洪奕倫,王建豐,張 進(jìn)

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿科,上海 200127)

2016年世界衛(wèi)生組織的腎臟腫瘤分類首次提出了遺傳性平滑肌瘤病及腎細(xì)胞癌綜合征(hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma,HLRCC)相關(guān)性腎癌這一分類,HLRCC是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病,由延胡索酸水合酶 (fumarate hydratase,FH)基因胚系突變所致[1-2],臨床特征表現(xiàn)為多發(fā)的皮膚平滑肌瘤、女性多發(fā)子宮肌瘤及早發(fā)的侵襲性腎癌[3]。由于HLRCC相關(guān)性腎癌與FH基因體系突變腎癌均具有侵襲性高、預(yù)后差等生物學(xué)行為,2022年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)腎臟腫瘤分類第五版[4]將二者統(tǒng)稱為FH缺陷型腎癌。目前對(duì)于FH缺陷型腎癌尚無(wú)有效根治手段,且對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移患者也無(wú)統(tǒng)一治療方案。本文通過(guò)RNA-seq、RT-qPCR及免疫組化染色等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)在FH缺陷型腎癌中高表達(dá),且LDHA抑制劑[(R)-GNE-140]處理FH缺陷型腎癌細(xì)胞具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用,因此我們提出了抑制LDHA是FH缺陷型腎癌潛在治療方式的假設(shè)。然而,目前尚無(wú)LDHA抑制劑及其聯(lián)合腎癌靶向藥物應(yīng)用于FH缺陷型腎癌的相關(guān)性研究,故本文將探索LDHA抑制劑及其聯(lián)合靶向藥物在FH缺陷型腎癌細(xì)胞中的作用,為FH缺陷型腎癌新的治療方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262和CL19按既往文獻(xiàn)報(bào)道方法培養(yǎng)[5]。體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、谷氨酰胺、丙酮酸及DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。組織標(biāo)本取自上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科2016—2019年間進(jìn)行腎癌手術(shù)的患者(研究通過(guò)仁濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書(shū)),2例男性,4例女性,年齡19～71歲,平均年齡45歲,腎癌臨床分期采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)分期第8版,Ⅰ期2例,Ⅱ期1例,Ⅲ期3例,其中3例經(jīng)病理及基因檢測(cè)確診為FH缺陷型腎癌,3例為Ⅱ型乳頭狀腎癌(FH缺陷型腎癌最常見(jiàn)的病理類型為乳頭狀Ⅱ型),取癌組織及癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)分析。HiScript?Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司,LDHA抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;(R)-GNE-140、卡博替尼購(gòu)自美國(guó)MCE公司,阿昔替尼、舒尼替尼、索拉非尼、培唑帕尼、依維莫司購(gòu)自美國(guó)Selleck公司,磺酰羅丹明B購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1FH缺陷型腎癌組織RNA-seq測(cè)序 RNA高通量測(cè)序由北京邁基諾基因科技公司(中國(guó))進(jìn)行檢測(cè)。首先用Trizol試劑從組織中提取總RNA,并使用Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀測(cè)量所得RNA的完整性和總量。使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行RNA文庫(kù)構(gòu)建,后用Illumina NovaSeq 6000進(jìn)行測(cè)序,并產(chǎn)生150 bp配對(duì)末端讀數(shù)。測(cè)序片段被高通量測(cè)序儀測(cè)得,圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA 堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(reads),使用HISAT2 (v2.0.5) 將配對(duì)末端clean reads 與參照基因組比,Feature Counts(1.5.0-p3)用于計(jì)算映射到每個(gè)基因的讀數(shù),使用DESeq2 軟件(1.20.0)進(jìn)行兩個(gè)比較組合之間的差異表達(dá)分析。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FH缺陷型腎癌組織LDHA mRNA表達(dá) 由于FH缺陷型腎癌組織樣本數(shù)量有限,取上述FH缺陷型腎癌和Ⅱ型乳頭狀腎癌組織及癌旁組織各2例,采用Trizol法研磨提取組織總RNA,HiScript? Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并以cDNA為模板采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,南京諾唯贊生物科技公司)檢測(cè)LDHA mRNA的表達(dá)水平。LDHA以β-actin作為內(nèi)參,引物均由上海派諾森生物科技公司合成,LDHA的正向引物5′-GGTTGGTGCTGTTGGCATGG-3′,反向引物5′-TGCCCCAGCCGTGATAATGA-3′;β-actin的正向引物5′-TCCTATGTGGGCGACGAG-3′,反向引物：5′-ATGGCTGGGGTGTTGAAG-3′。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照,采用2-△△Ct方法檢測(cè)LDHA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3FH缺陷型腎癌組織LDHA免疫組織化學(xué)染色 將1.2.2中的2例FH缺陷型腎癌組織及1例正常腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋及組織切片,經(jīng)過(guò)切片水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶消除、抗原封閉步驟后,再使用LDHA一抗和二抗孵育、DAB顯色和蘇木精復(fù)染以檢測(cè)FH缺陷型腎癌組織切片中LDHA基因的蛋白表達(dá)情況。

1.2.4FH缺陷型腎癌細(xì)胞株功能實(shí)驗(yàn) 使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng),消化、離心后加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔90 μL種于96孔板中,其中UOK262細(xì)胞5 000個(gè)/孔,CL19細(xì)胞3 000個(gè)/孔,12 h后細(xì)胞完全貼壁后加入藥物。藥物包括LDHA抑制劑(R)-GNE-140,上市靶向藥物6種(阿昔替尼、卡博替尼、舒尼替尼、索拉非尼、培唑帕尼、依維莫司),藥物母液濃度為10 mmol/L,LDHA抑制劑首濃度100 μmol/L,靶向藥物首濃度為10 μmol/L(依維莫司為1 μmol/L),以2倍梯度稀釋(依維莫司為10倍梯度稀釋)藥物,6個(gè)梯度配置藥物,用排槍每孔加入10 μL不同濃度的藥物,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)副孔,對(duì)照孔加入等量的生理鹽水,混勻后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育72 h。

根據(jù)單藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用0.5 μmol/L阿昔替尼、0.5 μmol/L索拉非尼、0.01 μmol/L依維莫司、5 μmol/L卡博替尼、10 μmol/L培唑帕尼、3 μmol/L舒尼替尼與LDHA抑制劑進(jìn)行初步聯(lián)用,LDHA抑制劑初始濃度為20 μmol/L,2倍梯度稀釋藥物設(shè)置6個(gè)梯度。進(jìn)一步根據(jù)LDHA抑制劑與靶向藥物單濃度聯(lián)合用藥結(jié)果,對(duì)LDHA抑制劑與卡博替尼、索拉非尼、培唑帕尼分別各進(jìn)行10∶1、1∶1、1∶10等比例濃度聯(lián)用,初始濃度為20 μmol/L或2 μmol/L,2倍梯度濃度稀釋藥物5個(gè)梯度配置藥物,加藥混勻后放于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育72 h。

72 h后用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B,SRB)比色法染色：首先每孔加100 μL 4 ℃預(yù)冷10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA),4 ℃冰箱固定1 h,用去離子水洗板5遍,室溫晾干。后加SRB染液染色30 min,然后用1%冰醋酸沖洗96孔板,室溫晾干。最后每孔加100 μL非緩沖Tris-base堿液,用酶標(biāo)儀以560 nm波長(zhǎng),空白孔調(diào)零,檢測(cè)96孔板吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞抑制率并繪制抑制率曲線。

1.2.5藥物聯(lián)合指數(shù)計(jì)算 SRB法檢測(cè)LDHA抑制劑單獨(dú)用藥及LDHA抑制劑聯(lián)合靶向藥物用藥對(duì)FH缺陷型腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率,并將計(jì)算得到的存活率用聯(lián)合用藥軟件CompuSyn分析處理,計(jì)算最佳藥物聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)。CI<1提示兩藥存在協(xié)同作用,CI>1提示兩藥存在拮抗作用。

2 結(jié) 果

2.1 RNA-seq、RT-qPCR及免疫組化染色結(jié)果FH缺陷型腎癌組織RNA表達(dá)情況測(cè)序分析結(jié)果顯示,在FH缺陷型腎癌組織中LDHA的表達(dá)高于癌旁組織的表達(dá)(P=0.045),且顯著高于Ⅱ型乳頭狀腎癌組織(P=0.020)及其癌旁組織(P=0.041)中的表達(dá)(圖1A)。

A：RNA-seq結(jié)果顯示FH缺陷型腎癌組織中LDHA的表達(dá)顯著升高;B：RT-qPCR結(jié)果顯示FH缺陷型腎癌組織中LDHA mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高。

采用RT-qPCR對(duì)FH缺陷型腎癌組織中LDHA表達(dá)情況進(jìn)一步驗(yàn)證,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,FH缺陷型腎癌組織中LDHA mRNA的相對(duì)表達(dá)量(3.42±0.24、4.92±0.39),Ⅱ型乳頭狀腎癌組織中為(0.51±0.03、0.53±0.02),FH缺陷型腎癌組織中LDHA mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于Ⅱ型乳頭狀腎癌及癌旁組織(P<0.001,圖1B)。我們進(jìn)一步利用免疫組化染色對(duì)FH缺陷型腎癌組織中LDHA的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示FH缺陷型腎癌組織中LDHA染色呈強(qiáng)陽(yáng)性,而正常腎臟組織呈弱陽(yáng)性(圖2),進(jìn)一步證實(shí)了FH缺陷型腎癌組織中LDHA蛋白表達(dá)上調(diào)。上述RNA-seq、RT-qPCR及免疫組化染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均驗(yàn)證了FH缺陷型腎癌組織中LDHA的高表達(dá),提示LDHA可能在FH缺陷型腎癌中發(fā)揮重要作用。

A：FH缺陷型腎癌組織-1;B：FH缺陷型腎癌組織-2;C：正常腎組織。

2.2 LDHA抑制劑及靶向藥物對(duì)FH缺陷型腎癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用我們應(yīng)用LDHA抑制劑(R)-GNE-140及腎癌上市靶向藥物處理FH缺陷型腎癌細(xì)胞。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LDHA抑制劑(R)-GNE-140可有效抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262和CL19的增殖(圖3A),其IC50分別為49.35 μmol/L和52.44 μmol/L。而在靶向藥物組中,我們發(fā)現(xiàn)卡博替尼、索拉非尼及舒尼替尼對(duì)UOK262和CL19細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用。在CL19組中,各靶向藥物IC50分別為舒尼替尼6.37 μmol/L、卡博替尼8.26 μmol/L、索拉非尼11.28 μmol/L;而在UOK262組IC50分別為舒尼替尼6.59 μmol/L、卡博替尼7.75 μmol/L、索拉非尼1.143 μmol/L(圖3B、C)。單藥實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,LDHA抑制劑及靶向藥物卡博替尼、索拉非尼及舒尼替尼對(duì)UOK262和CL19細(xì)胞增殖均有明顯抑制作用。

A：LDHA抑制劑顯著抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262和CL19的增殖;B：靶向藥物對(duì)FH缺陷型腎癌細(xì)胞CL19增殖的抑制作用;C：靶向藥物對(duì)FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262增殖的抑制作用。

2.3 LDHA抑制劑分別與靶向藥物聯(lián)合用藥對(duì)FH缺陷型腎癌細(xì)胞增殖具有抑制作用在LDHA抑制劑與6種靶向藥物單濃度聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LDHA抑制劑(R)-GNE-140和靶向藥物(卡博替尼、培唑帕尼、索拉非尼)單濃度聯(lián)用結(jié)果提示藥物聯(lián)用能進(jìn)一步抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞UOK262和CL19的增殖。在CL19和UOK262細(xì)胞中20 μmol/L和10 μmol/L的LDHA抑制劑與3種單濃度靶向藥物聯(lián)用具有明顯的細(xì)胞抑制作用(圖4A、B)。

A：CL19細(xì)胞中20 μmol/L LDHA抑制劑(R)-GNE-140和靶向藥物(卡博替尼、培唑帕尼、索拉非尼)單濃度聯(lián)用顯著增強(qiáng)了細(xì)胞增殖的抑制作用;B：UOK262細(xì)胞中10 μmol/L LDHA抑制劑(R)-GNE-140和靶向藥物(卡博替尼、培唑帕尼、索拉非尼)單濃度聯(lián)用顯著增強(qiáng)了細(xì)胞增殖的抑制作用;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

進(jìn)一步將LDHA抑制劑與靶向藥物(卡博替尼、培唑帕尼、索拉非尼)等比例濃度梯度聯(lián)合用藥結(jié)果表明,CL19細(xì)胞中LDHA抑制劑與靶向藥物卡博替尼、培唑帕尼以及索拉非尼在10∶1、1∶10及10∶1的等比例濃度梯度聯(lián)用下CI<1,提示兩藥有協(xié)同作用,且CI值越小表明協(xié)同作用越強(qiáng)(圖5A～F),而兩藥在2∶20或20∶2的濃度下由于單藥的增殖抑制作用強(qiáng)出現(xiàn)拮抗作用(CI>1)。

3 討 論

FH缺陷型腎細(xì)胞癌是一種罕見(jiàn)的高度惡性腎細(xì)胞癌,發(fā)病率尚不明確。FH缺陷型腎細(xì)胞癌可由延胡索酸水合酶胚系或體系突變所致,其中最常見(jiàn)的是由胚系突變所致的一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳性疾病——HLRCC[3]。法國(guó)學(xué)者M(jìn)ULLER等[6]對(duì)全法國(guó)2004-2016年間來(lái)自114個(gè)家庭的182例HLRCC患者展開(kāi)了追蹤研究,發(fā)現(xiàn)19%的患者有腎細(xì)胞癌史,且其中82%的患者在確診時(shí)即已轉(zhuǎn)移或在3年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中位生存期僅為18個(gè)月。另一項(xiàng)研究顯示[7],FH缺陷型腎癌患者初診時(shí)57%為T3～4期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移占52%,遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移占19%,中位隨訪17.5個(gè)月(1～114個(gè)月),39%患者死亡、26%患者疾病進(jìn)展。FH缺陷型腎癌發(fā)病年齡早(據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道最小的腎癌患者僅7歲[8]),影像學(xué)表現(xiàn)不典型及病理形態(tài)多變使得臨床診斷變得困難,且由于其侵襲性高,易早期出現(xiàn)淋巴結(jié)及骨等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,但目前缺乏有效的治療方案。因此,對(duì)于FH缺陷型腎癌,新治療靶點(diǎn)的探索十分重要。

Warburg效應(yīng)是腫瘤細(xì)胞能量代謝的重要特征,即在氧氣含量正常的條件下,腫瘤細(xì)胞中通過(guò)糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸并產(chǎn)生三磷酸腺苷,從而滿足腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)增殖的能量需求。LDHA是細(xì)胞糖酵解中的關(guān)鍵限速酶,是調(diào)控乳酸代謝的重要靶點(diǎn)。在缺氧條件下腫瘤細(xì)胞中LDH催化丙酮酸生成乳酸并產(chǎn)生氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,提升糖酵解水平,使細(xì)胞外pH值下降,產(chǎn)生的乳酸又可被腫瘤細(xì)胞攝取進(jìn)而參與供能[9-10]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)LDHA在多種腫瘤中如前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、口腔鱗癌等中表達(dá)升高[11-14],且與這些惡性腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。腫瘤中如c-Myc、HIF-1α、CREB、熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat-shock factor 1,HSF1)、叉頭蛋白 M1 (forkhead box protein M1,FOXM1)等轉(zhuǎn)錄因子能夠上調(diào)LDHA的轉(zhuǎn)錄水平[15],從而激活有氧糖酵解。乳酸能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞免疫代謝,影響細(xì)胞中干擾素(interferon,IFN)的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤區(qū)域的免疫抑制[16]。乳酸的增多引起蛋白酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解,通過(guò)引起血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的釋放參與血管生成,驅(qū)動(dòng)腫瘤的轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散[17]。

FH缺陷型腎癌中,FH基因的突變導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化的受損,導(dǎo)致細(xì)胞的假性缺氧,供能更依賴于糖酵解。延胡索酸是一種競(jìng)爭(zhēng)性抑制脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase,PHD)的腫瘤代謝物,破壞了HIF1α和HIF2α的羥基化[18],細(xì)胞內(nèi)HIF水平的升高改變了一些蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子(如GLUT1、NRF2和AMPK)的活性,HIF下游的LDHA、VEGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor,PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)基因激活,從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[19],相關(guān)研究也進(jìn)一步佐證了FH缺陷型腎癌組織中LDHA的高表達(dá)是由于延胡索酸積累引起的HIF-1α途徑激活所致[20-21]。因此,LDHA可能為FH缺陷型腎癌的潛在治療靶點(diǎn)。本研究通過(guò)RNA-seq、qPCR及免疫組化的結(jié)果證實(shí)了FH缺陷型腎癌組織中LDHA的高表達(dá)。為探索LDHA抑制劑和腎癌靶向藥物在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)FH缺陷型腎癌細(xì)胞增殖的影響,我們通過(guò)單藥的實(shí)驗(yàn)表明LDHA抑制劑及靶向藥物卡博替尼、索拉非尼、舒尼替尼對(duì)FH缺陷型腎癌細(xì)胞的增殖有顯著抑制作用。且進(jìn)一步的藥物聯(lián)用實(shí)驗(yàn)表明卡博替尼、培唑帕尼及索拉非尼與LDHA抑制劑聯(lián)合用藥有協(xié)同抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞增殖作用,提示LDHA抑制劑與腎癌靶向藥物聯(lián)合用藥可能為FH缺陷型腎癌的潛在治療方案。

綜上所述,本研究證明了LDHA在FH缺陷型腎癌中呈現(xiàn)高表達(dá),LHDA抑制劑能夠抑制FH缺陷型腎癌細(xì)胞的增殖,且聯(lián)合靶向藥物能進(jìn)一步增加抑制作用,為FH缺陷型腎癌的治療提供新的可能性,但具體的作用機(jī)制及后續(xù)的體內(nèi)模型驗(yàn)證還有待深入研究和探索。