，GmCOBRA13 在種子各發(fā)育時(shí)期均高度表達(dá)，且GmCOBRA13 與AtCOBRA10 在進(jìn)化上高度同源，這也說(shuō)明GmCOBRA13 可能與AtCOBRA10具有相似功能。在大豆胚胎發(fā)育過(guò)程中，纖維素對(duì)細(xì)胞擴(kuò)張起關(guān)鍵作用[30]。本研究中，大豆COBRA基因在種子中表達(dá)，表明其在大豆胚胎發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮功能。Roudier 等[31]研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中COBRA 家族基因通過(guò)參與纖維素的纖維取向?qū)?xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)生重要影響，是植物發(fā)育過(guò)程中發(fā)生異性膨脹的重要因素之一。在擬南芥中，蛋白突變體植株表現(xiàn)為植株矮小、芽變小和根變粗現(xiàn)象[25]。COBRA 基因突變導(dǎo)致擬南芥縱向細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂缺陷癥狀[32]，而植物再生主要與芽和根的生長(zhǎng)有關(guān)。以上現(xiàn)象印證了本試驗(yàn)中qRT-PCR 結(jié)果，即COBRA 基因在叢生芽誘導(dǎo)和叢生芽伸長(zhǎng)時(shí)發(fā)揮作用，在大豆發(fā)育過(guò)程中COBRA 基因可能通過(guò)促進(jìn)根和芽的生長(zhǎng)影響大豆再生功能。

綜上所述，在大豆基因組中共發(fā)現(xiàn)24 個(gè)COBRA 基因，這些基因不均等地分布在大豆的14 條染色體上，其中23 個(gè)GmCOBRA 基因由片段復(fù)制產(chǎn)生，GmCOBRA21 由串聯(lián)復(fù)制產(chǎn)生，表明在GmCOBRA 家族基因擴(kuò)增中，片段復(fù)制比例大于串聯(lián)復(fù)制比例。通過(guò)對(duì)24 個(gè)GmCOBRA 基因的大豆基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可知，GmCOBRA 家族基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段均可表達(dá)并發(fā)揮功能。通過(guò)大豆在叢生芽誘導(dǎo)和叢生芽伸長(zhǎng)階段的qRT-PCR 分析表明，大豆COBRA 家族基因可能參與植物再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中GmCOBRA21 可能為該過(guò)程中的核心基因發(fā)揮關(guān)鍵作用。通過(guò)亞細(xì)胞定位表明GmCOBRA21 定位于細(xì)胞膜。