陳金鳳， 陸小柳， 張曉韻， 唐曦平

1 廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)院， 南寧 530021； 2 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡中心， 南寧 530021

胰腺癌起病隱匿，早期診斷難度大，并且發(fā)展迅速，惡性程度極高。目前為止，在全世界范圍內(nèi)還沒有針對(duì)胰腺癌的具有良好治療效果的藥物，胰腺癌患者的5年生存率尚未得到顯著改善，仍低于10%［1］。由于在早期診斷、預(yù)后、預(yù)測以及新的靶向治療方面缺乏重大突破，胰腺癌的主要治療方式仍為手術(shù)和化療，但只有約10%的患者具有早期手術(shù)的機(jī)會(huì)，因此，篩選胰腺癌早期診斷的分子標(biāo)志物已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)［2］。硫酸乙酰肝素糖蛋白2（HSPG2）是一種細(xì)胞外蛋白聚糖，與腫瘤血管的生成、增殖、分化和侵襲密切相關(guān)，且在多種腫瘤中呈高表達(dá)［3］。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是一系列結(jié)構(gòu)相關(guān)的鋅依賴性內(nèi)肽酶，MMP7作為其中分子量最小的酶，在促進(jìn)腫瘤浸潤和誘導(dǎo)血管生成中起著關(guān)鍵作用［4］。研究［5］顯示，MMP7能夠?qū)erlecan進(jìn)行酶促加工，進(jìn)而共同加速組織侵襲和血管生成。HSPG2在胰腺癌中的表達(dá)以及MMP7與HSPG2在胰腺癌中的關(guān)系尚未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過檢測胰腺癌患者組織和血清中MMP7及HSPG2的表達(dá)，同時(shí)對(duì)收集的患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析，以探討MMP7和HSPG2對(duì)胰腺癌診斷及判斷預(yù)后的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年1月—2020年12月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的，病理檢查證實(shí)為胰腺癌患者30例，其中男16例，女14例，年齡38～87歲。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期16例；高分化4例，中低分化26例。收集30例患者的胰腺癌組織及血清樣本，并收集癌旁組織及30例健康志愿者血清樣本作為對(duì)照。收集相關(guān)臨床資料，隨訪時(shí)間截至2022年12月，回訪采用門診或住院復(fù)查的形式，配合電話隨訪，共隨訪1～39個(gè)月，以患者死亡作為隨訪的終點(diǎn)事件。

1.2 主要試劑及材料 HSPG2和MMP7多克隆抗體購自上海生工生物工程有限公司，免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。MMP7和HSPG2酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫組化法檢測組織中HSPG2和MMP7表達(dá) 收集醫(yī)院石蠟包埋標(biāo)本，切片后常規(guī)脫水脫蠟，進(jìn)行抗原修復(fù)、封閉，依次加入一抗、二抗孵育后DAB顯色，蘇木素染色，最后梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片保存。免疫組化結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法判定陽性。

1.3.2 免疫組化染色評(píng)分 顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行評(píng)分。采用半定量積分法［6］綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比判斷結(jié)果。染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。陽性細(xì)胞百分比：0～5%計(jì)為0分，6%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，＞50%計(jì)為3分。免疫組化評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性細(xì)胞百分比評(píng)分，總分≤4分為陰性，總分＞4分為陽性。

1.3.3 ELISA法檢測血清中HSPG2、MMP7含量取-80 ℃保存的血清樣品解凍，HSPG2和MMP7嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書方法進(jìn)行檢測。酶標(biāo)儀以450 nm波長讀取各孔吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各樣品HSPG2和MMP7含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。MMP7與HSPG2表達(dá)的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。采用Kaplan-Meier法分析MMP7和HSPG2不同表達(dá)情況下的生存率，并繪制生存曲線，生存情況比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP7和HSPG2在胰腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，MMP7和HSPG2表達(dá)均主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，陽性表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)染色呈淡黃色至棕褐色（圖1）。30例胰腺癌患者組織切片中，HSPG2蛋白陽性表達(dá)的有22例（73.33%），在癌旁組織中僅1例陽性表達(dá)（3.33%）；MMP7蛋白陽性表達(dá)的有25例（83.33%），在癌旁組織中僅2例陽性表達(dá)（6.67%）。MMP7、HSPG2蛋白陽性表達(dá)在胰腺癌和癌旁組織中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）（表1）。

表1 MMP7和HSPG2在胰腺癌及癌旁正常組織中的陽性表達(dá)Table 1 Positive expression of MMP7 and HSPG2 in pancreatic cancer and normal adjacent tissues

圖1 胰腺癌組織及癌旁正常組織中MMP7、HSPG2的表達(dá)情況（免疫組化，×200）Figure 1 Expression of MMP7 and HSPG2 in pancreatic cancer tissues and in adjacent cancer normal tissues（immunohistochemistry， ×200）

2.2 MMP7和HSPG2表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 收集患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析，結(jié)果顯示，胰腺癌患者M(jìn)MP7和HSPG2陽性表達(dá)在腫瘤直徑和TNM分期的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）（表2）。

表2 HSPG2和MMP7表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relationship between HSPG2 and MMP7 expression and clinicopathological features of pancreatic cancer

2.3 MMP7和HSPG2表達(dá)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MMP7與HSPG2之間的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.539，P＜0.05）（表3）。

表3 HSPG2和MMP7表達(dá)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of the expression of both HSPG2 and MMP7

2.4 各組血清中MMP7和HSPG2水平比較 胰腺癌患者血清中MMP7、HSPG2水平均高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）（表4）。

表4 各組間血清中MMP7、HSPG2的表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of expression levels of MMP7 and HSPG2 in serum between groups

2.5 MMP7和HSPG2表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結(jié)果顯示MMP7和HSPG2陽性表達(dá)胰腺癌患者的總體生存率低于陰性者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2值分別為4.084、12.554，P值均＜0.05）（圖2）。

圖2 MMP7、HSPG2蛋白表達(dá)與胰腺癌患者生存時(shí)間的關(guān)系Figure 2 Relationship between MMP7 and HSPG2 protein expression and survival time of pancreatic cancer patients

3 討論

胰腺癌侵襲性高，全身轉(zhuǎn)移時(shí)間早，是死亡率最高的腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢［7-8］。分子生物標(biāo)志物已越來越多地被用于協(xié)助診斷腫瘤疾病，鑒于胰腺癌的早期診斷以及治療難度，探索新的生物標(biāo)志物，可為胰腺癌的發(fā)生發(fā)展以及早期確診提供新的理論依據(jù)和研究思路［9］。

MMP7屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，能夠?qū)?xì)胞生長和血管生成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行調(diào)控，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并可作為多種癌癥不良預(yù)后的預(yù)測因素［4］。已有相關(guān)研究表明，MMP7在結(jié)直腸癌［10］、胃癌［11］、乳腺癌［12］和前列腺癌［13］等多種腫瘤中具有顯著的差異表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示，MMP7在胰腺癌組織中的陽性表達(dá)與癌旁正常組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示MMP7可能成為胰腺癌組織病理學(xué)診斷的潛在靶標(biāo)。同時(shí)，本研究對(duì)胰腺癌患者的臨床病理特征進(jìn)行了回顧性分析，發(fā)現(xiàn)MMP7陽性表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期密切相關(guān)，即MMP7在腫瘤直徑較小、分期較早時(shí)已經(jīng)表現(xiàn)為陽性表達(dá)，這可能與MMP7促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長以及血管形成的作用有關(guān)，提示其可能在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

HSPG2，也稱為perlecan，是一種多功能蛋白聚糖，由1個(gè)核心蛋白和3個(gè)長鏈的糖胺聚糖組成，是基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，并參與多種生物活性［14］。HSPG2可影響多種信號(hào)通路，從而發(fā)揮其在機(jī)體內(nèi)的調(diào)控作用，相關(guān)研究［5，15-17］表明，HSPG2可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化，細(xì)胞外基質(zhì)黏附，促進(jìn)血管生成與生長，參與組織發(fā)育和傷口愈合等生物學(xué)過程。Kazanskaya等［15］研究表明，HSPG2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表達(dá)上調(diào)，通過影響腫瘤微環(huán)境來促進(jìn)腫瘤發(fā)育，并與患者的預(yù)后不良和低生存率有關(guān)。但HSPG2在胰腺癌中的研究報(bào)道罕見。本研究結(jié)果顯示，HSPG2在胰腺癌組織中表達(dá)升高（P＜0.05），與腫瘤直徑、TNM分期相關(guān)，且MMP7與HSPG2表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.539，P＜0.05），提示MMP7和HSPG2可能共同參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，但二者間的具體調(diào)控機(jī)制還需分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果還顯示，胰腺癌患者血清中MMP7、HSPG2水平明顯高于健康對(duì)照組，鑒于血清樣本較易獲取，對(duì)患者傷害較小，提示其有望成為早期檢測胰腺癌的潛在標(biāo)志物。生存分析結(jié)果表明，與陰性對(duì)照相比，MMP7和HSPG2陽性表達(dá)的胰腺癌患者的生存時(shí)間明顯降低（P值均＜0.05），提示MMP7和HSPG2陽性表達(dá)對(duì)判斷胰腺癌患者的預(yù)后具有一定的參考價(jià)值。

綜上所述，MMP7和HSPG2在胰腺癌組織中呈陽性表達(dá)，兩者間表達(dá)呈正相關(guān)，在腫瘤直徑較小、TNM分期較早時(shí)即表現(xiàn)為陽性表達(dá)，且陽性表達(dá)患者總生存率更低；此外，MMP7和HSPG2在胰腺癌患者血清中水平升高，有望成為胰腺癌早期診斷和判斷預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

倫理學(xué)聲明：本研究方案經(jīng)由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：LW2023010。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳金鳳負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；陸小柳、張曉韻參與收集數(shù)據(jù)；唐曦平負(fù)責(zé)提供經(jīng)費(fèi)支持，設(shè)計(jì)研究思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。