●苑 彬

（河北省廊坊市安次區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 河北 廊坊 065000）

經(jīng)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，引起不同日齡仔豬腹瀉因素很多，如病原因素（病毒、細(xì)菌和寄生蟲），養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境因素（溫度、濕度、采光），飼養(yǎng)管理技術(shù)因素（飲水、飼料）及外界環(huán)境應(yīng)激（斷奶、轉(zhuǎn)群、換料）等。仔豬病毒性腹瀉可引起仔豬的生長(zhǎng)性能下降、免疫力降低、腹瀉、腸道感染等一系列的臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致其死亡，給我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。臨床中常見的引起仔豬病毒性腹瀉的病原有PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種，可引起仔豬病毒性腹瀉以厭食、嘔吐、水樣腹瀉及嚴(yán)重脫水，傳染性強(qiáng)、死亡率較高，采用實(shí)驗(yàn)室診斷方法可進(jìn)行鑒別診斷，如病理學(xué)觀察、免疫學(xué)診斷及分子生物學(xué)診斷[3-5]。病毒性腹瀉對(duì)仔豬的危害較大，因此，采用實(shí)驗(yàn)室診斷方法（RT-PCR）對(duì)仔豬病毒性腹瀉病毒的區(qū)別診斷具有重要意義。

2020～2022年在河北廊坊安次區(qū)仔豬規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶采集患腹瀉病仔豬糞便、腸內(nèi)容物及內(nèi)臟病料組織總計(jì)1508份，進(jìn)行PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病毒性腹瀉病原檢測(cè)，并開展4種病毒性腹瀉病流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)該地區(qū)仔豬4種病毒性腹瀉病綜合防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2020～2022年采集河北廊坊安次區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶患腹瀉病仔豬糞便、腸內(nèi)容物及其他內(nèi)臟病料組織1508份，其中2020年采集病料樣品461份、2021年采集病料樣品494份，2022年采集病料樣品553份（表1）。

表1 樣品采集統(tǒng)計(jì)結(jié)果

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料的處理與核酸的提取 將采集的病料加入等量、無菌的PBS進(jìn)行研磨，高速離心（12 000 r/min，10 min），取上清分裝，-80℃反復(fù)凍融3次。參照組織RNA提取試劑盒，提取病料組織中病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與RT-PCR檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原鑒定引物（表2），在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以本文“1·2”節(jié)中反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1·0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)判定其結(jié)果，并分析其感染率。

表2 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 仔豬4種病毒性病原的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)2020～2022年采集河北廊坊安次區(qū)區(qū)仔豬規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶中患腹瀉仔豬糞便、腸內(nèi)容物及其他內(nèi)臟病料組織總計(jì)1508份樣品進(jìn)行處理，并提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RT-PCR方法檢測(cè)PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原，結(jié)果見圖1。用RT-PCR方法對(duì)采集的樣品可擴(kuò)增出PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原目的基因條帶（231 bp，342 bp，309 bp，1100 bp），與預(yù)期大小一致。

圖1 仔豬樣品中的PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 仔豬4種病毒性病原的陽性率檢測(cè)結(jié)果

2020～2022年采集的1508份樣品，包括2020年采集病料樣品461份、2021年采集組織樣品494份，2022年采集組織樣品553份，對(duì)采集的樣品采用RT-PCR方法檢測(cè)PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原，分析4種病原陽性率，統(tǒng)計(jì)感染情況。由表3可知，2020～2022年共計(jì)采集1508份樣品，檢測(cè)的PEDV、TGEV、PorV和PDCoV陽性率分別為11·00%，7·03%，2·98%，2·59%，其中PEDV和TGEV陽性率較高，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。

表3 不同種類豬感染病原的檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

仔豬病毒性腹瀉病是養(yǎng)豬業(yè)中常見疾病之一，臨床中常見的病毒性病原主要包括PEDV、TGEV、PorV和PDCoV，仔豬的感染率和死亡率均較高，且在臨床中癥狀相似，不易區(qū)分[6]。有研究表明，RT-PCR是檢測(cè)仔豬病毒性腹瀉病最有效的檢測(cè)方法，該方法便于操作、靈敏度高、假陽性率低，并且適用于規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的檢測(cè)。本試驗(yàn)研究表明，用RT-PCR方法對(duì)采集的樣品可擴(kuò)增出PEDV（231 bp）、TGEV（342 bp）、PorV（309 bp）、PDCoV（1100 bp），與預(yù)期大小一致；經(jīng)分析，采集1508份樣品中PEDV、TGEV、PorV和PDCoV陽性率分別為11·00%、7·03%、2·98%和2·59%，其中PEDV和TGEV陽性率較高，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。說明該地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶中PEDV和TGEV流行嚴(yán)重，應(yīng)引起注意，定期進(jìn)行檢測(cè)和對(duì)仔豬進(jìn)行PEDV和TGEV疫苗接種，進(jìn)行有效的綜合防控。