趙志祥 王殿東 周亞林 王培 嚴婉榮 嚴蓓 羅路云 張卓

（1.海南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，海南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標準研究中心，海南省植物病蟲害防控重點實驗室，?？?571100；2.長江師范學院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學院，重慶 408100；3.麻陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局植保植檢站，懷化 419400；4.湖南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，園藝作物病蟲害治理湖南省重點實驗室，長沙 410125；5.湖南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，長沙 410128）

辣椒（Capsicum annuum L.）是一種重要的蔬菜，在中國種植面積超過130萬hm2。辣椒枯萎病是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起，在許多國家均有發(fā)生［1-3］，在我國陜西、甘肅、湖南等地相繼發(fā)生，發(fā)病率一般為15%-30%，嚴重時50%以上，甚至絕產(chǎn)［4］。化學防治是目前使用最多、最有效、最易讓人接受的防治方法。但是長期大量使用單一化學藥劑，易誘導病菌產(chǎn)生抗藥性，并且對土壤生物群落造成較大的影響，導致土壤肥力下降［5-6］。因此減少或取代化學藥劑在防治辣椒枯萎病中的應用，在降低健康危害、環(huán)境破壞和污染等方面顯得尤為迫切。根際是土壤、植物和微生物三者相互作用的生態(tài)環(huán)境［7］，而根際微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最為活躍的組成部分，在植物生長過程中起著重要作用，能把土壤中的有機物和一些難分解的物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化，為植物生長提供肥沃的土壤［8］。通過調(diào)控根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)抑制土壤病原菌，將逐步取代傳統(tǒng)的化學防治手段，具有較為廣闊的應用前景。

利用生防細菌、真菌及放線菌等拮抗微生物的寄生、抗生作用，及其與病原菌的營養(yǎng)物質(zhì)、生態(tài)位的競爭效應，抑制和消滅病原菌是防治辣椒枯萎病的有效措施之一。芽孢桿菌已被證明對尖孢鐮刀菌具有較強的拮抗作用，是重要的辣椒枯萎病生防細菌。本研究中拮抗細菌Ya-1，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），來源于海南五指山熱帶雨林土壤，對辣椒枯萎病菌具有較好的抑制效果。Xu等［9］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌SQR9分泌的脂肽類化合物芽孢菌霉素D對尖孢鐮刀菌等土傳病原生物具有較強的抑制活性。吳月等［10］報道芽孢桿菌或假單胞桿菌等對辣椒枯萎病菌有較好的抑制作用。郭珺等［11］報道芽孢桿菌pb-4能明顯抑制辣椒枯萎病菌孢子的萌發(fā)。Jamal等［12］研究發(fā)現(xiàn)施用B.amylliquefaciens Y1可以提高辣椒葉片的葉綠素含量，同時顯著提高土壤全氮、可培養(yǎng)細菌和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶細菌的數(shù)量以及幾丁質(zhì)酶和脫氫酶的活性。Cao等［13］分離出高拮抗活性的芽孢桿菌菌株2株，B.velezensis Y6和F7，其對辣椒枯萎病菌和茄科青枯病菌在室內(nèi)和盆栽條件下均有較好的抑菌活性，其活性物質(zhì)Iturin對辣椒枯萎病菌具有持續(xù)的抑菌效果。Chowdhury等［14］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌LBF-01對辣椒尖孢鐮刀枯萎病菌有較好地抑菌活性，同時促進辣椒生長，田間實驗能降低9.04倍的枯萎病發(fā)生率，減少50%的多菌靈使用，并能增加種子的萌發(fā)率。Ben等［15］研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌V26能溶解無機磷酸鹽、固氮，產(chǎn)生吲哚乙酸、鐵載體和水解酶，并對尖孢鐮刀菌具有較好的抑菌活性。

根據(jù)生態(tài)學原理，通過對辣椒根區(qū)土壤接種外來菌，調(diào)節(jié)植株根區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)，有可能從根本上控制辣椒枯萎病?？莶菅挎邨U菌Ya-1作為辣椒枯萎病的生防微生物，其對罹病枯萎病辣椒根際土壤真菌群落的影響仍然未知。本研究以枯草芽孢桿菌Ya-1為材料，采用高通量測序技術(shù)重點研究接種生防菌對罹病辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵種群的影響及動態(tài)變化，從微生物角度為芽孢桿菌調(diào)控微生態(tài)環(huán)境來抑制辣椒枯萎病的新途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗地點位于海南省農(nóng)科院植物保護研究所，試驗辣椒品種為‘乾隆一號’。供試病原菌為辣椒枯萎病菌鐮刀尖孢菌（Fusarium oxysporum f.sp.capsici），供試生防菌為枯草芽孢桿菌Ya-1（B.subtilis），來源于海南五指山熱帶雨林土壤，其具有廣譜抗性，對辣椒枯萎病菌有較好的抑制效果。

1.2 方法

1.2.1 樣地概況和根際土壤采集 試驗土壤采集自健康辣椒土壤，首先將采集的土壤經(jīng)過80目過篩后，再與營養(yǎng)基質(zhì)8∶1比例混勻后裝盆。使用1%次氯酸鈉溶液對‘乾隆一號’感病辣椒種子表面消毒，無菌水沖洗3遍，將種子放置在帶有無菌濾紙的120 mm玻璃培養(yǎng)皿，加入無菌水使種子沒過濾紙片，保濕催芽5 d，待80%以上的種子露白后，播種到事先準備好的盆中，每盆3顆。待辣椒苗長出2片真葉時，使用1 000倍液的腐殖酸澆灌，4-5 d/次，每次30 mL/盆，連續(xù)澆灌3次。保證辣椒苗長勢均勻、茁壯。待苗長到6葉1芯時開始處理。

試驗共設(shè)置4個處理，A: 100 mL無菌水浸根10 min后澆灌；B: 100 mL枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液（1×107CFU/mL）浸根10 min后澆灌；C: 100 mL辣椒枯萎病菌（F.oxysporum）孢子懸浮液（1×107CFU/mL）浸根10 min后澆灌；D:先接種100 mL枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液，24 h后接種100 mL F.oxysporum孢子懸浮液。分別于接種前、接種后10 d、接種后20 d采集土壤樣本，接種前因各盆處理均一致，因而隨機取5份樣本，每個處理設(shè)置5個重復。采集辣椒根放入裝有100 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液的250 mL錐形瓶中，晃動錐形瓶充分清洗辣椒根系，13 000 r/min對洗脫液進行離心，高速離心3 min。離心后棄上清，對沉淀土壤多次重復離心洗滌后，將土壤樣品收集至離心管，冷凍干燥［16］。冷凍干燥后將根際土壤放入-80℃冷凍箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 土壤總DNA提取、PCR擴增和測序 每個土壤樣品稱取0.5 g土樣，用FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒提取土壤總DNA。提取的土壤DNA用NanoDrop 2000測定總DNA濃度和純度。A260/A280值在1.8-2.0之間為合格。將合格樣品DNA進行擴增前基因組DNA濃度定量。定量后終濃度稀釋為30 ng/μL。以樣品DNA為模板，真菌DNA擴增ITS2區(qū)引物序列：ITS3-2024F：GCATCGATGAAGAACGCAGC；ITS4-2409R：TCCTCCGCTTATTGATATGC［17］。對PCR產(chǎn)物進行2% 瓊脂糖電泳，PCR擴增產(chǎn)物用Qubit4.0熒光計進行定量，然后將產(chǎn)物送至武漢天一華煜公司HiSeq平臺進行PE250測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 原始下機數(shù)據(jù)的上游分析主要采用Mothur和usearch完成。其流程主要如下：對原始數(shù)據(jù)進行嚴格質(zhì)控，將小于200 bp的序列進行去除，剔除模糊堿基序列“N”和序列平均質(zhì)量Q值＜20的低質(zhì)量序列，最終獲得effective tags。利用 Mothur軟件包對 tag 序列進行了去冗余處理，小于200 bp的序列被丟棄，從中挑選出 unique tag 序列。用 Uparse 軟件對所有樣品的全部 Effective Tags 序列聚類，默認提供以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units）［18］。使用RDP-Classifier軟件注釋時，采用Fungal ITS（unite database 7.2 version）數(shù)據(jù)庫對真菌OTU代表序列進行序列注釋，最終得到OTU代表序列［19］。將OTU表抽平后獲得75 514條序列，計算α多樣性指數(shù)。使用R軟件中的Vegan包計算樣本間Bray-Cutis距離矩陣。采用主坐標分析方法分析不同處理下各樣本微生物群落結(jié)構(gòu)差異。同時，使用R軟件中的Vegan包進行非參數(shù)多反應置換法、相似性分析和非參數(shù)多變量置換法方差分析來鑒定兩組間的群落差異［20-21］，對微生物種群進行相關(guān)性分析。

1.2.4 土壤微生物共發(fā)生模式分析 使用抽平的OTU表，取相對豐度排名前500的OTU進行土壤真菌微生物共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。利用分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析（MENA，http://ieg4.rccc.ou.edu/mena/login.cgi），基于Spearman秩相關(guān)矩陣構(gòu)建了真菌4個類群的系統(tǒng)發(fā)育分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)（pMENs），只保留高于特定閾值（真菌：0.82）的相關(guān)性來計算網(wǎng)絡(luò)特征值［22-24］。最后采用Gephi（https://gephi.org/）軟件進行網(wǎng)絡(luò)的可視化操作，得到network網(wǎng)絡(luò)圖，并在Gephi軟件里面進行模塊化分析。

1.2.5 辣椒枯萎病發(fā)病率和防治效果 按照參考文獻［25］發(fā)病情況，并計算辣椒枯萎病發(fā)病率以及相對防效。統(tǒng)計方法如下：

2 結(jié)果

2.1 拮抗枯草芽孢桿菌Ya-1對辣椒枯萎病發(fā)病率和病害指數(shù)的影響

辣椒枯萎病的發(fā)病率和病害指數(shù)結(jié)果見表1。結(jié)果表明，單獨接種病原菌FOC處理（C）第10天和第20天的發(fā)病率分別為32.08%和45.83%，而接種Ya-1+FOC處理（D）的發(fā)病率分別為7.08%和10.42%。接種Ya-1+FOC處理（D）與單獨接種病原菌FOC處理（C）在第10天和第20天的發(fā)病率差異極顯著（P＜ 0.01，表1），前者比后者發(fā)病率分別降低了25%和35.41%。另CK處理（A）和單獨接種Ya-1處理（B）在第10和第20天時未見發(fā)病植株，僅有少量自然枯死植株（莖基部不變褐色），因而不做防治效果統(tǒng)計。與單獨接種病原菌FOC處理（C）相比，接種Ya-1+FOC處理（D）在第10和第20天的相對防治效果分別為77.93%和77.26%。

表1 拮抗菌Ya-1在不同時間點辣椒枯萎病發(fā)病率和防治效果Table 1 Incidence rate and control effect of pepper Fusarium wilt with antagonist Ya-1 at different time points

2.2 根際真菌群落α多樣性

測序共獲得4 639 049條OTU，每個樣品OTU數(shù)在75 514和149 265之間。經(jīng)過抽平后所有OTU條數(shù)為75 514。對不同處理組和對照組在不同時間點的辣椒根際真菌群落進行α多樣性分析，結(jié)果如表2。辣椒根際土壤真菌群落的α多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）和豐富度指數(shù)（Chao1）呈不同的變化趨勢（表2）。接種枯草芽孢桿菌Ya-1組（B）和對照（A）真菌shannon指數(shù)均先升高后降低，接種辣椒枯萎病菌（C）組先降低后升高，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組（D）真菌Shannon指數(shù)逐漸降低。10 d時接種辣椒枯萎病菌組Shannon指數(shù)顯著低于對照，接種枯草芽孢桿菌Ya-1組、同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組與對照無顯著差異，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Shannon指數(shù)顯著高于接種辣椒枯萎病菌組；20 d時接種枯草芽孢桿菌Ya-1組、接種辣椒枯萎病菌、同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Shannon指數(shù)均與對照無顯著差異，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組與接種辣椒枯萎病菌組Shannon指數(shù)之間也無顯著差異。

忽然，十六師第四十六團團長謝士炎電話報告，守西門的連長報告，信安江上游浮來一個老百姓，說有事要見師長。

表2 辣椒根際真菌α多樣性指數(shù)Table 2 Fungal α diversity indices around pepper rhizosphere soil

接種枯草芽孢桿菌Ya-1組（B）和對照（A）真菌Chao1值均先升高后降低，接種辣椒枯萎病菌（C）組以及同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組（D）真菌Chao1值均逐漸升高。10 d時接種枯草芽孢桿菌Ya-1組、接種辣椒枯萎病菌、同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Chao1值均與對照無顯著差異，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組與接種辣椒枯萎病菌組Chao1值之間也無顯著差異；20 d時接種枯草芽孢桿菌Ya-1組Chao1值均與對照無顯著差異，接種辣椒枯萎病菌、同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Chao1值顯著高于對照，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組Chao1值顯著高于接種辣椒枯萎病菌組。

2.3 枯草芽孢桿菌Ya-1對辣椒根際真菌群落組成的影響

在門分類水平上，子囊菌門（Ascomycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）在每個接種時間點處理組和對照組土壤樣品中均占據(jù)真菌群落的優(yōu)勢地位，其相對豐度在36.58%-74.11%，如圖1。其中子囊菌門（Ascomycota）在所有處理中均屬于優(yōu)勢菌群（相對豐度＞4%）。在第10天時，子囊菌門（Ascomycota）在對照組土壤樣品中的相對豐度最低，在接種辣椒枯萎病菌組土壤樣品中相對豐度最高（28.79%，66.53%）；20 d時，子囊菌門（Ascomycota）在接種枯草芽孢桿菌Ya-1組土壤樣品中的相對豐度最低，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品中相對豐度最高（26.03%，60.39%）。在10 d時，捕蟲霉門（Zoopagomycota）在接種辣椒枯萎病菌組土壤樣品中相對豐度最低，接種枯草芽孢桿菌Ya-1組處理土壤樣品中相對豐度最高（3.71%，10.09%）；20 d時，捕蟲霉門（Zoopagomycota）在同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌組相對豐度最低，對照組土壤樣品中的相對豐度最高（2.40%，10.70%）。在10 d時，擔子菌門（Basidiomycota）在接種病原菌處理土壤樣品中相對豐度最低，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌組土壤樣品中相對豐度最高（2.98%，4.31%）；20 d時，擔子菌門（Basidiomycota）在接種辣椒枯萎病菌組土壤樣品中相對豐度最低，接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理土壤樣品中相對豐度最高（5.09%，6.20%）。

圖1 門分類水平上辣椒根際土壤真菌優(yōu)勢種群Fig.1 Dominant fungal population of pepper rhizosphere soil at phylum level

進一步將接種后10 d和20 d的top10真菌屬進行了組間差異分析，發(fā)現(xiàn)不同處理之間優(yōu)勢菌屬群落發(fā)生顯著變化（圖2）。在10 d時，與對照相比，接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理土壤樣品中被孢霉菌（Mortierella）的相對豐度顯著升高（P＜0.05），Boothiomyces、周刺座霉屬（Volutella）的相對豐度顯著降低（P＜0.05）；接種辣椒枯萎病原菌處理土壤樣品中鐮刀霉（Fusarium）、木霉屬（Trichoderma）的相對豐度顯著升高（P＜0.05），Boothiomyces、周刺座霉屬（Volutella）的相對豐度顯著降低（P＜0.05）；其他組對比均無顯著差異。與接種辣椒枯萎病原菌處理相比，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品中Fusarium的相對豐度顯著降低（P＜0.05），被孢霉菌（Mortierella）的相對豐度升高，但差異不顯著。在20 d時，與對照相比，接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理土壤樣品中top10屬在兩者之間無顯著差異；接種辣椒枯萎病原菌處理土壤樣品中鐮刀菌屬（Fusarium）、木霉菌屬（Trichoderma）的相對豐度顯著升高（P＜0.05）；其他組對比均無顯著差異。與接種辣椒枯萎病原菌處理相比，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品中的被孢霉菌（Mortierella）的相對豐度顯著升高（P＜0.05）。

圖2 辣椒接種10 d和20 d相對豐度最高的10個真菌屬Fig.2 Top 10 fungi genera with the highest relative abundance at 10 d and 20 d

對篩選的相對豐度為1%以上的OTU進行鑒定分析，OTU_1經(jīng)過NCBI鑒定為病原菌F.oxysporum，其序列與接種病原菌序列相似度在97%以上，在不同處理相對豐度如圖3。在10 d和20 d同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品中OTU_1相對豐度顯著高于接種辣椒枯萎病原菌處理（P ＜ 0.05）；同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌處理土壤樣品在10 d時相對豐度顯著高于20 d。

圖3 OTU_1總相對豐度Fig. 3 Total relative abundance of OTU_1

2.4 辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

利用基于 Bray_Curtis距離算法 PCoA 分析對辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明，接種不同時間點土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)存在差異，PCoA1和PCoA2共解釋了29.7%的變異，其中第一軸和第二軸分別解釋了22.8%和6.9%的變異（圖4）?；?Bray_curtis 算法的相似性分析（ANOSIM）結(jié)果，0 d與10 d、20 d根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)間具有顯著差異（R=0.3198，P=0.001；R=0.2697，P=0.031），10 d和20 d之間差異不顯著（R=0.0281，P=0.143）（表3）?；贐ray_curtis 算法的非參數(shù)多元統(tǒng)計檢驗（MRPP和PERMANOVA）與上述結(jié)果一致。

圖4 辣椒不同時期不同處理根際間真菌群落主坐標分析Fig.4 PCoA analysis of fungal community in pepper rhizosphere at different time points under different treatments

表3 不同時期兩組間辣椒根際真菌群落相異性分析Table 3 Dissimilarity test of pepper rhizosphere soil fungal community between two groups at different time points

基于 Bray_curtis 算法的相似性分析（ANOSIM）可知，在10 d時，接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液處理、接種辣椒枯萎病菌處理和同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液和辣椒枯萎病菌處理與對照處理的根際真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（R=0.432，P=0.011；R=1，P=0.009；R=0.996，P=0.015）；接種辣椒枯萎病菌處理和同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液和辣椒枯萎病菌處理根際真菌群落結(jié)構(gòu)也具有顯著差異（R=1，P=0.006）。在20 d時，接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液處理、接種辣椒枯萎病菌處理、同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1發(fā)酵液與辣椒枯萎病菌處理與對照處理的根際真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（R=0.256，P=0.029；R=0.528，P=0.01；R=0.684，P=0.01）。接種辣椒枯萎病菌處理和同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌處理根際真菌群落結(jié)構(gòu)也具有顯著差異（R=0.604，P=0.007）。此外，基于Bray_curtis 算法的非參數(shù)多元統(tǒng)計檢驗（MRPP和PERMANOVA）進一步表明驗證了上述處理之間的差異（表4）。

表4 不同時間點不同處理間辣椒根際真菌群落相異性分析Table 4 Dissimilarity analysis of pepper rhizosphere soil fungal community at different time points among different treatments

2.5 分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

基于不同時期土壤樣品500個OTU進行分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，采用快速模塊化優(yōu)化方法對模塊進行識別，構(gòu)建的真菌群落系統(tǒng)發(fā)育分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)（pMENs）顯示了OTUs之間的相互作用（表5，圖5）。處理組和對照組的節(jié)點和連接數(shù)分別為：A（290，443）、B（292，416）、C（311，406）和D（309，346）。其中，對照組土壤樣品擁有最少的節(jié)點數(shù)和最多的連接數(shù)。4個處理的真菌網(wǎng)絡(luò)均以正相關(guān)關(guān)系為主（A：77.20%，B：60.10%，C：61.58%，D：54.05%），相比較對照，其他三組的正連接比例更低；相比較接種辣椒枯萎病菌處理，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理的正連接比例更低。接種枯草芽孢桿菌Ya-1和接種辣椒枯萎病菌處理的平均度低于對照；同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理的平均度低于接種辣椒枯萎病菌處理。

表5 不同處理下真菌種群的經(jīng)驗網(wǎng)絡(luò)和隨機網(wǎng)絡(luò)性質(zhì)Table 5 Empirical network and random network properties of fungal populations under different treatments

同時分析4個處理的經(jīng)驗網(wǎng)絡(luò)，相比較對照，接種枯草芽孢桿菌Ya-1和接種辣椒枯萎病菌處理的平均路徑距離、平均聚類系數(shù)和模塊化值更高；相比較接種辣椒枯萎病菌處理，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理的平均聚類系數(shù)更低，平均路徑距離和模塊化值更高（表5）。對隨機網(wǎng)絡(luò)進行分析，相比較對照，接種枯草芽孢桿菌Ya-1組和接種辣椒枯萎病菌處理的平均聚類系數(shù)更低，平均路徑距離和模塊化值更高；相比較接種辣椒枯萎病菌處理，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理的平均聚類系數(shù)更低，平均路徑距離、模塊化值更高（表5）。

3 討論

辣椒枯萎病是由尖孢鐮刀菌侵染引起的一類頑固性土傳病害，梁建根等［26］研究表明，生防菌株B-3枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis的發(fā)酵液及其濾液對辣椒枯萎病的盆栽與大田試驗的防效分別為73.6%和64.8%，顯著優(yōu)于100 mg/L多菌靈，對辣椒枯萎病菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用。郭珺等［11］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌Pb-4菌株對辣椒、番茄、黃瓜枯萎病及辣椒疫霉病等具有較好的防效。本研究中與單獨接種辣椒枯萎病菌的處理（C）相比，復合接種的Ya-1+FOC處理（D）在10 d和20 d的防治效果分別為77.93%和77.26%（表1），表明枯草芽孢桿菌Ya-1 對辣椒枯萎病同樣具有較好的防治效果。其盆栽防效甚至高于梁建根等［26］對生防枯草芽孢桿菌B-3的報道。究其因可能與不同來源的菌株活性差異、對周圍生物和非生物環(huán)境等的影響，尤其是土壤微生物組的影響有關(guān)。

土壤微生物組在調(diào)控植物生長、抗逆、抗病等方面起重要作用，微生物組受植物種類以及植物生長狀態(tài)影響［27-28］。受到生物和非生物脅迫后，植物可通過調(diào)整根際微生物組而緩解脅迫所造成的危害［29］。本研究中，接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理組和對照真菌香農(nóng)指數(shù)均先升高后降低，而接種辣椒枯萎病菌組先降低后升高，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組真菌香農(nóng)指數(shù)均逐漸降低，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病菌組真菌α多樣性在10 d和20 d時真菌香農(nóng)指數(shù)均高于接種辣椒枯萎病菌組，該結(jié)果表明單獨接種枯草芽孢桿菌Ya-1處理對真菌α多樣性指數(shù)的影響較小，在接種辣椒枯萎病菌后同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1能有效降低根際真菌α多樣性。

核心微生物組是影響植物生長、穩(wěn)定微生物組的關(guān)鍵組成，只有改變核心微生物組，才能徹底改變根際微生物組的群落結(jié)構(gòu)［27］。芽孢桿菌作為一類有益微生物菌群，可以產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，抑制病原菌的生長，提高植物的抗病能力，有些芽孢桿菌具有解磷、固氮和產(chǎn)生植物激素的能力，通過改變微生物組的結(jié)構(gòu)可影響植物的生長和抗逆性［11,13,15］。Qiao等［30］研究發(fā)現(xiàn)，外源施用生防枯草芽孢桿菌可以短暫改變番茄根際微生物組。樊祖清等［31］研究表明，施用解淀粉芽孢桿菌菌劑改善了煙田土壤微生物結(jié)構(gòu)，增加了有益菌數(shù)量，尤其是鞘氨醇單胞菌屬的數(shù)量，促進煙株吸收根際土壤營養(yǎng)、釋放根際分泌物。本研究發(fā)現(xiàn)相比較接種辣椒枯萎病菌組，同時接種辣椒枯萎病菌和枯草芽孢桿菌Ya-1組中被孢霉屬相對豐度均升高，而被孢霉屬其中一些有益菌可能與植物形成共生關(guān)系［32-33］，對于改善土壤性質(zhì)、促進植物的生長起一定的作用，該結(jié)果表明在辣椒枯萎病發(fā)病后添加枯草芽孢桿菌Ya-1后提高了土壤中有益菌數(shù)量。本研究在辣椒枯萎病病原菌Fusarium oxysporum和生防菌枯草芽孢桿菌Ya-1處理 10 d和20 d 后分析了辣椒根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)接種外源菌株處理后對根際微生物的結(jié)構(gòu)影響較大。通過基于Bray-Curtis距離對不同處理的辣椒根際土壤真菌群落組成進行PCoA分析，發(fā)現(xiàn)接種前處理和接種10 d、20 d處理真菌群落組成距離較遠，接種10 d、20 d相聚較近，同時相異性分析也展示相同的結(jié)果，該結(jié)果表明在進行處理后真菌群落組成發(fā)生了顯著變化，但是接種10 d、20 d樣品整體差異較小。分別比較接種10 d和20 d處理組和對照組真菌群落，同一時間點處理組和對照組真菌群落具有顯著差異，接種辣椒枯萎病菌組和同時接種辣椒枯萎病菌和枯草芽孢桿菌Ya-1組也具有顯著差異，該結(jié)果表明接種辣椒枯萎病菌組和枯草芽孢桿菌Ya-1均能改變辣椒根際真菌群落，而在接種辣椒枯萎病原菌后接種枯草芽孢桿菌Ya-1也改變了接種辣椒枯萎病菌組辣椒根際真菌群落。

對不同處理根際土壤真菌群落結(jié)果分析表明，在該試驗中，各處理土壤優(yōu)勢種群分別為子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）。與單接辣椒枯萎病菌相比，同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和病原菌在10 d時均提高了捕蟲霉門（Zoopagomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度，降低了子囊菌門（Ascomycota）的相對豐度；在20 d時，提高了子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度，降低了捕蟲霉門（Zoopagomycota）的相對豐度。子囊菌門是主要優(yōu)勢菌門，有研究表明子囊菌門引起植物病害，多引起根腐、莖腐、果（穗）腐、枝枯和葉斑等癥狀［34］，在該試驗中不同處理子囊菌門相對豐度為26.03%-66.53%，占主導地位。擔子菌多為土壤腐生真菌, 在土壤木質(zhì)素含量較高的環(huán)境中為優(yōu)勢菌, 是復雜化合物及有機質(zhì)的重要分解者，在養(yǎng)分循環(huán)中擔任著重要角色［35-36］。擔子菌可高效分解木質(zhì)化植被碎屑，其滑銹傘屬（Hebeloma）、絲膜菌屬（Cortinarius）可與植物共生形成菌根，增強植株抗性［37-38］。

尖孢鐮刀菌是最重要的植物病原真菌之一，可引起多種植物發(fā)生病害［39-41］，同時也是引發(fā)辣椒枯萎病的病原菌。本研究中，相比較對照（A），接種辣椒枯萎病菌處理（C）后連接數(shù)減少，而在加入枯草芽孢桿菌Ya-1處理后，節(jié)點數(shù)變化較小，但是正連接數(shù)降低，表明同時接種枯草芽孢桿菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌處理（D）降低了真菌群落的復雜度。同時在10 d和20 d，OTU_1（NCBI鑒定為本實驗接種病原菌菌F.oxysporum）相對豐度在接種辣椒枯萎病原菌組和同時接種辣椒枯萎病菌組和枯草芽孢桿菌Ya-1組間具有顯著差異，相比較接種辣椒枯萎病原菌組，OTU_1相對豐度在10 d和20 d時分別降低了19.03%和6.99%，該結(jié)果表明同時在接種辣椒枯萎病菌組后接種枯草芽孢桿菌Ya-1顯著降低了根際土壤中病原菌F.oxysporum的相對豐度，并且在10 d時效果更加顯著。表明施枯草芽孢桿菌菌劑后有益真菌比例增加，病原菌比例減少，驅(qū)動了真菌群落的生態(tài)演替，降低了真菌群落多樣性，進而導致土壤中鐮刀菌豐度顯著下降，有效防控辣椒枯萎病發(fā)生。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌Ya-1處理對辣椒枯萎病有較好的防治效果，同時它也改變了接種病原菌辣椒根際真菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)，降低了真菌群落的復雜度和根際土壤中病原菌的豐度。