徐發(fā)迪 徐康 孫東明 李萌蕾 趙建志，2 鮑曉明

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院 生物基材料與綠色造紙國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353；2.山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（微生物技術(shù)研究院），青島 266237）

全球農(nóng)林生物質(zhì)棄物儲(chǔ)量巨大，以此為原料通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇，并實(shí)現(xiàn)替代部分車(chē)用汽油的目的，由于乙醇汽油的特性，使其成為近30年來(lái)新型能源研發(fā)的重要內(nèi)容［1］。根據(jù)生產(chǎn)原料的類(lèi)型區(qū)分，燃料乙醇生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展主要經(jīng)歷了以糖質(zhì)和糧食作物為原料的一代燃料乙醇，以農(nóng)林廢棄植物纖維為原料的二代燃料乙醇和以藻類(lèi)等綠色植物為原料的三代燃料乙醇［2］。由于日益嚴(yán)重的世界糧食危機(jī)問(wèn)題，我國(guó)政府已限制了一代燃料乙醇的發(fā)展規(guī)模，第三代燃料乙醇正處于研發(fā)起步階段［3］。而具備產(chǎn)業(yè)化示范的第二代燃料乙醇生產(chǎn)技術(shù)，對(duì)于保護(hù)糧食安全和緩解能源危機(jī)具有巨大的意義。二代燃料乙醇的原料種類(lèi)豐富，農(nóng)作物秸稈、枯草、林木枝椏等儲(chǔ)量巨大的農(nóng)林棄物均可利用［4-12］，可保證生物乙醇的可持續(xù)發(fā)展。現(xiàn)階段研究應(yīng)用多集中于秸稈類(lèi)生物質(zhì)，而對(duì)楊木生物質(zhì)的二代燃料乙醇技術(shù)研究相對(duì)較少。

楊木（Populas.sp）屬于硬木，纖維結(jié)構(gòu)相對(duì)疏松，是生長(zhǎng)最快的喬木之一。作為速生豐產(chǎn)樹(shù)種，在全世界被廣泛種植。而隨著現(xiàn)代育種技術(shù)的發(fā)展，使楊木品種更加適應(yīng)全球不同地區(qū)的環(huán)境，而且優(yōu)化了楊木在工業(yè)中的應(yīng)用特性［13］。中國(guó)處于世界的楊木種植中心，如今在全國(guó)各地分布已超600萬(wàn)hm2，楊樹(shù)人工林面積居世界之首。同時(shí)楊樹(shù)植伐周期短，應(yīng)用廣泛，每年產(chǎn)生大量的枝椏材和加工業(yè)棄料，是能夠支撐二代燃料乙醇穩(wěn)定生產(chǎn)的理想原料之一。燃料乙醇的基本生產(chǎn)工藝主要包括降低原料粒度、破壞纖維素內(nèi)在結(jié)構(gòu)的理化因子的預(yù)處理、釋放單糖的酶解糖化、產(chǎn)生乙醇的微生物發(fā)酵、乙醇脫水的蒸餾工藝等步驟［14］。木質(zhì)纖維素是由纖維素（cellulose）、半纖維素（hemicellulose）和木質(zhì)素（lignin）三大基本組分構(gòu)成。預(yù)處理的目的是破壞纖維素內(nèi)在結(jié)構(gòu)，提高木質(zhì)纖維素底物的可及度。酶解糖化過(guò)程是將原料中保留的纖維素和半纖維素降解成可發(fā)酵性單糖，利用高固底物酶解技術(shù)，獲得工業(yè)化生產(chǎn)中所需要的高糖濃度水解液。發(fā)酵反應(yīng)是以可發(fā)酵性單糖（葡萄糖、木糖）為底物，在發(fā)酵微生物的代謝作用下高效利用底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇。而由于原料的不同，每個(gè)具體工藝環(huán)節(jié)上也存在著不同的技術(shù)差異和困難［15］，為了克服這些困難，精準(zhǔn)構(gòu)建不同原料的二代燃料乙醇生產(chǎn)工藝是當(dāng)前的主攻方向。本文綜述了以楊木為原料的二代燃料乙醇預(yù)處理、酶解和發(fā)酵的研究現(xiàn)狀及所面臨的困難。

1 楊木的組成特點(diǎn)

植物的主要生化成分是木質(zhì)纖維素，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，在植物細(xì)胞壁內(nèi)形成復(fù)合體，對(duì)植物起保護(hù)作用［16］；還有來(lái)自細(xì)胞質(zhì)內(nèi)部的非結(jié)構(gòu)性生物化學(xué)成分，無(wú)機(jī)元素等。楊木生物質(zhì)具有較高的纖維素含量，適中的半纖維素含量，灰分、淀粉和提取物等含量較低，這些特性使它成為生產(chǎn)燃料乙醇的理想原料之一［17］。表1顯示了不同木質(zhì)纖維素原料三大組分的比例差異，而且不同原料在具體結(jié)構(gòu)上也具有不同的組成特點(diǎn)。

表1 不同木質(zhì)纖維素原料組成成分含量Table 1 Contents of different lignocellulose raw material components

1.1 纖維素

纖維素是一種通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接吡喃葡萄糖，以平行束排列的線性聚合物，其分支較少，分子內(nèi)和分子間的氫鍵穩(wěn)定，不容易裂解釋放出單糖。即便如此，長(zhǎng)期以來(lái)科研人員為利用纖維素，開(kāi)展了大量的研究工作，利用預(yù)處理配合纖維素酶解工藝能夠有效提高纖維素的解聚糖化效率，為木質(zhì)纖維素的工業(yè)化應(yīng)用鋪墊了道路［21］。而且對(duì)比草本類(lèi)和秸稈類(lèi)原料，楊木中纖維素含量占比較高，達(dá)到干物質(zhì)量的40%以上。較高的纖維素含量意味著能夠提供更多的葡萄糖，從而使相同質(zhì)量的楊木原料比其他木質(zhì)纖維素原料在水解后能夠提供更高的葡萄糖濃度。

1.2 半纖維素

半纖維素是一種由戊糖（木糖、阿拉伯糖）和己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）組成的異質(zhì)聚合物，結(jié)合在纖維素微纖維的表面以氫鍵相互連接，在纖維素葡聚糖束表面形成一層“鞘”狀結(jié)構(gòu)，能夠阻礙酶與纖維素的結(jié)合［22］。由于半纖維素結(jié)構(gòu)中復(fù)雜的糖組分，使其在水解后很難被充分利用。例如，玉米纖維的半纖維素結(jié)構(gòu)中含有大量的阿拉伯糖，而阿拉伯糖轉(zhuǎn)化乙醇的途徑還未有較大進(jìn)展。然而楊木的半纖維素幾乎只含有O-乙酰基-4-O-甲基-葡萄糖醛酸基-木聚糖這一種結(jié)構(gòu)單元［23］。對(duì)比秸稈類(lèi)木質(zhì)纖維素原料，其阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等含量極低。雖然野生型發(fā)酵微生物不能利用戊糖，但現(xiàn)如今重組釀酒酵母菌株已經(jīng)具備葡萄糖與木糖的高效共同發(fā)酵能力，因此較低的阿拉伯糖含量，較高的葡萄糖和木糖含量能夠最大限度增加水解液中可發(fā)酵性糖的總量。但是相比于其他木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，由于楊木半纖維素中的支鏈通常被乙?；〈?，因此楊木原料中乙酰基含量較高，若想充分利用其半纖維素成分，仍需考慮乙?；鶎?duì)后續(xù)酶解和發(fā)酵過(guò)程的影響。

1.3 木質(zhì)素

木質(zhì)素是由苯基丙烷單元（香豆醇、針葉醇和肌醇）形成的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)聚合物，分別有對(duì)羥苯基、紫丁香基和愈創(chuàng)木基3種非晶態(tài)無(wú)序結(jié)構(gòu)，是一種無(wú)定形態(tài)的生物高分子。楊木的木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)單元以愈創(chuàng)木基和紫丁香基為主［24］，相較草本和秸稈類(lèi)原料，其原料中木質(zhì)素占比較高，但木質(zhì)素結(jié)構(gòu)中的對(duì)羥苯基占比較低。由于木質(zhì)素易于與酶發(fā)生非特異性結(jié)合，阻礙纖維素酶對(duì)底物的水解，這一特性使其成為限制木質(zhì)纖維素原料解聚的第一大屏障［25］。因此，“木質(zhì)素優(yōu)先”策略是提高楊木生物質(zhì)酶解效率和減少纖維素酶用量的有效措施之一。

而且目前普遍認(rèn)為，由于二代燃料乙醇的成本問(wèn)題，沒(méi)有木質(zhì)素的高值化利用，根本無(wú)法滿足工業(yè)化的要求。木質(zhì)素本身獨(dú)特的芳香結(jié)構(gòu)決定其在大宗化學(xué)品和精細(xì)化學(xué)品，以及高分子材料、藥物分子或高值燃料等高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［25］。而隨著近年的針對(duì)木質(zhì)素高值化利用的研究中，開(kāi)發(fā)了許多能夠選擇性催化降解的技術(shù)，如熱催化、光催化、電催化和酶催化等，使得木質(zhì)素高值化利用成為現(xiàn)實(shí)［26］。

2 適用于楊木組成特點(diǎn)的預(yù)處理技術(shù)

木質(zhì)素與半纖維素、纖維素之間相互交聯(lián)，形成碳水化合物-木質(zhì)素的復(fù)合體，其結(jié)構(gòu)質(zhì)地堅(jiān)硬且能抵抗酶解，增強(qiáng)了次生細(xì)胞壁的生物和物理抵抗性［22］。預(yù)處理的主要目的是破壞木質(zhì)纖維素堅(jiān)固的物理結(jié)構(gòu)，增加纖維素和半纖維素的可及性，使生物質(zhì)能被充分水解為可發(fā)酵性單糖［27］，進(jìn)而用于纖維素乙醇和纖維素丁醇等清潔能源的生產(chǎn)，圖1顯示了楊木生物質(zhì)燃料乙醇的基本工藝流程。目前基于楊木生物質(zhì)研究的主流預(yù)處理方式主要有：稀酸、蒸汽爆破、稀堿、離子液體以及組合法，如表2所示。

圖1 楊木生物質(zhì)燃料乙醇工藝流程Fig 1 Process flow of poplar biomass fuel ethanol

表2 不同預(yù)處理方式對(duì)比Table 2 Comparison of different preprocessing methods

2.1 稀酸預(yù)處理

稀酸預(yù)處理通常采用低濃度的鹽酸、硫酸、磷酸或乙酸等酸性試劑，在一定的溫度和壓力下對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行處理。稀酸預(yù)處理能夠破壞楊木組分之間的氫鍵，水解半纖維素，利用其對(duì)半纖維素的溶解能力，能夠有效降低木質(zhì)纖維素的結(jié)晶度［28］。而且低濃度酸對(duì)設(shè)備的腐蝕性和危險(xiǎn)性更低，更符合工業(yè)化的要求。由于稀酸預(yù)處理法操作簡(jiǎn)單且成本廉價(jià)，并且能夠有效提高纖維素的酶解效率，是目前比較認(rèn)可的預(yù)處理方法之一。Guo等［29］開(kāi)發(fā)了一種利用稀硫酸預(yù)處理玉米纖維的簡(jiǎn)易工業(yè)化工藝，可回收81.8%的總糖（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖）。但相較于玉米纖維，楊木原料質(zhì)地堅(jiān)硬，木質(zhì)素含量高。本課題組嘗試將楊木進(jìn)行稀酸預(yù)處理，經(jīng)過(guò)預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化后，雖然半纖維素的水解效率較優(yōu)，但纖維素的酶解效率低下（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

2.2 蒸汽爆破預(yù)處理

蒸汽爆破預(yù)處理是在高溫高壓的條件下使液態(tài)水變成氣態(tài)水進(jìn)入原料結(jié)構(gòu)之中，短時(shí)間保溫后迅速降溫減壓使水蒸氣瞬間噴出。此過(guò)程中產(chǎn)生的能量會(huì)對(duì)木質(zhì)纖維素內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成破壞，改變木質(zhì)纖維素本身的結(jié)構(gòu)與化學(xué)構(gòu)成，使其變成疏松的多孔狀并溶出半纖維素。蒸汽爆破對(duì)原料物理結(jié)構(gòu)的破壞比稀酸預(yù)處理更強(qiáng)，并且通過(guò)相應(yīng)的設(shè)備可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)作業(yè)，是一種公認(rèn)的高效節(jié)能的預(yù)處理技術(shù)，可以有效輔助原料組分的分離溶出［30］。Biswas等［31］通過(guò)對(duì)楊木木屑進(jìn)行濕法爆破預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化，得到酶解后的最高總糖產(chǎn)率為76%，并且研究發(fā)現(xiàn)隨著預(yù)處理?xiàng)l件強(qiáng)度的增加，能夠得到更高的葡萄糖糖化率。然而相關(guān)研究證明，過(guò)度的預(yù)處理?xiàng)l件不僅無(wú)法繼續(xù)提高總糖的糖化率，還會(huì)生成更多的糠醛、5-HMF等抑制物［32］，而且蒸汽爆破預(yù)處理仍然無(wú)法解除木質(zhì)素對(duì)酶解過(guò)程的影響。

2.3 稀堿預(yù)處理

木質(zhì)素作為一種對(duì)蛋白質(zhì)具有非特異性結(jié)合能力的物質(zhì)，無(wú)法對(duì)楊木生物質(zhì)實(shí)現(xiàn)較高的酶解效率。為了改善這一現(xiàn)象，采用稀堿預(yù)處理對(duì)原料進(jìn)行“木素先行”的策略。稀堿預(yù)處理主要是利用低濃度的氫氧化鉀、氫氧化鈣或氫氧化鈉等堿性試劑溶解木質(zhì)素和半纖維素，從而破壞木質(zhì)纖維素材料的堅(jiān)固性［33］，而且在預(yù)處理過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生乙酸、糠醛、5-HMF等抑制物。但通過(guò)Bay等［5］研究發(fā)現(xiàn)，氫氧化鈉預(yù)處理雖然能夠破壞木質(zhì)纖維素致密的結(jié)構(gòu)，但木質(zhì)素脫除率較低，半纖維素?fù)p失嚴(yán)重，葡萄糖產(chǎn)率較稀酸預(yù)處理更低，其原因在于稀堿預(yù)處理?xiàng)l件更加溫和，導(dǎo)致對(duì)楊木生物質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞能力較弱，降低了底物對(duì)酶的可及性。

2.4 離子液體預(yù)處理

因存在如何高效脫除木質(zhì)素、提高纖維素保留率、降低預(yù)處理成本等問(wèn)題，可重復(fù)利用的低共熔溶劑成為近年研究的熱點(diǎn)。低共熔溶劑是氫鍵受體和氫鍵供體以一定的化學(xué)計(jì)量比混合而成的。作為一類(lèi)新的離子液體或離子液體類(lèi)似物，具有類(lèi)似離子液體的物理化學(xué)性質(zhì)。皮奇峰等［34］研究發(fā)現(xiàn)，低共熔溶劑對(duì)楊木的木質(zhì)素脫除率大于90%，纖維素保留率大于98%，半纖維素溶解率亦達(dá)到76%。同時(shí)周敏姑等［35］研究發(fā)現(xiàn)，低共熔溶劑能夠有效脫除楊木原料的木質(zhì)素，增加葡萄糖得率，但溶解的半纖維素較難分離與轉(zhuǎn)化，降低了木質(zhì)纖維素原料的全糖共利用率。而提高全糖共利用率，能夠有效降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本。因此尋找高效專(zhuān)一脫除木質(zhì)素的預(yù)處理方法，是執(zhí)行“木素先行”策略的重要前提。

2.5 組合法預(yù)處理

使用單一預(yù)處理方法往往不能達(dá)到理想的預(yù)處理效果，通過(guò)對(duì)兩種及兩種以上預(yù)處理方法進(jìn)行組合，綜合不同預(yù)處理的優(yōu)點(diǎn)，使預(yù)處理效果更為顯著。因此，組合法預(yù)處理方式是解決楊木生物質(zhì)木質(zhì)纖維素解聚的有效方式之一。盡管儲(chǔ)秋露等［36］研究發(fā)現(xiàn)，堿性氧化和堿性磺化結(jié)合蒸汽爆破預(yù)處理后，楊木木質(zhì)素脫除率均達(dá)到50%左右，纖維素和半纖維素回收率比蒸汽爆破預(yù)處理更高，但葡萄糖糖得率仍然較低。Shi等［37］研究發(fā)現(xiàn)，稀酸-稀堿預(yù)處理對(duì)半纖維的水解效果較佳，并能夠脫除部分木質(zhì)素，但其效率低下還伴隨著纖維素的損失。因此，對(duì)于楊木等木質(zhì)素含量高的原料，常規(guī)的預(yù)處理很難達(dá)到理想的木質(zhì)素脫除效果。Wen等［38］研究了基于楊木的乙酸-亞氯酸鈉二步法預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，亞氯酸鈉預(yù)處理可脫除70%以上的木質(zhì)素，保留82%以上的葡聚糖，具有較高的水解葡萄糖產(chǎn)率。相關(guān)研究表明，亞氯酸鈉僅對(duì)木質(zhì)素具有較好的溶解作用，幾乎不溶解纖維素和半纖維素［4］。這種高效且專(zhuān)一的脫木質(zhì)素預(yù)處理，不僅能夠減少原料中木質(zhì)素含量，提高酶解效率，而且能夠最大程度保留原料的糖組分。

綜合各種預(yù)處理方式，本課題組對(duì)楊木生物質(zhì)的亞氯酸鈉預(yù)處理法進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素脫除率達(dá)到70%，葡聚糖和木聚糖的損失均小于5%。預(yù)處理后的楊木三大組分比例發(fā)生了明顯變化，木質(zhì)素含量下降到約8%，葡聚糖和木聚糖的比例相對(duì)增加。此時(shí)的楊木結(jié)構(gòu)已被部分破壞，因此后續(xù)采用較低強(qiáng)度的稀硫酸預(yù)處理?xiàng)l件，可以解聚56%的木聚糖（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。盡管經(jīng)過(guò)酶解后葡萄糖和木糖的總糖化率可達(dá)到理論值的90%左右，但此預(yù)處理組合方法也存在一些問(wèn)題。由于亞氯酸鈉具有一定毒性，對(duì)存儲(chǔ)條件要求高，因此大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)配套相應(yīng)的安全設(shè)施。另外，亞氯酸鈉具有強(qiáng)氧化性，預(yù)處理脫除的木質(zhì)素被氧化后，其基本結(jié)構(gòu)已發(fā)生變化，暫無(wú)研究表明能夠?qū)喡人徕c溶出的木質(zhì)素回收利用。

3 預(yù)處理原料的酶解

現(xiàn)代工業(yè)中，酶解工藝對(duì)設(shè)備要求低、對(duì)環(huán)境友好，利用纖維素酶進(jìn)行加工生產(chǎn)的技術(shù)較為成熟。經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)被破壞，纖維素裸露出來(lái)，能夠有效提高纖維素酶的解聚效率。酶解工藝的高效性及經(jīng)濟(jì)性是制約二代燃料乙醇發(fā)展的關(guān)鍵之一，因此纖維素酶系的配比、高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育及酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化對(duì)不同原料的酶解效率至關(guān)重要，如表3所示。

表3 影響預(yù)處理原料酶解的因素Table 3 Factors affecting the enzymatic digestion of the pretreatment ingredients

3.1 多酶體系復(fù)配

纖維素降解酶系通常是由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和氧化裂解酶等組成，每種酶組分能夠降解專(zhuān)屬的糖苷鍵。其中纖維素酶主要包括3類(lèi)基本酶組分，分別是隨機(jī)劈開(kāi)纖維素纖維內(nèi)部的β-1,4糖苷鍵，釋放自由短鏈的內(nèi)切葡聚糖酶；從游離鏈末端依次切割纖維二糖單元的外切葡聚糖酶；進(jìn)一步水解纖維二糖釋放葡萄糖單元的β-葡萄糖苷酶［39］。楊木生物質(zhì)具有占比較高的纖維素成分，因此要求所用纖維素酶系具有較高的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組分。大量研究表明，在纖維素酶水解過(guò)程中額外添加β-葡萄糖苷酶可以有效提高酶解效率和糖化率。另外，纖維素酶系中復(fù)配木聚糖酶，能夠有效降解預(yù)處理未能解聚的半纖維素。同時(shí)，裂解多糖單加氧酶發(fā)現(xiàn)，通過(guò)利用其氧化裂解作用，可以破壞纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，為糖苷水解酶提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，也對(duì)纖維素的高效酶解起到重要作用［40］。這說(shuō)明高效的酶解不僅需要較高的加酶量，酶系的組成配比同樣至關(guān)重要。

3.2 高效纖維酶系的菌種選育

目前，用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種主要是產(chǎn)酶活力較強(qiáng)的青霉菌、曲霉菌和木霉菌等絲狀真菌。尤其是里氏木霉，具有良好的抗代謝抑制能力和較高的產(chǎn)酶活力，而且纖維素酶系齊全，具有分解天然纖維素所需要的3類(lèi)酶組分［41］。同時(shí)，里氏木霉對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較低、菌株安全無(wú)毒、酶組分易于提取，是公認(rèn)的纖維素酶生產(chǎn)菌，最具工業(yè)應(yīng)用價(jià)值［42］。而與木霉菌相比，青霉菌的木質(zhì)纖維素分解酶系主要由纖維素降解酶、半乳糖分解酶和其他蛋白質(zhì)成分組成，酶組分比較齊全，且各酶組分之間的比例較為均衡［43］。曲音波等［44］從土壤中分離出一株青霉纖維素酶生產(chǎn)菌株，其抗降解物阻遏高產(chǎn)突變株先后在寧夏夏盛公司和甘肅白銀賽諾公司得到應(yīng)用，隨后又在山東龍力公司的纖維素乙醇生產(chǎn)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，并通過(guò)對(duì)酶合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的合理重構(gòu)，進(jìn)一步改造該菌株，提高產(chǎn)酶能力。為獲得性能優(yōu)良的高產(chǎn)酶能力菌株，還可以通過(guò)理化誘變育種、原生體融合育種、基因工程和分子修飾等技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)纖維素酶生產(chǎn)菌的遺傳改良。

3.3 高濃度底物酶解

為了獲得較高乙醇濃度的發(fā)酵液，學(xué)者們通常采用提高底物的添加量，獲得高糖濃度酶解液的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，此方法生物質(zhì)固體含量一般在20%以上。Ying等［45］利用經(jīng)過(guò)乙酸和過(guò)氧化氫預(yù)處理后的原料進(jìn)行高固體含量的酶解測(cè)試，在40%固體載量的條件下進(jìn)行酶解，葡萄糖濃度達(dá)到250.8 g/L。但在高固體含量的酶解過(guò)程初期，反應(yīng)體系中的自由水被大量的底物吸收。而酶解反應(yīng)需要水分子作為載體，自由水的減少導(dǎo)致酶解反應(yīng)體系無(wú)流動(dòng)性，傳質(zhì)過(guò)程減緩，使底物與酶無(wú)法充分結(jié)合，酶解效率降低。da Silva等［46］研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)批次投料的酶解方式解決這一問(wèn)題，分批補(bǔ)料后的固體載量可以達(dá)到40%，葡萄糖的得率達(dá)到60%以上。分批補(bǔ)料通過(guò)逐次添加少量底物使反應(yīng)體系一直保持較高的流動(dòng)性，從而保證底物與纖維素酶的充分接觸，達(dá)到更好的酶解效果。

除了原料自身結(jié)構(gòu)對(duì)酶解的影響，酶解溫度和溶液pH等因素也對(duì)酶解效率具有重要的影響。因此在酶的最適溫度（45-55℃）和最適pH（4.5-6.5）范圍內(nèi)能夠有效保證酶解效率，而加酶量則需根據(jù)對(duì)酶解效率以及成本的要求作出選擇。本課題組通過(guò)對(duì)比諾維信（Cellic CTec 3）和賽諾兩種纖維素酶對(duì)楊木生物質(zhì)的酶解性能發(fā)現(xiàn)，添加相同濾紙酶活單位時(shí)，諾維信纖維素酶的效果更佳。隨后，對(duì)兩者的部分酶組分的酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn)，諾維信纖維素酶中的β-葡萄糖苷酶酶活高于賽諾纖維素酶。結(jié)合楊木具有較高葡聚糖含量的特性，在高固體載量酶解的過(guò)程中，額外添加β-葡萄糖苷酶能夠使酶解效率提升約60%（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。因此，增加纖維素酶中β-葡萄糖苷酶的配比能夠有效提升酶解效率，還有助于消除纖維二糖積累造成的反饋抑制。

4 原料水解液的發(fā)酵

微生物發(fā)酵在燃料乙醇生產(chǎn)工藝中具有重要的地位，水解液和微生物的發(fā)酵性能直接影響到轉(zhuǎn)化效率和乙醇產(chǎn)量。如何實(shí)現(xiàn)水解液的全組分高效轉(zhuǎn)化，是制約二代燃料乙醇發(fā)展的主要障礙之一。大量研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)降低水解液毒性、強(qiáng)化微生物發(fā)酵性能、優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)等方式，破除阻礙其發(fā)展的屏障，如表4所示。

表4 提升原料水解液發(fā)酵性能的方式Table 4 Ways to improve the fermentation performance of the raw material hydrolysate

4.1 水解液中發(fā)酵抑制物及其脫毒方法

抑制物伴隨著木質(zhì)纖維素解聚過(guò)程產(chǎn)生，對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝具有毒害作用。因此，人們嘗試多種方法來(lái)降低木質(zhì)纖維素水解液的毒性，通常有物理脫毒法、化學(xué)脫毒法及組合脫毒法。原料的差異及預(yù)處理措施的差異使得預(yù)處理液的毒性不同，因此需要根據(jù)預(yù)處理液對(duì)發(fā)酵微生物的影響，選擇合適的脫毒方法。研究發(fā)現(xiàn)，潛在的木質(zhì)原料抑制物種類(lèi)多達(dá)35種，主要來(lái)源于糖和木質(zhì)素的降解化合物以及木材提取物，包括芳香族醛和酸、脂肪族醛和酸以及呋喃化合物［47］。而楊木經(jīng)過(guò)稀酸預(yù)處理后，高溫和氫離子的催化會(huì)產(chǎn)生乙酸、5-羥甲基糠醛、糠醛和酚類(lèi)（間苯二酚、對(duì)苯二酚）等抑制物［48］。

化學(xué)脫毒法利用各種堿性試劑對(duì)預(yù)處理液進(jìn)行處理，如氨水、氫氧化鈉、氫氧化鈣、生石灰等。通過(guò)堿性試劑脫毒后，能夠有效緩解有機(jī)酸對(duì)發(fā)酵微生物的毒性作用，提高糖利用率［49］。楊木原料組分中乙酰基含量較高，隨高固體含量的酶解液乙酸濃度增加，簡(jiǎn)單的化學(xué)法無(wú)法滿足脫毒的需求。物理法包括減壓蒸發(fā)、溶劑萃取、活性炭吸附、絮凝納濾和離子交換吸附等方式，減壓蒸發(fā)和溶劑萃取能夠脫除揮發(fā)性和有機(jī)性抑制物，活性炭處理能夠去除更多的酚酸，離子交換樹(shù)脂可以有效減少乙酸、糠醛、5-HMF以及酚類(lèi)這些常規(guī)抑制物［50-53］。選擇物理法和化學(xué)法組合使用，能夠更加有效的降低水解液抑制物濃度，降低抑制物對(duì)酶解過(guò)程和發(fā)酵過(guò)程的影響［54］。張強(qiáng)等［55］研究發(fā)現(xiàn)，氫氧化鈣結(jié)合活性炭吸附的組合脫毒法對(duì)楊木水解液進(jìn)行脫毒，乙醇轉(zhuǎn)化率明顯提升。徐勇等［56］采用不同堿性試劑，結(jié)合弱堿性陰離子交換樹(shù)脂或減壓蒸發(fā)進(jìn)行脫毒發(fā)現(xiàn)，減壓蒸發(fā)加石灰中和的脫毒方法最佳，可脫除70%乙酸和40%甲酸，僅有5.0%-6.0%糖損失，脫毒后微生物的糖利用率和乙醇得率可提高到93.2%和83.6%，對(duì)乙醇發(fā)酵具有積極的促進(jìn)作用。

但是，脫毒步驟增加了二代燃料乙醇的生產(chǎn)成本，使生產(chǎn)工藝變得復(fù)雜，同時(shí)伴隨部分可發(fā)酵性糖的損失。本課題組測(cè)試了樹(shù)脂和活性炭對(duì)抑制物的脫除效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樹(shù)脂比活性炭的脫毒效果更優(yōu)，但樹(shù)脂的脫毒效果也存在一定的局限性，當(dāng)固定體積的樹(shù)脂流過(guò)少量水解液時(shí)，樹(shù)脂對(duì)抑制物的吸附效果顯著，但糖的損耗也更高；而流過(guò)大量的水解液時(shí)，樹(shù)脂吸附能力和被吸附的抑制物逐漸飽和，隨之脫毒效果變差；而且樹(shù)脂的活化與再生，也需要消耗大量的物力和時(shí)間（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。所以在工業(yè)生產(chǎn)中，應(yīng)盡量避免脫毒步驟?？梢酝ㄟ^(guò)提高菌株自身耐受力，或優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程控制，降低或消除抑制物對(duì)發(fā)酵微生物的影響。

4.2 二代燃料乙醇釀酒酵母的定制

由于二代燃料乙醇原料及生產(chǎn)加工過(guò)程的差異性，要求發(fā)酵菌株能夠更好地適應(yīng)不同的水解液環(huán)境，對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)是困難的。而定制的二代燃料乙醇發(fā)酵微生物只需適應(yīng)專(zhuān)屬的水解液，不僅降低了微生物選育的難度，同時(shí)更加有利于工業(yè)化生產(chǎn)，因此開(kāi)發(fā)適配于楊木水解液的專(zhuān)用發(fā)酵菌株勢(shì)在必行。根據(jù)原料的特點(diǎn)，楊木的半纖維素含量占比高達(dá)到15%，C5/C6雙糖共利用能夠有效提高生產(chǎn)工藝中的全糖利用率，提高燃料乙醇的經(jīng)濟(jì)性。而抑制物的存在，使得高效利用可發(fā)酵性糖兼具高魯棒性的菌株開(kāi)發(fā)，成為制約二代燃料乙醇經(jīng)濟(jì)可行性的重要因素之一。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵生產(chǎn)菌種，具有優(yōu)良的生產(chǎn)性能，是適合轉(zhuǎn)化包括第二代燃料乙醇在內(nèi)的生物基化合物的理想底盤(pán)細(xì)胞［57］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步，傳統(tǒng)發(fā)酵菌株無(wú)法高效利用五碳糖的困難已被解決，C5/C6雙糖共發(fā)酵微生物的定制，使木質(zhì)纖維素解聚生產(chǎn)化學(xué)品成為現(xiàn)實(shí)。利用適應(yīng)性進(jìn)化、代謝工程以及合成生物學(xué)等策略，能夠改善葡萄糖和木糖的共發(fā)酵能力［58］。亓偉等［59］將釀酒酵母Saccharomyces-cerevisiae NRRL Y-2034 和樹(shù)干畢赤酵母Pichia stipitis NRRL Y-7124原生質(zhì)體融合培養(yǎng)，獲得菌株融合子F11，能夠利用葡萄糖和木糖生產(chǎn)乙醇。本實(shí)驗(yàn)室前期在野生型二倍體釀酒酵母菌株BSIF染色體的PHO13基因座位上，插入克隆自牛瘤胃液宏基因組的木糖異構(gòu)酶基因Ru-xylA（GenBank JF496707），實(shí)現(xiàn)了木糖異構(gòu)酶的異源表達(dá)；同時(shí)在GRE3基因位點(diǎn)上插入含有磷酸戊糖途徑非氧化部分的4個(gè)基因獨(dú)立表達(dá)框，使GRE3基因失活，減少副產(chǎn)物木糖醇的生成；隨后通過(guò)在染色體上替換組成型強(qiáng)啟動(dòng)子TEF1p來(lái)達(dá)到木酮糖激酶的基因XKS1的適度超表達(dá)，增強(qiáng)下游代謝通量，同時(shí)進(jìn)一步整合Ru-xylA基因表達(dá)框，增加基因拷貝數(shù)，得到菌株BSN3；然后將其在以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中馴化，選擇出生長(zhǎng)最快的單菌落XH7；之后用玉米秸稈預(yù)處理瀝出液作為復(fù)合毒性馴化培養(yǎng)基，利用BioScreen system篩選出單菌落比生長(zhǎng)速率最大的XRH11；在其染色體上整合異源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變子N360S，使其具有轉(zhuǎn)運(yùn)木糖的能力，同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行馴化，得到菌株LF1［60］。但研究中也發(fā)現(xiàn)，以木質(zhì)纖維素為原料的水解液往往含有較高濃度的抑制物，因此進(jìn)一步對(duì)菌株LF1進(jìn)行非理性適應(yīng)性馴化，得到了一株木糖利用與魯棒性這一拮抗關(guān)系較為平衡的菌株6M-15［61］。隨著各種C5/C6雙糖共利用以及高魯棒性微生物的開(kāi)發(fā)，以木質(zhì)纖維素為原料的生物合成產(chǎn)業(yè)得到進(jìn)一步的發(fā)展。

4.3 發(fā)酵方式選擇

工業(yè)中微生物發(fā)酵的方式主要有3種，分別為間歇發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵和批式流加發(fā)酵［62］，合適的發(fā)酵方式，能夠有效降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。但研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖木糖共發(fā)酵時(shí)會(huì)出現(xiàn)葡萄糖后繼效應(yīng)，表現(xiàn)為發(fā)酵后期木糖代謝緩慢［63-64］。因此許多研究人員提出同步糖化發(fā)酵和半同步糖化發(fā)酵，希望在緩解上述現(xiàn)象的同時(shí)減少工藝步驟和縮短工藝時(shí)間［65］。而Kim等［66］通過(guò)分批補(bǔ)料間歇同步糖化發(fā)酵的策略，使楊木水解液56 h時(shí)乙醇得率達(dá)到81.7%，乙醇濃度僅達(dá)到39.9 g/L。Chen等［67］通過(guò)批式流加發(fā)酵結(jié)合同步糖化發(fā)酵的操作，在所有4種以玉米秸稈為原料，以開(kāi)發(fā)的釀酒酵母為發(fā)酵菌株的發(fā)酵中，都實(shí)現(xiàn)了約85 g/L乙醇濃度。但由于酶解和發(fā)酵最適溫度的不一致性，必然要造成酶解效率的損失。因此，將分批補(bǔ)料酶解單獨(dú)進(jìn)行，能夠有效增加酶解效率，然后再通過(guò)批式流加發(fā)酵，有利于緩解葡萄糖后繼效應(yīng)。

4.4 發(fā)酵過(guò)程控制

生物發(fā)酵需要為生物體創(chuàng)造適宜的生長(zhǎng)條件，使其在適宜的溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)濃度和通氣量等條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖和代謝，提高發(fā)酵產(chǎn)率和效率［68］。優(yōu)化微生物發(fā)酵的過(guò)程控制，能夠有效提高微生物發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)利益和產(chǎn)品質(zhì)量［69］，而楊木生物質(zhì)乙?；控S富，導(dǎo)致楊木水解液乙酸濃度較高。雖然二代燃料乙醇發(fā)酵菌株通常具有一定的魯棒性，但超過(guò)發(fā)酵菌株所能承受的抑制物濃度后，亦會(huì)導(dǎo)致微生物無(wú)法正常生長(zhǎng)代謝。乙酸作為一種發(fā)酵抑制物，在發(fā)酵的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不利的影響，其解離常數(shù)pKa值為4.75。因此在pH小于等于4.75的水解液中，大多數(shù)乙酸以分子形式存在。而乙酸分子具有親脂性的特點(diǎn)，可以通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中被解離的乙酸分子導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部酸化，從而對(duì)微生物產(chǎn)生毒性作用［70］。而且經(jīng)過(guò)Casey等［71］研究發(fā)現(xiàn)，增加培養(yǎng)基的pH值可以降低乙酸的抑制作用，從而證實(shí)了乙酸的未解離形式是該分子的抑制形式。本課題組也通過(guò)調(diào)節(jié)水解液pH來(lái)緩解乙酸的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH高于4.75時(shí)，能夠有效提高木糖利用率、發(fā)酵液乙醇濃度和糖醇轉(zhuǎn)化率（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。

另外，在種子培養(yǎng)過(guò)程中，用部分含抑制物的水解液進(jìn)行種子活化，或增加發(fā)酵微生物初始細(xì)胞濃度，都能夠增強(qiáng)微生物發(fā)酵能力，有利于后續(xù)乙醇發(fā)酵［72］。酵母菌作為兼性厭氧菌，發(fā)酵前期需要適量氧氣使菌體快速生長(zhǎng)繁殖［73］。而通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌體生長(zhǎng)過(guò)度會(huì)消耗更多的葡萄糖，因此通過(guò)優(yōu)化通氣量來(lái)控制菌體生長(zhǎng)，同樣有利于提高發(fā)酵液的乙醇濃度。

5 展望

世界各國(guó)對(duì)生物質(zhì)燃料乙醇的研究已開(kāi)展多年，現(xiàn)有生產(chǎn)工藝也取得較大的進(jìn)展并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。但對(duì)于林木類(lèi)生物質(zhì)的研究還停留在預(yù)處理和酶解階段，原因在于林木類(lèi)原料自身的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的特殊性。所存在的問(wèn)題主要體現(xiàn)在預(yù)處理過(guò)程復(fù)雜、成本高和成分損失等方面。而對(duì)于林木類(lèi)二代燃料乙醇的發(fā)展，需要預(yù)處理、酶解和發(fā)酵3個(gè)階段的統(tǒng)籌規(guī)劃，因此困難不僅僅在于預(yù)處理階段。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有預(yù)處理技術(shù)的不斷優(yōu)化，以期獲得高效預(yù)處理方法；通過(guò)開(kāi)發(fā)性能優(yōu)良的產(chǎn)酶菌株和先進(jìn)的酶解裝置，以期獲得高效的酶解方法；通過(guò)發(fā)酵微生物的定制以及發(fā)酵方式和過(guò)程控制的優(yōu)化，以期探索生物制乙醇的可行性發(fā)酵工藝。隨著環(huán)保概念的深入人心，開(kāi)發(fā)可再生能源的需求勢(shì)在必行。提高以楊木生物質(zhì)為原料的二代燃料乙醇生產(chǎn)過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，基本要求主要有兩點(diǎn)：一是實(shí)現(xiàn)楊木生物質(zhì)的全組分利用，二是開(kāi)發(fā)高效適配的預(yù)處理、酶解和發(fā)酵交叉耦合工藝。因此，提升二代燃料乙醇發(fā)酵微生物的全糖共利用能力和魯棒性，以及形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的交叉學(xué)科研究和交叉耦合工藝探索，仍是未來(lái)關(guān)注的熱點(diǎn)。