張 昊,鄭萬祥,劉克普,侯廣東,袁建林

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科,陜西西安 710032)

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),腎癌的發(fā)病率在男性和女性惡性腫瘤中分別是第9位和第14位[1]。其中,腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)約占腎細(xì)胞癌的70%[2]。轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(metastatic renal cell carcinoma,mRCC)是一種對化療耐藥的惡性腫瘤,隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展,近十幾年來有多種靶向藥物可用于治療mRCC。索拉非尼和舒尼替尼主要用于靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR),屬于酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor,TKI),能改善mRCC的預(yù)后,但不同患者之間的生存獲益程度差異較大,此外,TKI會引起各種毒副作用,包括增加致命不良事件的風(fēng)險[3]。因此,為了選擇適合特定治療方法的患者,有必要發(fā)現(xiàn)更多與TKI治療轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌(metastatic clear cell renal cell carcinoma,mccRCC)預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物。

CD10在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中催化生成血管緊張素1-7,后者與Mas受體結(jié)合可抑制血管生成和腫瘤進(jìn)展[4];HORIE等[5]發(fā)現(xiàn)CA9外泌體在體外能促進(jìn)血管生成;有學(xué)者發(fā)現(xiàn)表達(dá)CD133的內(nèi)皮細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤新生血管的形成[6]。鑒于3種標(biāo)志物均參與調(diào)節(jié)腫瘤血管生成,本研究旨在分析CD10、CA9、CD133表達(dá)與TKI一線治療mccRCC預(yù)后的相關(guān)性,從而幫助泌尿外科醫(yī)生進(jìn)行臨床決策和促進(jìn)個體化治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料回顧性分析2007年1月-2017年12月在西京醫(yī)院泌尿外科接受索拉非尼或舒尼替尼一線治療的93例mRCC患者的資料。納入研究的患者需符合以下條件：①經(jīng)病理證實(shí)為mccRCC;②接受舒尼替尼或索拉非尼作為一線的靶向治療;③有可用的甲醛固定、石蠟包埋的腫瘤組織標(biāo)本;④有詳細(xì)的隨訪信息。如果患者既往患有其他惡性腫瘤、組織標(biāo)本有超過80%壞死或出血區(qū)域以及隨訪信息缺失,則排除于本研究之外,本研究最終納入80例患者。根據(jù)患者治療方法不同分為索拉非尼組(53例)和舒尼替尼組(27例)。根據(jù)實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors,RECIST)1.1版判斷疾病進(jìn)展(progressive disease,PD),將無進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)定義為從靶向治療的第1天到出現(xiàn)影像學(xué)PD、出現(xiàn)明確PD臨床證據(jù)或死亡之間的時間;如果PD日期未知,把最后1次隨訪時間定義為PFS刪失的時間?？偵嫫?overall survival,OS)定義為從靶向治療的第1天到死亡之間的時間。

1.2 免疫組織化學(xué)染色及染色強(qiáng)度分析將ccRCC組織標(biāo)本制備成5 μm石蠟切片,而后進(jìn)行免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色,所有原發(fā)腫瘤組織標(biāo)本均來自西京醫(yī)院病理科。IHC過程如下：把石蠟包埋的載玻片在分級脫蠟液中脫蠟,接著進(jìn)行抗原修復(fù),而后用體積分?jǐn)?shù)為3%的雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,用體積分?jǐn)?shù)為3%的牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA) 封閉切片后,將載玻片與一抗(抗CD10,1∶100,抗CA9,1∶600;抗CD133,1∶600)在4 ℃孵育過夜,然后在室溫下孵育二抗(1∶200) 50 min,蘇木精染色和脫水操作用于對細(xì)胞核進(jìn)行反染色。通過全景切片掃描儀(Pannoramic MIDI,3DHISTECH,匈牙利) 采集IHC切片上的圖像,并通過軟件(Aipathwell,Servicebio Technology,中國) 進(jìn)行分析,這款圖像分析系統(tǒng)可自動識別組織測量區(qū)域,并評估陽性等級：陰性不著色,0分;弱陽性呈淡黃色,1分;中等陽性棕黃色,2分;強(qiáng)陽性呈棕褐色,3分。然后分析并計(jì)算陽性等級、測量區(qū)域中的組織區(qū)域面積、陽性面積等。對每個載玻片進(jìn)行組織化學(xué)評分(H-score)以評估各標(biāo)志物的染色強(qiáng)度,后基于各標(biāo)志物H-score的中位數(shù),將其區(qū)分為低表達(dá)或高表達(dá),低于H-score中位數(shù)的為低表達(dá),反之則高表達(dá)。H-score=∑(pi×i)=(弱陽性區(qū)域的百分比×1)+(中等陽性區(qū)域的百分比×2)+(強(qiáng)陽性區(qū)域的百分比×3)。pi代表陽性面積的百分比;i代表陽性等級(圖1)。

A、B：CD10高表達(dá)和低表達(dá);C、D：CA9高表達(dá)和低表達(dá);E、F：CD133高表達(dá)和低表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析分析IHC標(biāo)志物表達(dá)與臨床病理變量的相關(guān)性,兩組間計(jì)量資料以中位數(shù)(P25,P75)表示,比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,比較采用χ2檢驗(yàn);用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險模型分析mccRCC的預(yù)后因素;在索拉非尼和舒尼替尼亞組內(nèi),采用Kaplan-Meier法進(jìn)行標(biāo)志物表達(dá)與PFS和OS的生存分析,低表達(dá)和高表達(dá)間生存率的比較采用Log Rank檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析均由SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行,作圖軟件用Graphpad Prism 9.0,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者的基本特征本研究共回顧性納入80例mccRCC患者,其中索拉非尼組53例,舒尼替尼組27例(表1)。截至2022年7月,37例(46.25%)患者出現(xiàn)PFS隨訪結(jié)局,中位PFS(median PFS,mPFS)為24.9(95%CI：16.5～33.2)個月;有55例(68.75%)患者死亡,中位OS(median OS,mOS)為44.2(95%CI：14.6～73.7)個月?；颊呋咎卣髟谒幬锝M間的均衡性檢驗(yàn)顯示,手術(shù)方式為腎部分切除術(shù)(partial nephrectomy,PN)和根治性腎切除術(shù)(radical nephrectomy,RN)在藥物組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.914,P<0.001)。

2.2 患者幾種標(biāo)志物表達(dá)與臨床病理變量的相關(guān)性分析CD10表達(dá)與Fuhrman分級相關(guān)(χ2=6.241,P=0.012),在CD10低表達(dá)組,Fuhrman 3～4級mccRCC占比更高;CA9表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=5.952,P=0.015)和轉(zhuǎn)移器官個數(shù)(χ2=8.205,P=0.004)相關(guān),在CA9低表達(dá)組,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移器官個數(shù)≥2個的患者占比更高,沒有發(fā)現(xiàn)CD133與臨床病理變量的相關(guān)性(表2)。

2.3 mccRCC預(yù)后的影響因素分析將年齡、性別、Fuhrman分級、T分期、轉(zhuǎn)移器官數(shù)、轉(zhuǎn)移部位、手術(shù)方式、藥物種類及各標(biāo)志物的表達(dá)等因素分別與PFS進(jìn)行Cox單因素分析,結(jié)果顯示,Fuhrman分級、轉(zhuǎn)移器官數(shù)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是PFS的影響因素(P<0.05),將P<0.05的因素納入Cox多因素分析中,顯示Fuhrman分級是PFS的獨(dú)立影響因素(HR=2.457,95%CI：1.126～5.365,P=0.024);同樣方法對各因素與OS進(jìn)行Cox回歸分析,單因素分析顯示轉(zhuǎn)移器官數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CA9表達(dá)是OS的影響因素(P<0.05),而其中轉(zhuǎn)移器官數(shù)是OS的獨(dú)立影響因素(HR=1.857,95%CI：1.048～3.290,P=0.034,表3)。

表3 mccRCC患者PFS和OS的單因素分析

2.4 CA9表達(dá)與治療亞組患者PFS和OS的生存分析Kaplan-Meier生存分析和Log Rank檢驗(yàn)顯示,在索拉非尼組內(nèi),CA9低表達(dá)和高表達(dá)組患者的mOS分別是25.4、79.7個月,OS的生存曲線差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log RankP=0.006),而兩組間PFS生存曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在舒尼替尼組內(nèi),CA9低表達(dá)和高表達(dá)組間PFS和OS生存曲線差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

A、C：索拉非尼組CA9表達(dá)與OS(A)和PFS(B)的生存分析;B、D：舒尼替尼組CA9表達(dá)與OS(B)和PFS(D)的生存分析。

3 討 論

2021年CSCO指南中指出舒尼替尼、索拉非尼是一線治療轉(zhuǎn)移性或不可切除性ccRCC的Ⅰ級推薦[7]。相較于索拉非尼或舒尼替尼的Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果[8-9],本研究中mccRCC患者的mPFS和mOS相對較長,原因可能來自兩個方面。一方面是研究排除了失訪的患者,而失訪患者通常預(yù)后較差;另一方面是所納入的患者都接受了PN或RN。既往回顧性研究顯示,RCC患者在減瘤性腎切除術(shù)后接受靶向治療較單純靶向治療具有顯著OS獲益[10]。

藥物組間均衡性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),索拉非尼組接受PN的患者僅3例(5.7%),明顯低于舒尼替尼組。究其原因可能是索拉非尼組患者的發(fā)病時間早于舒尼替尼組。得益于醫(yī)療設(shè)備技術(shù)和循證醫(yī)學(xué)的發(fā)展,接受PN的患者有逐年增多的趨勢。一項(xiàng)研究回顧性分析了單中心在10年間接診的1 498例RCC患者的資料,發(fā)現(xiàn)PN比例逐年提高,RN比例逐年降低[11]。有研究認(rèn)為PN能有效地保存腎功能[12],降低心血管事件發(fā)生的風(fēng)險[13],而接受RN或PN患者的腫瘤特異性生存率(cancer specific survival,CSS)并無明顯差異[14]。

標(biāo)志物表達(dá)與臨床病理變量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),CD10低表達(dá)與Fuhrman高分級相關(guān)。與此發(fā)現(xiàn)一致的是,明少雄等[15]分析了1 084例ccRCC組織標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)CD10在細(xì)胞核高分化、中分化、低分化中的陽性表達(dá)率分別為81.1%、82.8%、50.0%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.040)。這提示CD10低表達(dá)的mccRCC可能更容易發(fā)生疾病進(jìn)展,有學(xué)者認(rèn)為CD10表達(dá)缺失或減少可能會促進(jìn)神經(jīng)肽介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展[16]。CD10對ccRCC的預(yù)后作用尚存在爭議。本研究未發(fā)現(xiàn)CD10表達(dá)與mccRCC患者PFS和OS的相關(guān)性。ERRARTE等[4]發(fā)現(xiàn)在ccRCC患者中,CD10陽性表達(dá)與更差的15年OS相關(guān)(P=0.007);另一研究發(fā)現(xiàn)在CD10陰性和陽性表達(dá)組之間,ccRCC患者的CSS生存曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.361)[15]。

CA9低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移器官數(shù)≥2相關(guān),可能提示CA9低表達(dá)的ccRCC侵襲性更高。一項(xiàng)Meta分析研究發(fā)現(xiàn),在RCC中CA9低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),并能預(yù)測較高的腫瘤分級[17]。ZHANG等[18]對730例接受手術(shù)治療的ccRCC患者進(jìn)行長期隨訪,中位隨訪時間為13.8年,發(fā)現(xiàn)CA9低表達(dá)與患者CSS降低相關(guān)(HR：1.62,P=0.001),但多因素分析沒有發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性。本研究中,CA9低表達(dá)是mccRCC患者OS縮短的非獨(dú)立預(yù)后因素。然而生存分析結(jié)果可能與CA9表達(dá)水平的界定標(biāo)準(zhǔn)有一定關(guān)系。CHAMIE等[19]對813例非轉(zhuǎn)移性ccRCC患者的腫瘤組織進(jìn)行CA9染色和H-socre評分,發(fā)現(xiàn)與CA9評分≤100分相比,CA9評分≥200分是PFS和OS獨(dú)立且有利的預(yù)后因素。

CD133是五次跨膜糖蛋白prominin家族的成員,其表達(dá)在RCC中的預(yù)后作用存在爭議。有Meta分析發(fā)現(xiàn)CD133高表達(dá)是RCC患者CSS獨(dú)立且有利的預(yù)后因素(HR=0.4,95%CI：0.29～0.54)[20]。SAEEDNEJAD等[6]發(fā)現(xiàn)CD133的高胞質(zhì)表達(dá)與ccRCC高分級、高分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),其膜性表達(dá)與腫瘤分級、分期不相關(guān)。而D’AlTERIO等[21]的一項(xiàng)研究評估了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜CD133的表達(dá),發(fā)現(xiàn)CD133不是RCC患者無疾病生存期的預(yù)后因素(P=0.151)。本研究發(fā)現(xiàn)CD133不能作為mccRCC的預(yù)后因素,在進(jìn)一步的研究中可分析胞膜或胞質(zhì)表達(dá)其各自的預(yù)后作用。

治療亞組內(nèi)CA9表達(dá)與PFS和OS的生存分析表明,CA9高表達(dá)與索拉非尼組mccRCC患者較長的OS相關(guān),而與PFS不相關(guān)。CHOUEIRI等[22]分析了TARGET研究中接受索拉非尼治療的133例mccRCC患者的資料,CA9高表達(dá)與低表達(dá)患者的mPFS分別為5.5和5.4個月,差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在舒尼替尼治療的ccRCC患者中,CA9的預(yù)后作用存在爭議。本研究發(fā)現(xiàn),CA9低表達(dá)與舒尼替尼組患者的OS和PFS均不相關(guān)。有學(xué)者前瞻性招募了67例接受舒尼替尼一線治療的ccRCC患者,同樣發(fā)現(xiàn)CA9表達(dá)不是PFS和OS的預(yù)后因素[23]。然而MA等[24]的研究發(fā)現(xiàn),在52例接受舒尼替尼一線治療的mccRCC中,CA9高表達(dá)組相較低表達(dá)組患者有較長的PFS和OS,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中,CA9低表達(dá)組患者從索拉非尼和舒尼替尼治療中生存獲益較少,因此對于腫瘤組織中CA9低表達(dá)的mccRCC患者,可以根據(jù)指南選擇靶向免疫聯(lián)合治療或雙免聯(lián)合治療以改善預(yù)后。

本研究存在一定局限性,首先,本研究為單中心的回顧性研究,存在一定偏倚,樣本量相對較少,未來需要擴(kuò)大樣本量及前瞻性研究對本結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證;其次,部分患者在疾病進(jìn)展后換用不同的二線或三線藥物治療;第三,各研究所使用的抗體敏感性和規(guī)格各不相同,確定標(biāo)志物陽性或陰性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)也有所不同,可能會導(dǎo)致不同的結(jié)果。本研究僅納入ccRCC患者,保證了數(shù)據(jù)的同質(zhì)性,基于各標(biāo)志物調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的潛在機(jī)制,本研究可能是首個分析CD10、CD133與TKI治療mccRCC預(yù)后相關(guān)性的研究,旨在協(xié)助臨床醫(yī)生精準(zhǔn)決策。