鐘瑞熙， 杜沅沁， 肖熹煜， 宋文選， 農(nóng)耀斌， 朱榮火， 黃晶晶

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院， 南寧 530299； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃肝病科， 南寧 530299；3 廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南寧 530299

肝性腦病是慢性肝病和急性肝衰竭中常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥，其表現(xiàn)為廣泛的神經(jīng)或精神異常，包括僅能通過(guò)神經(jīng)心理學(xué)或神經(jīng)生理學(xué)評(píng)估檢測(cè)到的輕度認(rèn)知障礙到明顯的定向障礙、意識(shí)模糊和昏迷［1］。乳果糖是肝性腦病的一線治療藥物，但其不良副作用包括嘔吐、腹痛腹瀉、脫水和電解質(zhì)紊亂等，可能導(dǎo)致患者服藥依從性下降［2］。因此迫切需要開(kāi)發(fā)出一種高效且不良副作用小的治療藥物。三黃瀉心湯由大黃、黃芩、黃連3味中草藥組成，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，三黃瀉心湯具有抗炎［3］、抗菌［4］、改善出血癥狀［5］等作用。方中單味藥大黃已被臨床用于灌腸治療肝性腦病，療效可觀［6］。因此，本研究通過(guò)觀察三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠生理病理指標(biāo)的影響，初步探討其對(duì)肝性腦病大鼠腦組織炎性損傷的改善作用及機(jī)制，以期為制訂肝性腦病的中醫(yī)藥臨床用藥治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（桂）2019-0001］。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室溫24 ℃，12 h光照晝夜循環(huán)，空氣流通，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，期間自由飲食飲水。

1.2 藥物與試劑 三黃瀉心湯由大黃12 g，黃芩、黃連各6 g組成，所用“農(nóng)本方”顆粒由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供。引物設(shè)計(jì)及合成（北京擎科生物科技有限公司）；硫代乙酰胺（北京謹(jǐn)明生物科技有限公司，批號(hào)T70013）；TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)ERC102a.96、ERC007.96、ERC003.96）；總蛋白提取試劑高效RIPA裂解液（北京Solarbio科技有限公司，批號(hào)R0010）；總RNA提取試劑trizo（l美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)155960296）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）試劑盒（上海Novabio生物科技有限公司，批號(hào)F2202、F3528）；NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白抗體（美國(guó)Affinity公司，批號(hào)AF2006、AF5006）；β-肌動(dòng)蛋白抗體、山羊抗兔二抗（安徽Biosharp科技有限公司，批號(hào)BL005B、BL003A）。

1.3 主要儀器 全自動(dòng)生化分析儀Thermo Scientific Indiko（美國(guó)ThermoFisher公司）；紫外分光光度計(jì)NanoDrop（美國(guó)ThermoFisher公司）；熒光定量PCR儀qTOWER3G（德國(guó)Analytik Jena公司）；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher公司）；PowerPac Universal電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.4 動(dòng)物模型的制備 C型肝性腦病是指發(fā)生于肝硬化等慢性肝損傷基礎(chǔ)上的肝性腦病。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)［7］采用四氯化碳（CCl4）復(fù)合法構(gòu)建大鼠肝硬化模型：將CCl4、花生油按2∶3比例混合配置成40%CCl4油溶液后于模型大鼠皮下注射，每周2次，持續(xù)9周。首周每次注射5 mL/kg，而后每次注射3 mL/kg。實(shí)驗(yàn)期間搭配5%乙醇溶液自飲。之后采用硫代乙酰胺（TAA）法構(gòu)建肝性腦病大鼠模型［8］：腹腔注射TAA溶液，連續(xù)3 d，1次/d，每次注射300 mg/kg。若大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、嗜睡、昏迷、共濟(jì)失調(diào)、自主活動(dòng)時(shí)間減少現(xiàn)象之一，即為造模成功。實(shí)驗(yàn)期間正常組大鼠正常飲食，造模大鼠造模成功后恢復(fù)正常飲食。

1.5 動(dòng)物分組及給藥劑量 30只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)分為正常組、模型組、乳果糖組、三黃瀉心湯低劑量組和三黃瀉心湯高劑量組，每組各6只。根據(jù)人與大鼠換算公式換算中藥各組劑量，三黃瀉心湯低劑量組含生藥4.37 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量的3.5倍；三黃瀉心湯高劑量組含生藥8.74 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量的7倍；乳果糖組0.167 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量的5.5倍。造模成功后，乳果糖組、三黃瀉心湯低劑量組和高劑量組灌胃給予相應(yīng)藥物；正常組與模型組灌胃給予等體積生理鹽水。給藥持續(xù)7 d。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 大鼠一般狀態(tài)觀察及行為學(xué)檢測(cè) （1）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天觀察并記錄大鼠的身體狀況、精神狀態(tài)、體質(zhì)量、飼料消耗等情況。（2）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。將直徑為1.5 m的黑色圓形水池（水溫19～22 ℃）均等分為4個(gè)象限，每個(gè)象限制作1個(gè)不同的標(biāo)記用于大鼠辨別定位，在某一象限設(shè)置1個(gè)直徑10 cm的平臺(tái)隱匿于水下2 cm處，將水池用遮光布圍起，并在水中添加黑色顏料混勻，水池上方懸掛攝像機(jī)。定位巡航實(shí)驗(yàn)：每天定于固定時(shí)間段訓(xùn)練，訓(xùn)練期持續(xù)5 d。從池壁4個(gè)起始點(diǎn)的任一點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水池。攝像系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間和游泳路徑，4次訓(xùn)練將大鼠分別從4個(gè)象限放入水中。大鼠找到平臺(tái)后或60 s內(nèi)找不到平臺(tái)（潛伏期記為60 s），則由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)到平臺(tái)，在平臺(tái)上休息10 s，再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。每日以大鼠4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為其當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績(jī)。在造模后及給藥后各進(jìn)行一次正式的定位巡航實(shí)驗(yàn)。空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤去平臺(tái)，在原平臺(tái)相對(duì)象限入水點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄其120 s內(nèi)游泳路徑并統(tǒng)計(jì)穿越平臺(tái)次數(shù)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)在給藥后進(jìn)行一次。

1.6.2 標(biāo)本采集及病理切片制作 （1）按照體質(zhì)量比給予大鼠腹腔注射等比例的2%戊巴比妥鈉（0.03 mL/kg）深度麻醉，腹主動(dòng)脈采血；取肝臟組織，截取回盲部后端結(jié)腸約10 cm，于冰上斷頭處死取腦組織，-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＃?）所采部分腦組織、肝臟組織浸入4%多聚甲醛固定液24 h，脫水后石蠟包埋切片，HE染色法染色。切片制作完成后在光學(xué)顯微鏡下觀察（目鏡10×，物鏡20×）。選取目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行拍照，分析。

1.6.3 大鼠血氨及肝功能指標(biāo)測(cè)定 腹主動(dòng)脈取全血后，取適量血液以肝素鈉抗凝，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血氨水平。取適量血液常溫放置30 min后，以4 000 r/min離心10 min，分離上清液，保存于-20 ℃；用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清中ALT、AST水平。

1.6.4 大鼠腸道pH值測(cè)定 準(zhǔn)確稱取結(jié)腸內(nèi)容物重量，并以1∶8的稀釋比例加入去離子水，用小型漩渦混勻器250 r/min混勻5 min，采用pH計(jì)檢測(cè)大鼠腸道pH值。

1.6.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子水平 取適量血液，根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)孔繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算各組大鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.6.6 大鼠腦質(zhì)量及腦組織中含水量測(cè)定 腦組織取出后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗，用濾紙吸干水分，稱重并記錄全腦質(zhì)量（濕重量）。之后稱取一部分腦組織，置于60 ℃烘箱中，72 h后稱其干重量，計(jì)算含水量：含水量＝（腦濕重量-腦干重量）/腦濕重量×100%。

1.6.7 RT-qPCR檢測(cè)大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá) 采用trizol法提取各組大鼠腦組織總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)量；GADPH作為內(nèi)參對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，2-△△Ct分析其表達(dá)水平。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.6.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠腦組織中NF-κB p65及其磷酸化蛋白的表達(dá) 取部分腦組織研磨后加入RIPA裂解液置于冰上裂解提取總蛋白，BCA法檢測(cè)腦組織蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，經(jīng)80 V（0.5 h）、120 V（1 h）恒壓電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液封閉2 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次10 min；加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶4 000）常溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min；超敏發(fā)光液顯影曝光顯像，Image J軟件系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Dunnett’s T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠一般狀態(tài)的影響正常組大鼠精神狀況良好，動(dòng)作敏捷；構(gòu)建大鼠肝性腦病模型后，食欲不振，動(dòng)作遲緩，皮毛發(fā)黃，生長(zhǎng)發(fā)育遲滯，出現(xiàn)脫毛、嗜睡、昏迷等現(xiàn)象，極個(gè)別大鼠甚至共濟(jì)失調(diào)。經(jīng)乳果糖及低、高劑量三黃瀉心湯灌胃治療后，大鼠均出現(xiàn)腹瀉癥狀，其中高劑量組程度較重；藥物灌胃后大鼠食欲逐漸恢復(fù)，脫毛、嗜睡、昏迷現(xiàn)象減少。

2.2 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠肝臟病理學(xué)的影響 正常組大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、正常；模型組肝臟出現(xiàn)組織增生、肝小葉結(jié)構(gòu)模糊、細(xì)胞排列紊亂、變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重等現(xiàn)象；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組肝細(xì)胞變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、組織增生程度均得到改善，其中乳果糖組和三黃瀉心湯高劑量組改善較明顯（圖1）。

圖1 大鼠肝臟病理學(xué)改變（HE染色，×200）Figure 1 Pathological changes of rat liver （HE， ×200）

2.3 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠血氨及肝功能指標(biāo)的影響 與正常組相比，模型組血氨水平及ALT、AST水平顯著增加（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠血氨水平及ALT、AST水平均明顯降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優(yōu)于低劑量組（P值均＜0.05）（表2）。

表2 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠血氨及肝功能的影響Table 2 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on blood ammonia and liver function in rats with hepatic encephalopathy

2.4 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腸道pH的影響與正常組相比，模型組腸道pH值增加（P＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腸道pH值均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優(yōu)于低劑量組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腸道pH的影響Figure 2 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on intestinal pH in rats with hepatic encephalopathy

2.5 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響 與正常組相比，模型組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著增加（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優(yōu)于低劑量組（P值均＜0.05）（表3）。

2.6 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腦部的影響

2.6.1 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腦部病理學(xué)的影響 正常組大鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常完整、細(xì)胞核飽滿。模型組大鼠腦組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂、壞死，細(xì)胞核固縮，胞質(zhì)減少；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦組織細(xì)胞排列紊亂、壞死、細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減輕，結(jié)構(gòu)逐漸完整（圖3）。

圖3 大鼠腦部病理學(xué)改變（HE染色，×200）Figure 3 Pathological changes of rat brain （HE， ×200）

2.6.2 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與正常組相比，模型組大鼠尋臺(tái)潛伏期顯著增加，而穿臺(tái)次數(shù)顯著降低（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠用藥后尋臺(tái)潛伏期及穿臺(tái)次數(shù)均明顯改善（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優(yōu)于低劑量組（P＜0.05）（表4）。

表4 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響Table 4 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on learning and memory ability of rats with hepatic encephalopathy

2.6.3 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腦質(zhì)量、腦組織含水量的影響 與正常組相比，模型組腦質(zhì)量、腦組織含水量均顯著增加（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦質(zhì)量、腦組織含水量均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優(yōu)于低劑量組（P值均＜0.05）（表5）。

表5 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腦質(zhì)量、腦組織含水量的影響Table 5 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on brain mass and brain tissue water content in rats

2.6.4 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)的影響 與正常組相比，模型組腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)均顯著增加（P值均＜0.05）；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優(yōu)于低劑量組（P值均＜0.05）（表6）。

表6 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)的影響Table 6 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on mRNA expression of TNF-α、IL-1 β、 IL-6 on brain tissue of rats with hepatic encephalopathy

2.6.5 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腦組織中NF-κB p65及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響 與正常組相比，模型組腦組織中NF-κB p65磷酸化水平顯著增加；與模型組相比，乳果糖組和三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦組織NF-κB p65磷酸化水平均降低（P值均＜0.05），且三黃瀉心湯高劑量組效果優(yōu)于低劑量組（P值均＜0.05）（圖4）。

圖4 三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腦組織中NF-κB p65及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of Sanhuang Xiexin Decoction on brain tissue of rats with hepatic encephalopathy in NF-κB p65 and its phosphorylated protein expression

3 討論

肝性腦病可分為三類，A型為急性肝衰竭相關(guān)肝性腦病，B型為門(mén)靜脈-體循環(huán)分流相關(guān)肝性腦病，C型為肝硬化相關(guān)肝性腦?。?］。目前研究［10］認(rèn)為，高氨血癥是肝性腦病的主要發(fā)病機(jī)制，而炎癥反應(yīng)、腸道微生態(tài)改變等多種機(jī)制可能共同參與并促進(jìn)了肝性腦病發(fā)展。肝臟是人體最大的解毒器官，肝功能不全會(huì)導(dǎo)致血氨不能經(jīng)尿素循環(huán)有效解毒，同時(shí)門(mén)體分流導(dǎo)致含有氨的門(mén)靜脈血流直接流入體循環(huán)并進(jìn)入腦組織［11］。另一方面，全身炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，從而使氨及炎性因子更易進(jìn)入腦組織，二者的協(xié)同作用導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，引起腦水腫［12］。同時(shí)，腦部積累的氨及炎性因子能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB通路［13］。NF-κB通路的激活則會(huì)介導(dǎo)大量炎性因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯，誘導(dǎo)腦部的炎癥反應(yīng)，加重腦部炎性損傷，引起腦實(shí)質(zhì)改變和腦功能障礙［14-15］。此外，腸道微生態(tài)也與肝性腦病發(fā)病關(guān)系密切。腸道微生態(tài)失衡時(shí)，腸道中的優(yōu)勢(shì)菌生長(zhǎng)被抑制，而內(nèi)源性或外源性致病菌大量增殖［16］；小腸細(xì)菌過(guò)度生長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致腸道屏障完整性受損，促使細(xì)菌易位，釋放氨和內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)并最終使腦部受損［17］。有研究［18］報(bào)道，肝性腦病患者的腸道微生物群相較于健康人群改變較大，潛在致病微生物群的相對(duì)豐度更高，其認(rèn)知能力檢測(cè)和腦部MRI表現(xiàn)也更差，提示腸道微生態(tài)改變可能影響肝性腦病患者大腦功能。以上研究表明，肝性腦病是一種肝、腸、腦等多部位病變，多種機(jī)制協(xié)同致病的疾病，因此，有針對(duì)性的多靶點(diǎn)、多途徑治療手段或可有效改善肝性腦病患者腦部炎性損傷，進(jìn)而對(duì)治療肝性腦病產(chǎn)生積極作用［19］。

中醫(yī)學(xué)并無(wú)“肝性腦病”病名，按其主要癥狀可歸為“昏厥”“厥逆”“肝厥”一類。此病多由濕、痰、瘀、熱諸邪交雜，上蒙清竅，元神失養(yǎng)所致，屬虛實(shí)夾雜之病，治法多清熱解毒，化痰開(kāi)竅，兼以補(bǔ)虛［20］。三黃瀉心湯出自張仲景《金匱要略》，全方由大黃二兩、黃芩一兩、黃連一兩，共3味中草藥組成，功可瀉火解毒，燥濕泄熱［21］。方中大黃、黃連歸肝經(jīng)，黃芩歸膽經(jīng)，清肝熱，解肝毒，可減輕肝臟負(fù)擔(dān)，改善肝臟功能；三藥皆歸大腸經(jīng)，且重用大黃兼能瀉下，可清潔腸道從而減少腸道內(nèi)細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物，并通過(guò)改變腸道微生態(tài)，減少氨的產(chǎn)生，促進(jìn)氨的排出。全方針對(duì)肝性腦病“肝-腸-腦”軸發(fā)病的特點(diǎn)，從肝臟、腸道兩方面著手治療，有效減輕有害物質(zhì)積累對(duì)腦組織的損害，可謂效宏力專。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于模型組，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠肝臟病理切片中肝細(xì)胞變性壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、組織增生程度均得到不同程度改善，ALT、AST水平均顯著降低，表明三黃瀉心湯的使用有助于改善肝性腦病大鼠肝功能；三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠灌服藥物后均出現(xiàn)不同程度腹瀉，且腸道pH值較模型組降低并趨近正常組，產(chǎn)生與乳果糖類似的效果，提示三黃瀉心湯可通過(guò)促進(jìn)排泄及時(shí)清除有害物質(zhì)，重塑腸道微環(huán)境并改變腸道微生態(tài)。以上因素的協(xié)同作用可能是導(dǎo)致三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠血氨水平較模型組明顯降低的重要原因。另一方面，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平也較模型組顯著降低，表明三黃瀉心湯具有抗炎作用［22］。有關(guān)三黃瀉心湯抗炎作用的研究［23］進(jìn)一步表明，其發(fā)揮抗炎作用的有效成分主要是大黃酸、大黃素、黃芩苷、小檗堿等。已有研究［24］證實(shí)，氨與炎性因子在大腦中的積累會(huì)促進(jìn)肝性腦病發(fā)生發(fā)展，并決定其嚴(yán)重程度。而三黃瀉心湯可通過(guò)降低血液中氨與炎性因子水平以減少流向腦部的有害物質(zhì)積累，進(jìn)而減輕腦部的炎性反應(yīng)，這將有助于改善肝性腦病大鼠腦組織炎性損傷。

三黃瀉心湯對(duì)肝性腦病大鼠腦部的改善作用初步表現(xiàn)在：相較于模型組，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠服藥后嗜睡、昏迷等癥狀好轉(zhuǎn)，其腦部病理切片中腦組織細(xì)胞排列紊亂、壞死、細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減輕，結(jié)構(gòu)逐漸完整；在檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠在尋臺(tái)潛伏期與穿臺(tái)次數(shù)方面較模型組明顯改善。對(duì)腦組織的進(jìn)一步檢測(cè)顯示，相較于模型組，三黃瀉心湯低、高劑量組大鼠腦部炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)，以及p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著降低，與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［25］相同。本研究結(jié)果表明三黃瀉心湯可通過(guò)抑制肝性腦病大鼠腦部炎性因子轉(zhuǎn)錄及NF-κB p65磷酸化，有效改善肝性腦病大鼠的腦組織炎性損傷。

綜上，本研究結(jié)果表明三黃瀉心湯能改善肝功能及腸道微環(huán)境，減輕血氨和炎性因子在腦部積累所導(dǎo)致的炎性反應(yīng)，從而有效改善肝性腦病大鼠腦組織炎性損傷，其作用機(jī)制與抑制肝性腦病大鼠腦部炎性因子轉(zhuǎn)錄水平及NF-κB p65磷酸化有關(guān)。本研究初步闡明了三黃瀉心湯治療肝性腦病的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究三黃瀉心湯治療肝性腦病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)于將傳統(tǒng)中醫(yī)藥與科學(xué)技術(shù)相結(jié)合的中醫(yī)藥現(xiàn)代化事業(yè)也具有積極意義。但由于目前三黃瀉心湯治療肝性腦病的效果仍缺乏可靠臨床研究支持，并需要明確不良反應(yīng)與禁忌，故其臨床應(yīng)用和推廣工作仍任重道遠(yuǎn)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2022年4月15日經(jīng)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：DW20220408-054，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：鐘瑞熙負(fù)責(zé)研究的思路設(shè)計(jì)及文章初稿撰寫(xiě)；杜沅沁對(duì)研究數(shù)據(jù)獲取分析解釋過(guò)程有關(guān)鍵貢獻(xiàn)；肖熹煜、宋文選、農(nóng)耀斌、朱榮火參與了研究數(shù)據(jù)的獲取過(guò)程；黃晶晶負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫(xiě)、修改文章及提供研究經(jīng)費(fèi)支持。