李雪,朱沛,陳其云,舒相華,高林,袁紅,王位,姚俊*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650201;2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650224;3.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南 玉溪 653106; 4.西南林業(yè)大學(xué),云南 昆明 650224)

多殺性巴氏桿菌是一種通過接觸口鼻分泌物進(jìn)行傳播,以呼吸道感染為臨床癥狀的一種病原,能感染包括禽、豬、牛、兔等在內(nèi)的多種動(dòng)物[1]。其中,豬肺疫是由豬多殺性巴氏桿菌引發(fā)的疾病[2]。目前,該病已遍布養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國(guó)家,據(jù)報(bào)道,世界豬群約有25%～50%受感染[3]。該病已在我國(guó)不同省(市、區(qū))發(fā)生和流行,其危害日趨嚴(yán)重。

2022年2月,云南省玉溪市江川區(qū)某規(guī)模豬場(chǎng)的保育豬出現(xiàn)口鼻流涕、呼吸困難、張口呼吸及呈犬坐式張口呼吸等臨床表現(xiàn),少數(shù)豬只急性死亡。病死豬只剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟腫大、有明顯出血,氣管和支氣管分泌物增多,胸腔及肺門淋巴結(jié)腫大、出血,喉頭水腫等臨床癥狀,疑似多殺性巴氏桿菌感染。在排除了豬重要病毒性傳染病后,為確診該病豬是否是多殺性巴氏桿菌感染,無菌采集病死豬只的內(nèi)臟器官及組織進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)和鑒定。對(duì)分離菌株進(jìn)行生化及藥敏鑒定、16S rRNA序列分析,隨后采用PCR方法對(duì)細(xì)菌的莢膜進(jìn)行分型,并對(duì)分離菌株的致病力進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠致病性試驗(yàn),最終確診該病是由A型多殺性巴氏桿菌感染發(fā)病,此次分離菌株命名為A型多殺性巴氏桿菌PMJC-1株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病死豬只內(nèi)臟器官及組織病料無菌采集自玉溪市江川區(qū)某規(guī)模豬場(chǎng)。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、細(xì)菌革蘭氏染色劑、氧化酶試劑及OF試劑均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;新生犢牛血清購(gòu)自上海愛必信生物科技有限公司;分子生物學(xué)試劑購(gòu)自美基生物有限公司;細(xì)菌生化鑒定試劑條API 20ETM及藥敏試劑條ATB VET購(gòu)自法國(guó)梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1豬常見病原學(xué)檢測(cè)

對(duì)送檢樣品組織提取病毒核酸,利用云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已建立的檢測(cè)方法進(jìn)行豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、藍(lán)耳病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒等豬常見病原學(xué)檢測(cè),非洲豬瘟病原檢測(cè)送至第三方檢測(cè)。

1.2.2細(xì)菌分離與純化

無菌采集到發(fā)病豬只淋巴結(jié),涂抹接種于含3%犢牛血清的LB培養(yǎng)板,并在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h,通過觀察分離培養(yǎng)的菌落形態(tài),選取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢鑒定[4]。挑取單菌落接種進(jìn)行純化培養(yǎng),直至菌落結(jié)構(gòu)形態(tài)以及菌落的色澤均一即可進(jìn)行下一步。

1.2.3生化試驗(yàn)

按API 20ETM的生化鑒定條說明書將純化好的部分菌落挑取到0.85%生理鹽水中稀釋至1MCF(麥?zhǔn)蠞岫葐挝?,將稀釋的菌液加入到生化試劑條,37℃培養(yǎng)箱中孵育24h,若結(jié)果中陽性大于3個(gè),則可以讀板,否則繼續(xù)孵育12h后再讀板。同時(shí)對(duì)該菌進(jìn)行氧化酶(OX)實(shí)驗(yàn)和葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(OF)。按照氧化酶試劑說明書將氧化酶試劑滴在試紙上,待試紙濕潤(rùn)后用接種環(huán)挑取菌落至試紙上后30s內(nèi)讀取結(jié)果。按照OF試劑說明書將純化好的菌落接種到生理鹽水中稀釋至1MCF(麥?zhǔn)蠞岫葐挝?,將稀釋的菌液加入OF試劑安瓿瓶,37℃培養(yǎng)箱中孵育24h后觀察顏色變化。

1.2.4細(xì)菌基因組DNA提取

用高溫滅菌后的接種針刮取純化后的菌落,加入含PBS溶液的無菌離心管中混勻制得懸濁液,按美基生物有限公司的細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書中革蘭氏陰性菌DNA的提取方法提取DNA,提取完成后放置在-20℃冰箱中保存,用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增試驗(yàn)[5]。

1.2.5設(shè)計(jì)引物

在NCBI獲取該菌的全基因序列,并設(shè)計(jì)出相對(duì)應(yīng)的特異性引物。Pm-plpE-R:5′-TAATTGTGCTTGGTGACTT-3′,Pm-plpE-F:5′-ATGAAA-CAAATCGTTTTAAA-3′,引物大小為1011bp,按95℃ 5min;95℃ 40s,50℃ 1min,72℃ 1min,35個(gè)循環(huán);72℃ 10min。根據(jù)文獻(xiàn)[6-8]合成16S通用引物,莢膜血清型(引物信息及退火溫度見表1)及文獻(xiàn)[9,10]毒力基因合成特異引物(引物信息及退火溫度見表2)。送擎科生物試劑公司合成引物。

表1 莢膜分型鑒定引物信息

表2 毒力基因鑒定引物信息

1.2.616SrRNA的PCR檢測(cè)與測(cè)序

將細(xì)菌核酸進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增,預(yù)擴(kuò)增片段長(zhǎng)1492bp。將PCR產(chǎn)物送擎科生物有限公司測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.2.7細(xì)菌莢膜血清型測(cè)定及毒力基因測(cè)定

利用PCR對(duì)分離得到的細(xì)菌進(jìn)行種屬莢膜血清分型鑒定,提取該細(xì)菌基因組DNA作為模板,在40μL反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master Mix 22μL,細(xì)菌核酸4 μL,上、下游引物各2μL,無菌水12μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min后在94℃ 1min,56℃ 1min,72℃ 80s條件下擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);然后72℃延伸10min[11]。其產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并掃描成像。

1.2.8細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)

按法國(guó)梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司藥敏試驗(yàn)說明書將分離純化培養(yǎng)的細(xì)菌接種于藥敏試劑條ATB VET上,37 ℃培養(yǎng)24 h后讀取結(jié)果[12]。

1.2.9動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)

將12只實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組,其中8只為實(shí)驗(yàn)組,4只為對(duì)照組。試驗(yàn)組腹腔注射0.1mL(濃度為5MCF)菌液,對(duì)照組腹腔注射相同劑量的滅菌生理鹽水。隔離飼養(yǎng)72h,觀察該細(xì)菌對(duì)小鼠的致病力。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬常見病原檢測(cè)結(jié)果

豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、藍(lán)耳病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、非洲豬瘟病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與革蘭氏染色鏡檢

分離得到的菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈現(xiàn)為表面光滑濕潤(rùn)、微凸半透明狀。將分離純化的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性細(xì)菌,細(xì)菌呈短桿狀。

2.3 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示該細(xì)菌能發(fā)酵果糖、甘露醇,不發(fā)酵乳糖、鼠李糖、葡萄糖和麥芽糖;吲哚試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陽性,MR與V-P試驗(yàn)為陰性。鑒定結(jié)果根據(jù)數(shù)值編碼數(shù)據(jù)庫(kù)(v4.1)獲得編碼為0040524,鑒定為多殺性巴氏桿菌。結(jié)果見表3。生化補(bǔ)充試驗(yàn)結(jié)果表明該菌的氧化酶實(shí)驗(yàn)(OX試驗(yàn))為陽性,OF實(shí)驗(yàn)表明該菌為發(fā)酵型細(xì)菌,符合巴氏桿菌的生物化學(xué)特征。

表3 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

2.4 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn),左側(cè)細(xì)菌16S通用引物擴(kuò)增的目的片段大小為1492bp,右側(cè)多殺性巴氏桿菌特異引物擴(kuò)增的DNA片段大小為1011bp,進(jìn)行下一步的試驗(yàn)分析。見圖1。

注:從左至右為2000bp DNAmaker、陰性對(duì)照、16S陽性對(duì)照、樣品核酸、2000bp DNAmaker、陰性對(duì)照、巴氏桿菌陽性對(duì)照、樣品核酸、2000bp DNAmaker。

2.5 16S rRNA測(cè)序及同源性分析

將PCR產(chǎn)物送去測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與GenBank上公布的豬多殺性巴氏桿菌序列進(jìn)行同源性比較分析,發(fā)現(xiàn)本研究中分離得到的致病病原DNA序列與GenBank中豬多殺性巴氏桿菌的基因序列的同源性高達(dá)99%,說明此次試驗(yàn)中所獲取的致病菌為多殺性巴氏桿菌,命名為PMJC-1。

2.6 莢膜血清型及毒力基因檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果顯示,預(yù)擴(kuò)增片段大小與莢膜A型相符,證明試驗(yàn)中分離的多殺性巴氏桿菌為莢膜A型多殺性巴氏桿菌,結(jié)果見圖2。毒力基因鑒定結(jié)果表明,多殺性巴氏桿菌具有黏附素(ptfA、hsf-1、hsf-2、pfhA)、超氧化物歧化酶(sodA、sodC)、唾液酸酶(nanH)、外膜蛋白(ompA、ompH、plpB)、透明質(zhì)酸酶 (pmHAS)和鐵攝取(exbB、exbD、tonB、fur)的相關(guān)毒力因子,結(jié)果見圖3。

注:從左至右依次為2000bp Maker、血清A型、 血清B型、血清D型、血清E型、血清F型、2000bp Maker。

注:從左至右依次為2000bp Maker,1-15分別為ptfA、hsf-1、hsf-2、pfhA、exbB、exbD、tonB、sodA、sodC、pmHAS、fur、ompA、ompH、plpB、nanH,2000bp Maker。

2.7 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)顯示該菌對(duì)阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢哌酮、大觀霉素、呋喃妥因、利福平等6種藥物敏感,在臨床治療中,可用這幾種藥物對(duì)該豬場(chǎng)進(jìn)行有效治療,結(jié)果見表4。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.8 動(dòng)物致病結(jié)果

8只實(shí)驗(yàn)組昆明小鼠在48h內(nèi)死亡5只,對(duì)死亡小鼠剖檢后可見肝臟腫大、出血,腸鼓氣,其余3只腹瀉、精神萎靡,4只對(duì)照組昆明小鼠均臨床表現(xiàn)正常。用接種針無菌穿刺死亡小鼠肝、腎臟組織后劃線培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)菌回收,經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)菌生化實(shí)驗(yàn)及特異引物擴(kuò)增均成功驗(yàn)證回收到目的菌株。

3 討論

多殺性巴氏桿菌莢膜血清型分為五種,各血清型之間的交叉保護(hù)率差異較大。莢膜是分泌至菌體外的一類以多糖或多肽為主的物質(zhì)[13],在細(xì)菌—宿主致病過程中能夠促進(jìn)巴氏桿菌的細(xì)胞黏附能力的作用。而且,莢膜是躲避中性粒細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞吞噬作用的重要免疫逃避因子[14]。不同莢膜血清型中莢膜的主要成分不同,其作用也不同,比如A型莢膜的主要成分為透明質(zhì)酸,而D型莢膜的主要成分則為肝素;根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15],它們都有增強(qiáng)細(xì)菌的耐干燥能力,抵抗外界環(huán)境的脫水作用。此前,有大量研究報(bào)道,目前豬群中主要流行的為A型,引起患病豬只出現(xiàn)呼吸困難、打噴嚏、咳嗽、流鼻涕,病死豬肺臟有出血點(diǎn)、氣管中有大量泡沫。例如,胡璇等[16]從貴州畢節(jié)某育肥豬場(chǎng)分離到的巴氏桿菌為A型,張瑞華等[11]也從青島某香豬場(chǎng)病死豬上分離到了三株莢膜A型巴氏桿菌。本實(shí)驗(yàn)分離到的多殺性巴氏桿菌為A型,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致。

巴氏桿菌在宿主體內(nèi)存活、繁殖、致病的關(guān)鍵所在是毒力因子,其作用主要體現(xiàn)在該菌的致病性、在宿主體內(nèi)的存活和繁殖能力上,該菌毒力因子眾多,目前已被證實(shí)與多殺性巴氏桿菌致病性密切相關(guān)的毒力因子包括莢膜、脂多糖、鐵代謝相關(guān)蛋白等[17]。諸多細(xì)菌的毒性作用已經(jīng)被證實(shí)與Pm的結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附、定殖、入侵等過程有關(guān),多種細(xì)菌毒力因子被認(rèn)為是疫苗開發(fā)中的潛在靶抗原,因其具有良好的免疫保護(hù)作用,因此可作為預(yù)防和治療多殺性巴氏桿菌病的新型疫苗候選靶標(biāo),而有些細(xì)菌毒力因子的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究開發(fā)[18]?；谶@些毒力因子的研究報(bào)道,有助于業(yè)內(nèi)人士完善多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)理并促進(jìn)相關(guān)疫苗的研制。本實(shí)驗(yàn)的毒力基因結(jié)果表明,分離到的多殺性巴氏桿菌含有黏附素、超氧化物歧化酶、唾液酸酶、鐵攝取等毒力因子,這與尹媛媛的報(bào)道一致[19]。

根據(jù)毒力基因的結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)分離到的多殺性巴氏桿菌對(duì)小鼠的致病性進(jìn)行了探索。結(jié)果表明,腹腔注射5個(gè)麥?zhǔn)蠞舛?MCF)的多殺性巴氏桿菌懸液1mL可以引起小鼠肝臟出血,小腸腸道充氣,呈透明膠凍樣,證明該菌株具有一定的致病力。姜軒等[20]分離到的多殺性巴氏桿菌感染小鼠也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。

對(duì)此次江川區(qū)豬場(chǎng)發(fā)病原因進(jìn)行篩查,排除豬重要病毒性傳染病的病因,確診引發(fā)豬場(chǎng)豬只死亡是原發(fā)性A型多殺性巴氏桿菌導(dǎo)致,可見A型多殺性巴氏桿菌的致病性不可小覷。近年來,越來越多的細(xì)菌對(duì)常用抗生素表現(xiàn)出耐藥,這給養(yǎng)殖場(chǎng)細(xì)菌病的防治帶來了挑戰(zhàn)。本研究對(duì)分離到的多殺性巴氏桿菌的耐藥性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)該菌株僅對(duì)阿莫西林、頭孢噻吩、頭孢哌酮、大觀霉素、呋喃妥因、利福平6種藥物敏感,對(duì)磺胺甲惡唑等18種藥物耐藥。

4 結(jié)論

本次江川區(qū)豬場(chǎng)發(fā)病,豬只大部分急性死亡的原因經(jīng)試驗(yàn)證明為A型多殺性巴氏桿菌導(dǎo)致的。本實(shí)驗(yàn)用該豬場(chǎng)病死豬只的淋巴結(jié)進(jìn)行細(xì)菌的分離和培養(yǎng),采用細(xì)菌生化方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定,初步證明該菌為豬多殺性巴氏桿菌。采用PCR方法對(duì)細(xì)菌的莢膜進(jìn)行分型,采用細(xì)菌藥敏試驗(yàn)方法對(duì)所分離細(xì)菌的耐藥性和耐藥基因進(jìn)行了研究,并對(duì)該菌株的致病力進(jìn)行研究,旨在為該豬場(chǎng)巴氏桿菌病的治療和防控提供建議。