范世成,朱元全,李勝斌,儲(chǔ)永波,崔慶鵬

(云南省第三人民醫(yī)院泌尿外科,云南昆明 650032)

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征(chornic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome,CP/CPPS),占所有前列腺炎中的90%[1],然而其病因尚不清楚,目前被證實(shí)CP/CPPS可能與自身免疫和炎癥相關(guān)[2]。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)已被證明在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,白介素-17(interleukin-17,IL-17)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)也被發(fā)現(xiàn)在CP/CPPS中扮演重要角色,但我們對(duì)三者在CP/CPPS中如何相互作用知之甚少。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性前列腺炎(experimental autoimmune prostatitis,EAP)大鼠模型被認(rèn)為是CP/CPPS動(dòng)物模型的最佳選擇[3]。本研究通過檢測(cè)EAP大鼠前列腺組織中GM-CSF、NGF、IL-17的表達(dá)水平,以便探討三者在CP/CPPS發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠來源及其喂養(yǎng)環(huán)境選用無特定病原體(specefic pathogen free,SPF)級(jí)雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠：2月齡體質(zhì)量(220±18)g,4月齡體質(zhì)量(350±20)g,購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;獨(dú)立籠盒系統(tǒng)飼養(yǎng),室溫18～22 ℃,濕度控制在50%左右,光照和黑暗每12 h改變1次,標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由飲水、攝食。

1.2 EAP建模及分組

1.2.1EAP建模誘導(dǎo)前制備前列腺抗原(prostate antigen,PAG) 取4個(gè)月齡SD大鼠20只,體質(zhì)量(350±20)g,使用10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉后脫頸處死大鼠,取完整前列腺組織并稱重,切碎前列腺組織后放入玻璃勻漿器,加入同等質(zhì)量0.5%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)作為均漿介質(zhì),在冰浴中(0 ℃,15 min)碾碎組織,取勻漿液離心[10 000 r/min離心30 min,溫度4 ℃,相對(duì)離心力(relative centrifugal force,RCF)約5 738 g]后提取上清液為PAG,將PAG用二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)配制成60 mg/mL。

1.2.2EAP組和阻斷EAP組 取2個(gè)月齡SD大鼠20只,體質(zhì)量(220±18)g在第1天,皮下多點(diǎn)(下腹部骨盆區(qū)及雙側(cè)肩部)注射PAG與完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant,CFA)1∶1混合乳化液約1 mL,同時(shí)腹腔注射百白破疫苗0.5 mL;在第7、14、28天,皮下多點(diǎn)(下腹部骨盆區(qū)及雙側(cè)肩部)注射PAG與不完全弗氏佐劑(incomplete freund’s adjuvant,IFA)1∶1混合乳化液約1 mL,同時(shí)腹腔注射百白破疫苗0.5 mL,完成建模前誘導(dǎo)。首次注射第42天后制成自身免疫性大鼠模型,隨機(jī)分為2組,EAP組(10只)和阻斷EAP組(10只)。

1.2.3對(duì)照組和阻斷對(duì)照組 取2個(gè)月齡SD大鼠20只,體質(zhì)量(220±18)g在第1天,皮下多點(diǎn)(下腹部骨盆區(qū)及雙側(cè)肩部)注射生理鹽水與完全弗氏佐劑(CFA)1∶1混合乳化液約1 mL,同時(shí)腹腔注射百白破疫苗0.5 mL;在第7、14、28天,皮下多點(diǎn)(下腹部骨盆區(qū)及雙側(cè)肩部)注射生理鹽水與不完全弗氏佐劑(IFA)1∶1混合乳化液約1 mL,同時(shí)腹腔注射百白破疫苗0.5 mL,隨機(jī)分為2組,對(duì)照組(10只)和阻斷對(duì)照組(10只)。

1.3 阻斷GM-CSF將阻斷對(duì)照組和阻斷EAP組分別于EAP誘導(dǎo)前一天及誘導(dǎo)后的第1、7、14、28天腹腔注射大鼠抗GM-CSF 抗體0.25 mg。

1.4 痛覺測(cè)試予Von-Frey測(cè)痛纖維于EAP誘導(dǎo)的第1、10、20、30、40、50日于對(duì)照組、EAP組、阻斷對(duì)照組、阻斷EAP組進(jìn)行痛覺測(cè)試,具體方法為：將大鼠分別置于透明塑料箱中(15 cm×15 cm×15 cm),其底板為不銹鋼絲格柵,讓其適應(yīng)0.5 h后,予Von-Frey纖維絲1、2、4、8、15、26 g依次垂直刺激其骨盆區(qū)域,每次刺激時(shí)間持續(xù)2 s,間隔5 s后重復(fù)刺激,共刺激100次。以下3種類型的行為認(rèn)為是von Frey纖維絲刺激陽性反應(yīng)：①腹部急劇收縮;②立即舔或刮擦細(xì)絲刺激的區(qū)域;③跳躍。建立EAP大鼠模型后,對(duì)各組進(jìn)行痛覺測(cè)試。

1.5 免疫組化檢測(cè)大鼠前列腺組織GM-CSF蛋白的表達(dá)常規(guī)取出前列腺組織,予體積分?jǐn)?shù)為4%的中性甲醛固定、石蠟包埋,切片、脫蠟、入水、抗原修復(fù),切片上滴加正常山羊血清封閉液,滴加一抗、二抗,滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,最后予DAB顯色,封片,顯微鏡下觀察。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)RT-PCR根據(jù)制造商的規(guī)格,用Trizol(Invitrogen)從前列腺組織中提取總RNA。用試劑盒(TOYOBO)將細(xì)胞總RNA合成為cDNA。定量PCR采用SYBR綠色I(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)(SYBR綠色實(shí)時(shí)PCRMasterMixPlus,TOYOBO)進(jìn)行。根據(jù)出版物使用的引物如下：①GM-CSF：F-GCAATTTCACCAAACTCAAGG,R-CTCATTACGCAGGCACAAAAG;②IL-17：F-C-ACTGAGGCCAAGGACTT,R-CGTGGAACGGTTGAGGTA;③神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)：F-ACTGGACTAAACTTCAGCATTCC,R-GGGCAGCTA-TTGGTGCAGTA。所有樣品均進(jìn)行了重復(fù)的檢測(cè)。用熒光定量PCR儀,采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.7 Western blot檢測(cè)常規(guī)提取前列腺組織,于冰浴中10 min,室溫平衡。經(jīng)100 g/LSDS-PAGF膜轉(zhuǎn)印2 h,以5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗4 ℃反應(yīng)過夜。加入二抗室溫孵育2 h,ECL化學(xué)發(fā)光法顯色、曝光、顯影、定影。掃描儀掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果,GEL-Pro4圖像分析軟件分析灰度值,以目的條帶與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠前列腺組織病理學(xué)變化EAP組大鼠前列腺組織表現(xiàn)為間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),腺體周圍充血明顯,未見明顯組織損傷;阻斷EAP組大鼠前列腺組織炎癥反應(yīng)較少;EAP組炎癥情況比阻斷EAP組重(圖1)。

A：對(duì)照組;B：EAP組;C：阻斷EAP組。

2.2 各組大鼠前列腺組織GM-CSF表達(dá)水平比較大鼠前列腺組織免疫組化檢測(cè)顯示,GM-CSF在細(xì)胞質(zhì)中呈陽性表達(dá),EAP組大鼠前列腺組織GM-CSF表達(dá)較阻斷EAP組升高(P<0.01,圖2)。

2.3 各組大鼠前列腺組織中GM-CSF、NGF、IL-17的表達(dá)水平比較RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,GM-CSF的阻斷降低了下游傷害性感受和炎癥介質(zhì)的表達(dá)。為了確定GM-CSF是否能調(diào)節(jié)EAP誘導(dǎo)過程中下游介質(zhì)的表達(dá),我們?cè)贓AP后50 d用RT-PCR檢測(cè)NGF和IL-17的mRNA表達(dá)水平。阻斷GM-CSF后顯著降低了EAP誘導(dǎo)的前列腺組織中NGF和IL-17mRNA的表達(dá)(圖3)。

A：粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF);B：神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF);C：白介素-17(IL-17);n=10,***P<0.001。

2.4 大鼠前列腺組織中GM-CSF、NGF、IL-17蛋白質(zhì)的表達(dá)量Western blot結(jié)果顯示,阻斷GM-CSF后EAP誘導(dǎo)的前列腺組織中NGF和IL-17蛋白的表達(dá)下降,其中以NGF更為顯著(圖4)。

A：粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF); B：神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF); C：白介素-17(IL-17);D：1對(duì)照組,2 EAP組,3阻斷對(duì)照組,4阻斷EAP組;n=10,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2.5 各組大鼠骨盆區(qū)域疼痛結(jié)果各組大鼠骨盆區(qū)域Von-Frey測(cè)痛顯示：從開始建立EAP大鼠模型至50 d過程中,EAP組骨盆疼痛表現(xiàn)較對(duì)照組明顯升高,在阻斷GM-CSF后EAP大鼠相比較EAP大鼠顯示出反應(yīng)頻率降低(圖5),說明慢性盆腔疼痛得到緩解。這些結(jié)果表明,GM-CSF對(duì)EAP中慢性盆腔疼痛的維持至關(guān)重要。

3 討 論

CP/CPPS以慢性盆腔疼痛和前列腺炎性癥狀為特征,在35～45歲男性人口中占15%[4]。先前的研究表明CP/CPPS有炎癥性或自身免疫性的基礎(chǔ)病變[2-3,5],用EAP動(dòng)物模型進(jìn)行免疫學(xué)分析已經(jīng)證明,先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都參與了慢性盆腔疼痛的發(fā)展[6]。我們認(rèn)為升高的炎癥因子可觸發(fā)自身免疫,增加神經(jīng)敏化。然而,關(guān)于炎癥因子在CP/CPPS發(fā)病機(jī)制中的具體作用,我們知之甚少,導(dǎo)致CP/CPPS的治療效果還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿意。

GM-CSF最初被報(bào)道為一種能夠誘導(dǎo)髓系前體細(xì)胞中的粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落的蛋白[7];是免疫細(xì)胞的重要激活和分化因子,對(duì)先天免疫和適應(yīng)性免疫都至關(guān)重要[8]。近年來,越來越多的證據(jù)表明,GM-CSF在自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[9-10]。除了作為促炎細(xì)胞因子的作用,GM-CSF被發(fā)現(xiàn)通過影響感覺神經(jīng)調(diào)節(jié)疼痛通路[11-12],神經(jīng)元上也發(fā)現(xiàn)GM-CSF受體。GM-CSF可由各種類型的細(xì)胞產(chǎn)生,包括髓系細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞[13]。有研究表明GM-CSF可由尿路上皮細(xì)胞響應(yīng)細(xì)菌內(nèi)毒素而釋放,并可能介導(dǎo)先天免疫應(yīng)答和膀胱傳入信號(hào)通路[14]。GM-CSF在自身免疫性疾病和炎癥性疾病發(fā)展中的作用及其介導(dǎo)疼痛的作用提示GM-CSF可能是CP/CPPS的發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)。目前還沒有關(guān)于GM-CSF是否進(jìn)行了調(diào)控CP/CPPS的信息。本研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子,包括GM-CSF、IL-17和NGF,在EAP大鼠前列腺中過表達(dá);我們進(jìn)一步利用EAP模型和注射抗GM-CSF抗體大鼠模型,證明GM-CSF在CP/CPPS的過表達(dá),表明GM-CSF在介導(dǎo)前列腺炎癥中發(fā)揮了重要作用。

CP/CPPS的病理生理過程包括自身免疫和神經(jīng)敏化。由于GM-CSF在自身免疫和神經(jīng)敏化中都起著重要作用,因此GM-CSF通路可能參與了CP/CPPS的病理生理過程。本研究顯示,在EAP大鼠的前列腺組織中也觀察到更高水平的GM-CSF。為了進(jìn)一步研究GM-CSF 在CP/CPPS中的作用,我們使用EAP誘導(dǎo)時(shí)中和GM-CSF抗體老鼠的前列腺組織發(fā)現(xiàn)顯著減少了EAP誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和疼痛。進(jìn)一步研究表明,抗GM-CSF降低了前列腺組織中IL-17和NGF的表達(dá),提示在EAP誘導(dǎo)過程中,GM-CSF可能通過IL-17和NGF調(diào)節(jié)炎癥和疼痛信號(hào)通路。

從動(dòng)物模型中獲得的大量證據(jù)表明,前列腺自身免疫和盆腔疼痛是通過自身反應(yīng)性T細(xì)胞、肥大細(xì)胞和各種炎癥因子所介導(dǎo)[15-19]。我們認(rèn)為,局部免疫系統(tǒng)的紊亂破壞了對(duì)正常前列腺抗原的耐受性,進(jìn)一步誘導(dǎo)了前列腺自身免疫[17]。然而,導(dǎo)致前列腺免疫性疾病的最初因素仍不清楚。先前的研究結(jié)果表明,活化的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,促T細(xì)胞的分化,GM-CSF水平的增加上調(diào)了來自巨噬細(xì)胞/樹突狀細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子,形成了一個(gè)正反饋回路?；罨木奘杉?xì)胞/樹突狀細(xì)胞也產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,刺激駐留組織細(xì)胞產(chǎn)生GM-CSF,包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或軟骨細(xì)胞[10]。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組大鼠EAP誘導(dǎo)時(shí)相比,抗GM-CSF降低了前列腺炎的嚴(yán)重程度,提示GM-CSF的失調(diào)可能是驅(qū)動(dòng)炎癥的主要激活因子,并作為前列腺自身免疫的起始因子。疼痛是CP/CPPS患者的一種特征性表現(xiàn),越來越多的證據(jù)表明,局部炎癥介質(zhì)可能誘導(dǎo)神經(jīng)敏化,導(dǎo)致慢性疼痛的發(fā)展。GM-CSF已被證明是炎癥性和關(guān)節(jié)炎疼痛發(fā)展的關(guān)鍵因素[11]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)功能性GM-CSFRs存在于感覺神經(jīng)上,炎癥或腫瘤部位局部產(chǎn)生的GM-CSF可以使痛覺感受器敏感[20]。另外,敲除GM-CSF基因(GM-CSF-/-)的小鼠可減弱炎癥反應(yīng)中對(duì)機(jī)械性疼痛感的反應(yīng)[21]。在目前的研究中,抗GM-CSF 的EAP大鼠表現(xiàn)出較少的疼痛行為,提示GM-CSF可能對(duì)CP/CPPS的疼痛發(fā)展至關(guān)重要。我們還發(fā)現(xiàn)GM-CSF可以影響炎癥介質(zhì)IL-17和NGF的表達(dá),這些介質(zhì)與盆腔疼痛的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究結(jié)果表明,GM-CSF在EAP模型中為神經(jīng)敏化所必需,提示GM-CSF可能是CP/CPPS疼痛發(fā)展的主要介質(zhì)。GM-CSF可直接激活感覺神經(jīng)或通過其他疼痛介質(zhì)如IL-17和NGF發(fā)揮其作用。

總之,我們證明了GM-CSF在CP/CPPS的發(fā)展中的重要作用,抗GM-CSF不僅降低了炎癥和傷害性感受介質(zhì)的mRNA表達(dá),而且顯著減少了EAP誘導(dǎo)的炎癥和疼痛。GM-CSF可能是CP/CPPS和前列腺傳入信號(hào)通路疾病進(jìn)展中的重要炎癥介質(zhì)。在未來,找出GM-CSF調(diào)節(jié)宿主免疫、疼痛傳導(dǎo)和炎癥反應(yīng)的特定下游分子、細(xì)胞和生化通路將對(duì)改善CP/CPPS癥狀至關(guān)重要的。我們認(rèn)為GM-CSF可能是CP/CPPS和其他前列腺疾病的潛在治療靶點(diǎn)。