王騰輝 葛雯冬 羅雅方 范震宇 王玉書，2

（1.齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院，齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室，齊齊哈爾 161006）

羽衣甘藍（Brassica oleracea L.var.acephala DC）為十字花科蕓薹屬甘藍種的變種，外葉綠色為主要功能葉，心葉有紫紅、紅色、粉色和乳白色等多種顏色，為主要觀賞葉，因其較高的營養(yǎng)價值和獨特的觀賞性成為賞食兼用的作物。大部分十字花科植物葉色性狀屬于質(zhì)量性狀遺傳。研究葉色的遺傳模式和葉色形成的關(guān)鍵基因，對羽衣甘藍新品種的選育具有重要的理論意義。

孫日飛等［1］研究發(fā)現(xiàn)大白菜紫葉性狀是由一對顯性基因控制。甘藍型油菜紫葉性狀則由不完全顯性核基因控制［2］。但紫菜薹紫色葉色卻是數(shù)量性狀，主效QTL區(qū)間內(nèi)編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的2個基因BrEGL3.1和BrEGL3.2被鑒定為控制葉色的關(guān)鍵基因［3］。Zhu等［4］通過側(cè)翼標記對羽衣甘藍粉葉基因進行錨定，同時，利用甘藍基因組信息，將Pi定位在C03染色體的頂端。白菜A07染色體上的R2R3-MYB調(diào)控基因BrMYB2，其缺失較多的短內(nèi)含子促進一些結(jié)構(gòu)基因的高轉(zhuǎn)錄是導致出現(xiàn)紫色表型的原因［5］。葉綠素的缺少是導致葉片白化的主要原因［6］。植物白色葉片形成往往受環(huán)境因素影響，如在自然光照下，白茶突變體‘Huangjinju’葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象，當處于低強度光照條件，葉片又會返綠［7］；大麥白化突變體‘SLTW’在低溫誘導后，于5葉期葉片開始出現(xiàn)白化現(xiàn)象，當溫度升高，白化葉片開始轉(zhuǎn)綠，直至恢復正常葉色［8］。而羽衣甘藍白色系品種外葉表現(xiàn)為綠色，僅心葉表現(xiàn)為白色，近年來，基因組測序技術(shù)的進步和成本的降低，加快了一些非模式生物的參考基因組組裝。基于全基因組重測序的BSA方法，在無須構(gòu)建遺傳圖譜的情況下，可以高效挖掘目標基因，BSA-Seq技術(shù)也從模式物種拓展到了非模式物種，在許多作物中得到了廣泛的應用。

目前，利用BSA-Seq方法已成功定位出黃瓜早花［9］、番茄果重［10］、甘藍型油菜有限花序［11］、茄子萼下果色［12］、豌豆花色［13］等基因。但在羽衣甘藍中的應用報道較少。

本研究利用白色心葉DH系‘WB’和紅葉DH系‘WR’雜交構(gòu)建F2代分離群體，通過對親本和2個子代混合池進行BSA-Seq全基因組重測序，定位與白葉性狀顯著關(guān)聯(lián)的區(qū)域，并通過分子生物信息學方法篩選候選基因，旨在篩選羽衣甘藍葉色形成相關(guān)的基因與位點，為羽衣甘藍新品種選育及分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羽衣甘藍親本白色心葉DH系‘WB’和紅葉DH系‘WR’為小孢子培養(yǎng)獲得的DH純系。以‘WR’為母本、‘WB’為父本雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2代種子，秋季在溫室種植F2代，于觀賞期觀察記錄每個F2單株的心葉顏色。利用卡方檢驗對羽衣甘藍心葉顏色性狀的遺傳分析進行檢驗。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及混池的構(gòu)建 從F2群體中挑選20個紅葉F2單株和20個白葉F2單株，構(gòu)建成2個混合池，命名為R和B，取幼嫩植株葉片，利用QIAGEN植物DNA提取試劑盒提取DNA，等量混合構(gòu)成2個親本混池和2個子代混池，委托上海伯豪生物科技有限公司完成測序分析。利用DNA超聲波粉碎成插入長度為350 bp的片段，雙端處理文庫質(zhì)檢合格后，用Illunima HiSeq進行測序，2個親本和2個混合池的測序深度分別為20×和50×。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)處理 利用Trimmomatic軟件［14］將原始測序序列Raw Reads中的接頭和低質(zhì)量序列去除，再運用BWA軟件［15］比對甘藍參考基因組（https://brassicadb.org/brad/datasets/pub/Genomes/Brassica_oleracea/V1.1/）。采用GATKv3.6.0［16］軟件進行SNP和InDel標記的檢測。使用VariantFiltration進行過濾，并利用ANNOVAR［17］軟件對變異位點在基因組上的位置區(qū)域進行注釋。

1.2.3 SNP-index計算 基于基因分型的結(jié)果，篩選親本間純合差異的多態(tài)性位點。以親本互為參照，計算2個子代混合池在每個多態(tài)性位點上的SNP頻率（SNP-index）［18］。為減少測序錯誤和比對錯誤造成的影響，將計算出2個子代中SNP-index都小于0.3且SNP深度都小于7的位點及1個子代SNP-index缺失的位點過濾掉。同時，計算2個子代池中SNP-index的差值，作ΔSNP-index。

1.2.4 目的基因的篩選與功能注釋 選擇2 Mb為滑窗、50 kb為步長，對△SNP-index在各染色體上的分布進行作圖，選取99%置信水平作為篩選的閾值，超出置信水平的窗口作為候選區(qū)間，把候選區(qū)間的SNP位點所在的基因篩選出來進行注釋。利用Blast軟件對候選區(qū)間鑒定的基因進行GO（gene ontology）數(shù)據(jù)庫注釋，從而對候選基因進行篩選和功能預測。

2 結(jié)果

2.1 心葉顏色性狀的遺傳分析

羽衣甘藍心葉顏色各世代分離鑒定統(tǒng)計如表1所示，以WR為母本，WB為父本的F1代均表現(xiàn)心葉紅色，F(xiàn)2分離群體中紅色心葉和白色心葉分離比例經(jīng)卡方測驗符合3∶1的孟德爾分離比例（χ2=0.20＜χ20.05=3.84）。遺傳規(guī)律分析表明，羽衣甘藍白色心葉相對于紅色為隱性性狀。

表1 ‘WR’和‘WB’雜交組合后代分離比例Table 1 Segregation of the crosses between ‘WR’ and ‘WB’ in progeny populations

2.2 測序質(zhì)量評估與分析

對20株白葉F2單株和20株紅葉F2單株構(gòu)建的混合池，以及兩親本開展全基因組重測序（表2），共獲得150.00 G的原始數(shù)據(jù)，過濾后，4個樣本的Clean Data在18 125.99-54 943.91 M，總數(shù)據(jù)量為144.24 G。平均每個樣品覆蓋深度在55.16×，基因組平均覆蓋度為89.65%，測序數(shù)據(jù)有95.09%-95.90%以上的序列可以成功比對參考基因組，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高（Q20≥97.81%），說明所有樣本測序質(zhì)量合格，數(shù)據(jù)比對率高，有利于后續(xù)的變異檢測及性狀的基因定位。

表2 不同樣品測序比對結(jié)果Table 2 Sequencing comparison results of different samples

2.3 SNP檢測和注釋

根據(jù)測序結(jié)果進行SNP位點分析（表3），4個樣本中，紅葉親本‘WR’中最少，為964 912個，白葉混合池中數(shù)量最多，為1 021 699個。4個樣本之間，同一類型的SNP數(shù)量和比例大致相當。所有SNP變異的位置信息包括7種類型，其中，以位于基因區(qū)間的SNP位點最多，其次是非同義突變、同義突變、終止子獲得、終止密碼子丟失，剩余的起始密碼子丟失、5′非翻譯區(qū)類型的SNP較少。

表3 變異位點注釋統(tǒng)計表Table 3 Annotation of variation sites

2.4 BSA分析與候選區(qū)域的篩選

統(tǒng)計2個極端子代混池SNP-index在染色體上的分布情況，計算2個子代混池的△SNP-index，當置信度為99%時，分布于羽衣甘藍3條染色體的8個區(qū)域出現(xiàn)了超過臨界值水平的極顯著峰（圖1）。顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間分布在羽衣甘藍Chr.2：35.10-37.05 Mb、Chr.3：51.60-52.80 Mb、Chr.9：5.85-7.85 Mb、Chr.9：9.15-10.60 Mb、Chr.9：11.90-21.65 Mb、Chr.9：22.00-24.25 Mb、Chr.9：28.10-33.05 Mb和Chr.9：33.25-35.35 Mb。這些顯著關(guān)聯(lián)區(qū)間覆蓋的染色體長度為1.2-9.75 Mb，8個關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)共包含510個基因（表4）。其中，第9染色體上SNP的富集程度顯著高于其他染色體，且Chr.9：11.90-21.65 Mb和Chr.9：22.00-24.25 Mb兩個關(guān)聯(lián)區(qū)間頂點峰值最高，暗示這兩個區(qū)間內(nèi)可能具有調(diào)控羽衣甘藍心葉顏色的關(guān)鍵基因。

圖1 所有染色體的△SNP-index圖Fig.1 △SNP-index map of all chromosomes

表4 SNP位點關(guān)聯(lián)分析獲得的關(guān)聯(lián)區(qū)域Table 4 Correlation regions obtained by SNP correlation analysis methods

2.5 候選基因注釋與功能分析

結(jié)合BRAD數(shù)據(jù)庫中注釋信息，2個候選區(qū)段內(nèi)預測到172個有注釋的基因，其中94個基因注釋到GO數(shù)據(jù)庫的21個功能組中（圖2），包括8個生物學進程、7個細胞組分和6個分子功能，在生物學進程中，這些基因主要參與代謝過程、細胞過程、單一有機體、定位等生物學過程；在細胞成分中，這些基因主要集中在膜、細胞、細胞組分、細胞器等成分；在分子功能中，這些基因主要參與結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運活性等功能。

圖2 候選基因GO富集分析Fig.2 GO enrichment of the candidate genes

根據(jù)數(shù)據(jù)庫中詳細注釋信息進一步篩選與目標性狀相關(guān)的基因，共得到8個與羽衣甘藍白葉形成有關(guān)的基因（表5）。Bol005195編碼的葉綠體ATP合酶δ亞基為光合作用必須蛋白。Bol030253為五肽重復序列超家族蛋白（pentatricopeptide repeat（PPR）superfamily protein），通過基因注釋及同源性比較，發(fā)現(xiàn)該基因可能編碼葉綠體蛋白。Bol030286編碼葉綠體膜整合金屬蛋白酶FtsH11。以上3個基因編碼的葉綠體蛋白穩(wěn)態(tài)對葉綠體維持正常功能十分重要。Bol030235為β-類胡蘿卜素羥化酶2（BETA CAROTENOID HYDROXYLASE 2, CYH, BCH2）基因，通過隱黃質(zhì)將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)。Bol012077、Bol1012077、Bol029431和Bol030318為跨膜蛋白（transmembrane protein）基因，具有跨膜轉(zhuǎn)運作用，推測這4個基因在葉綠素的跨膜轉(zhuǎn)運中發(fā)揮作用。

表5 候選基因功能注釋Table 5 Functional annotation of candidate genes

3 討論

自然界中，大多數(shù)植物葉子都是綠色的，葉綠素可以吸收藍紫色和紅橙光并將光能轉(zhuǎn)化為化學能。一些植物會長出白色葉子，研究證明白色的葉子或苞片可以用來吸引傳粉者，白葉的特殊功能可能增強植物的生殖適合性［19-20］。羽衣甘藍白色葉的形成機制很少被研究。本研究以2個不同葉色材料為親本構(gòu)建了BSA-Seq群體，利用測序獲得的SNP進行關(guān)聯(lián)分析，獲得候選區(qū)段，對控制羽衣甘藍白色心葉的基因進行分析。2個候選區(qū)域內(nèi)，共有172個具有注釋信息的基因，根據(jù)注釋及同源性比對信息共篩選出8個候選基因。

光合色素合成的場所為葉綠體，因此葉綠體的結(jié)構(gòu)和發(fā)育情況直接影響光合色素的合成，進而影響葉色。Bol005195（AtpD）編碼葉綠體atp酶δ亞基，進而影響葉綠體合成酶的豐度和活性，Maiwald等［21］發(fā)現(xiàn)擬南芥AtpD-1突變體溫室生長表現(xiàn)為色素缺乏，通過回補試驗，恢復了野生型葉片顏色，表明AtpD-1的表型是由于缺乏AtpD功能所致，AtpD的產(chǎn)物對葉綠素合成十分必要。Bol030253編碼的五肽重復序列蛋白是一種退化的35個氨基酸重復基序，葉綠體中的PPR蛋白通過影響葉綠體的發(fā)育調(diào)控植物的葉色變化［22］。Liu等［23］研究發(fā)現(xiàn)玉米PPR26突變體出現(xiàn)葉綠素缺乏、淡綠甚至白化致死。劉勝坤等［24］證明玉米突變體74101的黃葉表型由定位于細胞核中的ZmNPPR5控制。Bol030286編碼膜結(jié)合蛋白酶FtsH11，擬南芥中同源的FtsH11亞細胞定位在葉綠體包膜內(nèi)，被認為是線粒體和葉綠體的雙重靶標，F(xiàn)tsH11在長光周期生長期間對葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，F(xiàn)tsH11突變體在長日或連續(xù)光照下生長中出現(xiàn)到褪綠變白的表型［25］。Bol030235為β-類胡蘿卜素羥化酶2基因，β-胡蘿卜素羥基化是類胡蘿卜素生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)步驟。AcBCH1沉默表達的獼猴桃中，玉米黃質(zhì)、葉黃素和β-隱黃質(zhì)含量降低，β-胡蘿卜素含量增加，而轉(zhuǎn)基因獼猴桃幼苗中，β-胡蘿卜素含量降低［26］。CHY沉默的馬鈴薯塊莖中，β-胡蘿卜素增加了38倍，總類胡蘿卜素增加了4.5倍，而β-胡蘿卜素羥基化的直接產(chǎn)物玉米黃質(zhì)隨之減少［27］。以上4個基因與葉綠體結(jié)構(gòu)和光合色素的形成有關(guān)，因此，推測參與白色葉形成?？缒さ鞍卓梢詥为毣蛘吲c其他蛋白組成跨膜蛋白復合體一起執(zhí)行轉(zhuǎn)運功能，一些跨膜蛋白參與了脂肪、碳、維生素及一些色素的代謝過程［28］。本研究中共鑒定出4個跨膜蛋白基因Bol012077、Bol007709、Bol029431和Bol030318，可能對葉綠素分子的轉(zhuǎn)運產(chǎn)生影響，從而影響葉色。

白色葉片的形成和發(fā)育是一個復雜的生理過程，目前尚缺乏系統(tǒng)全面的研究，本研究通過基于全基因組重測序的BSA分析尋找到了一些與白葉形成相關(guān)的基因，對于這些基因是否是白色葉片形成的關(guān)鍵基因，以及如何調(diào)控葉色的形成將在后續(xù)工作中通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)進行功能驗證。

4 結(jié)論

羽衣甘藍白色心葉相對于紅色為隱性性狀。所有SNP變異的位置信息包括7種類型，其中，以位于基因區(qū)間的SNP位點最多。Chr.9：11.90-21.65 Mb和Chr.9：22.00-24.25 Mb區(qū)間內(nèi)可能具有調(diào)控羽衣甘藍心葉顏色的關(guān)鍵基因。進一步篩選獲得8個與羽衣甘藍白葉形成有關(guān)的基因，分別為Bol030253、Bol029431、Bol012077、Bol007709、Bol030318、Bol030235、Bol030286和Bol005195。