周璐祺 崔婷茹 郝楠 趙雨薇 趙斌 劉穎超

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院 河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室，保定 071000；2.保定市氣象局，保定 071000）

糧食安全是關(guān)系到國民經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展和社會穩(wěn)定的國家戰(zhàn)略，也是國家安全體系的重要內(nèi)容。綠色農(nóng)藥在保障農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量、防治各種農(nóng)作物病蟲草害的發(fā)生、保障糧食安全方面起著重要作用。通過農(nóng)藥的合理使用，可挽回世界農(nóng)作物總產(chǎn)30%-40%的損失［1］。綠色新農(nóng)藥的開發(fā)和利用有利于農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收和可持續(xù)發(fā)展，是各國農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。經(jīng)過20年的發(fā)展，雖然我國在綠色農(nóng)藥的創(chuàng)制和應(yīng)用上取得了較多原創(chuàng)性成果，但仍然存在較多問題，例如原創(chuàng)性靶標(biāo)少、新農(nóng)藥品種單一、植物耐藥性增強等［2］。近年來，在醫(yī)學(xué)上，天然產(chǎn)物已經(jīng)逐漸被開發(fā)為新型藥劑用于治療各類疾?。?］。在農(nóng)業(yè)上，我國的植物化學(xué)家們也基于天然的活性物質(zhì)開發(fā)了農(nóng)用化學(xué)品，但是品種相對較少，例如以白頭翁（Pulsatilla chinensis（Bunge）Regel）、虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc）、蛇床花（Cnidium monnieri（L.）Cuss）、馬藍（Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek）等植物為材料，提取到活性物質(zhì)并以其為基礎(chǔ)開發(fā)了原白頭翁素A、大黃素甲醚、蛇床子素、喹唑啉酮等4種新型殺菌劑［4］；基于苦皮藤（Celastrus angulatus Maxim）開發(fā)出了對鱗翅目昆蟲具有較好的殺蟲效果的殺蟲劑苦皮藤素［5］。盡管天然產(chǎn)物具有安全無毒、結(jié)構(gòu)新穎等特點，但其化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜不能直接作為農(nóng)藥使用。天然產(chǎn)物具有多元的結(jié)構(gòu)，可以以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)設(shè)計新型衍生物或研究其新型作用靶標(biāo)，進而加速具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型農(nóng)藥創(chuàng)制與開發(fā)。

新農(nóng)藥創(chuàng)制可以采取不同策略，常見創(chuàng)制方法有表型篩選和靶向篩選。基于藥物靶向篩選策略是目前較為常用的新農(nóng)藥分子設(shè)計方法；然而大量、重復(fù)使用單一靶標(biāo)農(nóng)藥，無疑會使“農(nóng)藥殘留、有害生物再猖獗及生物抗藥性”問題日益凸顯，若輪換使用靶標(biāo)相同或相似的農(nóng)藥，也會增加此類風(fēng)險。近年來有研究表明，基于表型篩選發(fā)現(xiàn)新藥的成功率高于靶向篩選［6］，基于表型篩選獲得的生物活性化合物是以相關(guān)病蟲草害為基礎(chǔ)進行篩選，并不限于單一的基因或者蛋白質(zhì)。因此表型篩選近年來重新受到重視，但表型篩選的最大問題在于得到的化合物靶點未知［7］，盡管在新農(nóng)藥創(chuàng)制的早期階段不一定需要了解藥物靶標(biāo)，但是對候選化合物的靶點研究對全面解析候選化合物的作用模式是非常有必要的［8］。同時一個新靶標(biāo)的價值往往高于一個新產(chǎn)品，例如以魚尼丁為探針發(fā)現(xiàn)細胞膜上一類獨特的作用靶標(biāo)——魚尼丁受體（ryanodine receptors,RyRs），化學(xué)家們基于魚尼丁受體開發(fā)出目前常用的鄰苯二甲酰類和鄰甲酰氨基苯甲酰胺類殺蟲劑［9］。新靶標(biāo)的發(fā)掘作為綠色農(nóng)藥創(chuàng)制的重要途徑之一，已成為國內(nèi)外研究的重點和熱點。蛋白質(zhì)是大多數(shù)藥物的主要靶點，小分子化合物與細胞內(nèi)的蛋白靶點相結(jié)合是藥物發(fā)揮藥理活性的基礎(chǔ)，然而監(jiān)測蛋白活性及功能的方法在藥物發(fā)現(xiàn)過程中仍未得到系統(tǒng)性的應(yīng)用［10］。同時，藥劑在發(fā)揮活性時往往不是針對單一蛋白，而是與多個蛋白質(zhì)相互作用［11］。這種多靶點的作用模式使得確定天然產(chǎn)物的單一靶點并對其進行特異性研究十分困難。因此迫切需要一種能夠全面識別天然產(chǎn)物靶點的方法。

以小分子天然產(chǎn)物為起點篩選靶標(biāo)蛋白常用技術(shù)手段，包括化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)、化學(xué)基因組學(xué)和生物物理學(xué)等，其中化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)可以直接分析小分子化合物的靶標(biāo)蛋白，是一種捕獲和鑒定小分子化合物蛋白質(zhì)靶標(biāo)的有效方法，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組與藥物靶點研究和新藥研究的重要手段，及在蛋白質(zhì)水平上鑒定小分子化合物與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的主要方法之一［12-13］。在本綜述中，通過藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)實例，總結(jié)了基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)開發(fā)出的藥物靶標(biāo)鑒定方法，包括標(biāo)記法和非標(biāo)記法，并詳細探討了它們的原理、實驗流程、優(yōu)缺點及適用范圍。由于醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展要先于農(nóng)藥，因此本文以醫(yī)藥靶標(biāo)開發(fā)方法為主，旨在通過闡述基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)藥物作用靶標(biāo)最新方法的進展，為天然產(chǎn)物靶點及新農(nóng)藥創(chuàng)制研究提供參考。

1 基于標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識別方法

生物體中小分子化合物與蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系是藥物結(jié)構(gòu)改造及成藥的關(guān)鍵，分析小分子藥物與靶點相互作用的信號和代謝規(guī)律變得日益重要，一方面通過活性分子的靶點信息可以對化合物進行針對性的改造從而提高其作用效果，另一方面可以確定活性分子對目標(biāo)靶標(biāo)的選擇性，有效的預(yù)測其潛在的毒副作用，降低研發(fā)風(fēng)險?；瘜W(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是化學(xué)生物學(xué)研究的重要手段之一，有別于以往對蛋白質(zhì)進行定性或者定量鑒定的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)旨在通過一系列功能各異的化學(xué)探針，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，解決復(fù)雜體系如細胞裂解液、活細胞、組織中的蛋白質(zhì)如何與小分子藥物相互作用的問題，目前已被應(yīng)用于小分子藥物靶點發(fā)現(xiàn)、藥物先導(dǎo)化合物的篩選等研究中［14］。其一般流程為將引入親和基質(zhì)或報告基團的化學(xué)探針與蛋白質(zhì)組進行孵育，利用親和純化等方法富集與探針結(jié)合的蛋白，再通過質(zhì)譜等其他輔助技術(shù)來分析。常用的基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的小分子藥物靶點研究方法有以化合物為中心的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)（compoundcentric chemical proteomics, CCCP）和以活性探針為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)譜分析（activity-based protein profiling,ABPP），工作流程如圖1所示［15］。

圖1 CCCP和ABPP化學(xué)蛋白質(zhì)組比較Fig.1 Comparison of CCCP and ABPP chemical proteome

1.1 以化合物為中心的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)鑒定方法

CCCP是最早用于確定靶標(biāo)蛋白的方法，早在20世紀90年代，Harding等［16］就通過親和層析方法篩選到天然免疫抑制劑 FK506 的結(jié)合蛋白——FKBP12（FK506 binding protein 12）。CCCP將藥物分子進行修飾后引入標(biāo)簽分子，然后固定到基質(zhì)上如瓊脂糖凝珠或其他樹脂，富集可以與藥物分子結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后通過質(zhì)譜技術(shù)進行鑒定。這是鑒定化合物靶標(biāo)較為經(jīng)典的方法，具有快速、大量富集靶標(biāo)蛋白的優(yōu)點。該技術(shù)主要用于研究具有生物活性的小分子化合物與蛋白質(zhì)的相互作用，更有利于識別目標(biāo)蛋白質(zhì)以外的蛋白質(zhì)，為新藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

Bach等［17］發(fā)現(xiàn)（R）-roscovitine除可作為周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases, CDKs）的專性抑制劑外，還可以抑制吡哆醛激酶的活性。酪蛋白激酶2（casein kinase 2, CK2）是一種臨床上常見的治療癌癥的靶點，Gyenis等［18］利用固定在Sepharose磁珠上的ATP/CK2抑制劑TBB，從細胞裂解液中捕獲和識別結(jié)合蛋白，證明CK2可以與TBB相互作用，同時還識別到一些潛在的目標(biāo)蛋白，如羰基磷酸合成酶I（carbamoyl-phosphate synthase I,CPSM）、真核細胞生長因子1α（eukaryotic elongation factor 1-alpha 1, EEF1α1）等，并為CK2激酶抑制劑以及抗癌藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。Faiella等［19］對Hardwickiic acid（HAA）進行修飾并固定在基質(zhì)載體上與細胞裂解液進行孵育發(fā)現(xiàn)，HAA可以與Hsp27結(jié)合，為Hsp27化學(xué)抑制劑的開發(fā)提供了方向［19］?？嗥ぬ偎刈鳛榛瘜W(xué)殺蟲劑可以影響昆蟲的消化系統(tǒng)，Lu等［20］采用親和層析的方法，從昆蟲中腸中鑒定到11種可以作為苦皮藤素的潛在靶標(biāo)蛋白的蛋白質(zhì)，并成功預(yù)測了苦皮藤素與V-ATPase的結(jié)合位點。

盡管利用親和色譜的方法鑒定小分子化合物靶標(biāo)較為經(jīng)典，但其對細胞材料要求較高，同時親和層析實驗在體外進行無法反映生理條件下藥物與活細胞中蛋白質(zhì)的相互作用。在此基礎(chǔ)上，Hu等［21］開發(fā)了水溶性納米聚合物藥物載體，并利用其在活細胞中篩選藥物靶點。此外，Bantscheff等［22］開發(fā)出kinobeads技術(shù)，成功解決了小分子藥物無法進行化學(xué)修飾的問題。

1.2 以活性探針為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)譜靶標(biāo)鑒定方法

ABPP是由美國的Cravatt課題組最先提出的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)［23］，是目前應(yīng)用較為廣泛的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。其在CCCP技術(shù)的基礎(chǔ)上改進，是一種更為簡便且適用性更為廣泛的鑒定方法。與CCCP不同，ABPP的核心是將基于活性的探針（activitybased probes, ABPs）用于靶向功能相關(guān)的蛋白質(zhì)組，并且這些探針可以共價修飾從絲氨酸水解酶到糖苷酶等酶類的活性位點［24］。因此，ABPP技術(shù)的關(guān)鍵步驟在于活性探針的設(shè)計及合成。一般來說，探針分子應(yīng)以活性化合物為基礎(chǔ)進行設(shè)計，同時探針分子可以與靶標(biāo)蛋白共價結(jié)合，但在探針合成的過程中引入的標(biāo)記物會影響小分子化合物的活性，點擊化學(xué)（click chemistry）及光親和標(biāo)記技術(shù)（photoaffinity labeling technique）的引入進一步開拓了ABPP技術(shù)的適用范圍［25］，具體流程如圖2所示。

圖2 基于親和蛋白質(zhì)組分析策略Fig.2 Analysis strategies based on affinity proteomic

ABPP技術(shù)最初用于某一類蛋白質(zhì)的活性監(jiān)測，如半胱天冬酶、絲氨酸水解酶等［26］。除此之外，ABPP還可以作為工具來研究某一類化合物的具體作用機制，確定其有效官能團或者骨架，為開發(fā)更有效的藥物提供基礎(chǔ)［27］。近年來，利用ABPP鑒定小分子化合物在全蛋白組水平的作用靶標(biāo)也得到了越來越多的應(yīng)用，該技術(shù)以天然產(chǎn)物分子骨架中特定官能團的活性/功能為基礎(chǔ)，選擇相應(yīng)的活性探針，利用競爭性策略篩選靶標(biāo)蛋白［28］，主要通過如下手段來實現(xiàn)。

1.2.1 生物素修飾 生物素修飾是一種被廣泛應(yīng)用的親和純化方法，生物素能與鏈霉抗生素蛋白（streptavidin）和親和素（neutr avidin）特異性結(jié)合，是目前已知蛋白-配體作用力中最強的一種，因此鏈霉抗生素蛋白或親和素常被用于與生物素結(jié)合來富集、純化和識別活性小分子在細胞內(nèi)的靶點。該方法的優(yōu)點是生物素修飾的小分子化合物可以在進行親和純化之前，與細胞蛋白質(zhì)組甚至與細胞膜內(nèi)的靶蛋白充分接觸。生物素富集方式主要為生物素與鏈霉親和素不可逆結(jié)合，因此會對ABPP工作流程的復(fù)雜程度和質(zhì)譜能檢測到的蛋白數(shù)量產(chǎn)生較大影響，因而被不斷優(yōu)化與開發(fā)，如2019年，Zanon等［29］開發(fā)了一種脫硫生物素（desthiobiotin, DTB，結(jié)構(gòu)式見圖3）標(biāo)簽可被輕松洗脫，排除了內(nèi)源生物素化的干擾，減少了肽段的損失，通過合成帶有DTB標(biāo)簽的探針分子與金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)組進行孵育，結(jié)果表明，帶有DTB標(biāo)簽的探針分子操作起來較為簡便，同時增加了金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)組中半胱氨酸的覆蓋率。

圖3 DTB 標(biāo)簽的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structure of DTB label

Eriocalyxin B是從中草藥枇杷素中提取的抗腫瘤有效成分，Kong等［30］采用生物素富集的方式對Eriocalyxin B的靶標(biāo)蛋白進行富集，成功鑒定到P50蛋白為其靶標(biāo)蛋白。小白菊內(nèi)酯具有抗炎活性，為確定其在體內(nèi)的直接作用靶點，Kwok等［31］對小白菊內(nèi)酯結(jié)構(gòu)進行改造以合成親和素探針，試驗發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)脂可特異性結(jié)合并抑制IκB kinase β（IKKβ），導(dǎo)致核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）活化的喪失，為開發(fā)新的抗炎藥物提供了方向。此外，表1列舉了近5年通過生物素富集進行小分子化合物靶標(biāo)鑒定及作用機制探究的實例。

表1 生物素探針用于小分子化合物的靶點鑒定實例Table 1 Examples of biotin probes used for the target identification of small molecular compounds

1.2.2 生物正交化學(xué)反應(yīng) 生物素標(biāo)記的探針分子雖然被廣泛應(yīng)用, 但由于生物素體積較大，一般會影響小分子化合物的原始活性，造成活性下降或者消失，不利于靶標(biāo)蛋白的鑒定。隨著生物正交概念的出現(xiàn)及其反應(yīng)類型的不斷擴充，生物正交反應(yīng)被引入到探針分子設(shè)計中。原有的生物素標(biāo)簽被替換為結(jié)構(gòu)簡單的生物正交基團——疊氮或炔基，后續(xù)可通過 Cu（I）催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成（Cu（I）-catalyzed azide-alkyne cycloaddition, CuAAC）反應(yīng)連接上報告基團［38］。在試驗過程中，活性探針通過對蛋白質(zhì)組進行靶向標(biāo)記，而后再憑借其末端手柄與報告基團共價交聯(lián)，從而達到可視化呈現(xiàn)與富集下拉等目的。該設(shè)計可以減小探針的空間位阻，優(yōu)化探針對于靶標(biāo)蛋白的標(biāo)記效果，同時簡化合成步驟，降低整個實驗的復(fù)雜程度。近年來，在天然產(chǎn)物骨架中引入生物正交反應(yīng)基團是應(yīng)用最為廣泛的靶點鑒定策略之一。許多天然產(chǎn)物的作用靶標(biāo)在應(yīng)用點擊化學(xué)合成探針后被解析，如膽固醇、姜黃素及青蒿素等［39-41］。甲磺酰菌唑作為高殺菌活性的候選藥物，Chen等［42］采用ABPP策略系統(tǒng)地研究了其作用機制，利用生物正交化學(xué)反應(yīng)設(shè)計親和探針成功鑒定到二氫硫辛酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（dihydrolipoamide S-succinyltransferase, DLST）為其作用靶標(biāo)，為DLST作為殺菌劑靶標(biāo)及其抑制劑的創(chuàng)制打下了良好基礎(chǔ)。近5年基于CC-ABPP鑒定小分子化合物靶標(biāo)的實例如表2所示，該方法已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。

1.2.3 光親和基團探針 上述所有化學(xué)探針均具有活性基團，可以共價修飾靶蛋白中的氨基酸殘基，從而在點擊反應(yīng)和富集過程中使探針與靶標(biāo)之間穩(wěn)定結(jié)合，但不是所有化合物都以共價修飾的方式與靶標(biāo)蛋白結(jié)合，并且由于磁珠等外部因素的影響，易造成假陽性的結(jié)果。對于這種情況，研究人員利用合成的光敏性小分子化合物作為探針開發(fā)了光親和標(biāo)記法，形成具有位點特異性的不可逆共價結(jié)合，在藥物靶點的研究中發(fā)揮巨大作用。光親和標(biāo)記結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是近年來發(fā)展的在全細胞蛋白質(zhì)組水平上鑒定藥物分子的作用靶標(biāo)最有效的方法之一［49］。

茉莉酸（jasmonates, JA）是一種調(diào)控植物生長發(fā)育的植物激素，內(nèi)源性活性JA分子與F-box蛋白COI1和JAZ阻遏物形成復(fù)合物，以COI1依賴的方式通過26S蛋白酶體途徑誘導(dǎo)JAZ降解。為了揭示COI1能否與Jas直接結(jié)合，Yan等［50］設(shè)計了一系列光親和探針以驗證COI1與Jas直接結(jié)合，為進一步闡明茉莉素的作用機制打下基礎(chǔ)。除此之外，通過光親和探針進行靶標(biāo)識別的代表性天然產(chǎn)物還有萬古霉素［51］和環(huán)孢菌素［52］等。近5年通過光親和探針鑒定小分子化合物的靶標(biāo)實例如表3所示。

以上不同的探針合成方法都在小分子化合物靶標(biāo)鑒定過程中起著至關(guān)重要的作用，理論上親和磁珠、生物素及光親和基團標(biāo)記的探針主要作用于細胞裂解液內(nèi)，用來富集與小分子化合物作用的靶標(biāo)蛋白，但不能獲得較為全面的靶標(biāo)蛋白。利用生物正交化學(xué)反應(yīng)合成的探針可作用于活細胞內(nèi)，獲取的靶標(biāo)蛋白較為全面，但同時也會存在非特異性結(jié)合造成假陽性。當(dāng)同一化合物在不同官能團設(shè)計合成探針，或者設(shè)計不同類型的探針，最后得到的標(biāo)記蛋白可能會有所不同［57-59］。因此在引入報告基因時應(yīng)盡可能保證小分子化合物的活性不會發(fā)生改變，同時需要在實驗過程中設(shè)置未加入探針的陰性對照。

2 非標(biāo)記化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識別方法

雖然基于標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識別方法已經(jīng)完善并廣泛應(yīng)用，但是這些方法仍然存在局限性。基于標(biāo)記法的靶標(biāo)鑒定方法需要對化合物進行修飾，這往往會導(dǎo)致化合物活性改變甚至是喪失活性，同時部分小分子化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，沒有合適的修飾位點，這些都成為基于標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識別鑒定的干擾因素。隨著藥物靶標(biāo)識別方法的不斷發(fā)展，人們對小分子化合物結(jié)合靶標(biāo)蛋白后蛋白酶水解、化學(xué)變性和熱變性的認識逐漸加深，非標(biāo)記化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)識別方法應(yīng)運而生。這些方法不需要對小分子化合物的結(jié)構(gòu)進行修飾，并且可以有效地篩選混合化合物中的目標(biāo)蛋白，較為快速的確定藥物的作用機制，有利于促進天然產(chǎn)物藥物的開發(fā)及應(yīng)用，可對ABPP方法進行必要補充。圖4列舉出了常見的基于非標(biāo)記化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)識別小分子化合物靶標(biāo)的示意圖。

圖4 非標(biāo)記法識別藥物靶標(biāo)蛋白策略Fig.4 Schematics of label-free target identification methods

2.1 藥物親和力反應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性

藥物親和反應(yīng)的靶點穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability, DARTS）技術(shù)的概念最初由Lomenick等［60］在2009年提出并進行的相關(guān)研究。該研究組推測藥物與靶蛋白結(jié)合后，靶標(biāo)蛋白會增強抗蛋白酶水解的能力，而在結(jié)合前后穩(wěn)定性發(fā)生變化的蛋白質(zhì)可以通過電泳檢測到，然后通過質(zhì)譜分析來確定小分子的直接靶點。該課題組首先通過雷帕霉素和FK506及其已知靶蛋白FKBP12驗證了該方法的可行性，然后通過DARTS技術(shù)鑒定了白藜蘆醇的作用靶標(biāo)eIF4A。由于DARTS 技術(shù)操作簡單、耗時短，得到了廣泛的應(yīng)用。Zhang等［61］運用DARTS的策略發(fā)現(xiàn)Src激酶可以作為苦參堿的靶標(biāo)，這與親和層析的結(jié)果一致。Kim等［62］通過DARTS和MSI的系統(tǒng)結(jié)合，鑒定和驗證VEGFR2激酶作為Voacangine的靶標(biāo)。Zhu等［63］采用 DARTS 技術(shù)篩選出 349 個與人參皂苷相關(guān)蛋白靶點，并最終確定人參皂苷可能通過靶向呼吸鏈復(fù)合物I和調(diào)節(jié)線粒體功能來緩解輕度認知障礙。除此之外，利用該技術(shù)還找到了新型殺菌劑YZK-C22的靶標(biāo)蛋白丙酮酸激酶［64］、帕金森潛在治療藥物Andrographolide的靶蛋白DRP1（dynamin-related protein 1）［65］、結(jié)腸癌治療藥物Azelastine的靶蛋白ARF1（ADP-ribosylation factor 1）［66］。DARTS試驗具有不需要對蛋白質(zhì)進行修飾且不要求蛋白質(zhì)的純度，同時也不要求化合物的形式，既可以是單一的化合物，也可以是復(fù)雜的天然產(chǎn)物等優(yōu)點［67］，這為確定天然產(chǎn)物的作用靶標(biāo)提供了有利條件。但由于DARTS試驗后期主要依賴于SDS-PAGE和凝膠染色觀察，對蛋白豐度較低的蛋白鑒定有限［60］，同時DARTS試驗選擇的裂解液和蛋白酶類型也會影響天然產(chǎn)物靶標(biāo)的鑒定［68］，這些因素也會限制DARTS技術(shù)的準(zhǔn)確性。

2.2 細胞熱轉(zhuǎn)移分析

蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析（cellular thermal shift assay, CETSA）2013年由Molina等［69］首次提出，CETSA基于傳統(tǒng)的熱移位測定（thermal shift assay,TSA），該測定可檢測由配體結(jié)合誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性變化。這兩種方法最主要的區(qū)別是TSA是針對單個純化的重組蛋白或分離的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進行的，而CETSA是用全細胞或細胞裂解物進行的。CETSA最早通過PCR和蛋白免疫印跡（western blot）顯示靶標(biāo)結(jié)合情況，但這種方法鑒定出的蛋白數(shù)量有限而且工作量大，隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，Savitski等［70］將CETSA與質(zhì)譜結(jié)合起來，建立起完整的蛋白質(zhì)測定方法。辣椒素對癌細胞具有抑制活性，有證據(jù)表明辣椒素可以抑制與腫瘤相關(guān)的NADH氧化酶（tumor-associated NADH oxidase, tNOX），Islam等［71］利用CETSA技術(shù)發(fā)現(xiàn)辣椒素可以與tNOX結(jié)合并使tNOX降解。Dziekan等［72］利用CETSA結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，研究了奎寧和甲氟喹兩種抗瘧疾藥物的靶標(biāo)，證實了嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase, PfPNP）是這兩種藥物的共同靶標(biāo)。Destruxin A（DA）是一種環(huán)肽霉菌毒素，因其良好的殺蟲活性具有成為新型殺蟲劑的潛力，有研究表明DA參與轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)且精氨酸t(yī)RNA合成酶（BmArgRS）、Lamin-C蛋白（BmLamin-C）和ATP依賴性RNA解旋酶PRP1（BmPRP1）為其候選結(jié)合蛋白，Wang等［73］通過CETSA技術(shù)驗證DA與BmArgRS和BmLamin-C結(jié)合，為DA靶蛋白的發(fā)現(xiàn)及新型殺蟲劑的創(chuàng)制提供了新的方向。

CETSA技術(shù)操作簡單，受其他因素干擾較小，可直接在活細胞或整體組織水平進行研究，是目前較為常用的靶標(biāo)識別方法之一。但由于某些靶標(biāo)不會因與配體相互作用而穩(wěn)定，或者在較高溫度下相互作用丟失，從而掩蓋了結(jié)合事件，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果［74］。為了克服 CETSA 的缺點，增加其在靶點和脫靶識別以及生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)上的應(yīng)用，Savitski等［70］在 2014 年開發(fā)了基于CETSA的 TPP技術(shù)。TPP技術(shù)將CETSA技術(shù)與多重質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合，用于藥物的靶標(biāo)鑒定。利用TMT-10標(biāo)簽進行高通量篩選及鑒定，能夠同時監(jiān)測10個溫度點，對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化后繪制熔解曲線以發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性差異蛋白。憑借高通量質(zhì)譜分析的優(yōu)勢，TPP方法被廣泛地用于測定藥物或其他小分子誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化中。Li等［75］利用TPP技術(shù)發(fā)現(xiàn)Sp1可作為咔唑生物堿Murrayafoline A（MA）的直接靶標(biāo)，并阻斷IKKβ/NF-κB和p38/JNK MAPKs信號通路，為藥物靶向Sp1用于神經(jīng)炎癥治療以及新型藥物開發(fā)提供了新方向。雖然TPP技術(shù)具有穩(wěn)定性好、可以同時鑒別多種蛋白質(zhì)等優(yōu)點，但其具有耗時長、對膜蛋白檢測有限等不足，仍需進一步改進。

2.3 氧化蛋白穩(wěn)定性

SPROX與DARTS試驗類似，是基于蛋白質(zhì)折疊熱力學(xué)變化原理的無標(biāo)記靶標(biāo)識別方法，將細胞裂解產(chǎn)物用藥物分子處理后，與未經(jīng)藥物處理的對照組同時用不同濃度的氯化胍（蛋白變性劑）處理氧化，蛋白質(zhì)被消化成多肽，對多肽片段中被氧化的殘基進行質(zhì)譜分析。Hatstat等［76］通過SPROX等技術(shù)鑒定N-芳基苯并咪唑化合物NAB2的靶標(biāo)，并鑒定到一個全新的靶標(biāo)Rab1a（一種GTP酶），這一發(fā)現(xiàn)增加了對NAB2減輕α-突觸核蛋白毒性的機制的理解。此外，SPROX技術(shù)還可以與SILAC技術(shù)和iTRAQ技術(shù)相結(jié)合，Ogburn等［77］將SPROX 技術(shù)和SILAC技術(shù)結(jié)合，共鑒定出他莫昔芬（tamoxifen, TAM）和N-去甲基他莫昔芬（N-desmethyl tamoxifen, NDT）的結(jié)合蛋白163種和200種，其中Y-box結(jié)合蛋白1（Y-box binding protein 1, YBX1）可作為TAM的直接作用靶標(biāo)。Geer Wallace等［78］將SPROX技術(shù)與iTRAQ技術(shù)相結(jié)合，鑒定出抗癌藥物Manassantin A的靶點蛋白，為闡明其作用機制提供了新的理論支撐。雖然 SPROX 技術(shù)具有較好的應(yīng)用潛力，但也存在一些不足：首先，由于甲硫氨酸氧化是測量參數(shù)，SPROX技術(shù)只能用于分析含有甲硫氨酸的肽段；其次，不同的甲硫氨酸殘基可能表現(xiàn)出相同的氧化速率［79］。同時在實驗過程中需要添加一定的氧化劑，因此SPORX并不適用于活細胞測定。

2.4 靶標(biāo)結(jié)合可及性變化譜

靶標(biāo)結(jié)合可及性變化譜（target-responsive accessibility profiling, TRAP）通過在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上監(jiān)測配體誘導(dǎo)的賴氨酸可及性變化，來識別細胞環(huán)境中藥物分子的結(jié)合蛋白。該方法通過對反應(yīng)性賴氨酸的可及性變化的全局分析，來測量由于配體結(jié)合而在蛋白質(zhì)靶標(biāo)中誘導(dǎo)的空間位阻。簡單地說，在藥物分子存在時表現(xiàn)出顯著豐度變化的小分子肽段被稱為靶標(biāo)反應(yīng)肽［80］。Zhu等［81］通過TRAP技術(shù)篩選到雷公藤紅素的結(jié)合蛋白CAP1，雷公藤紅素通過CAP1抑制巨噬細胞cAMP-PKA-NF-κB信號通路，從而改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠代謝綜合征。環(huán)黃芪醇具有抗病毒、抗衰老、抗炎等功能，Deng等［82］通過TRAP技術(shù)尋找環(huán)黃芪醇的作用靶點，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B（cathepsin B, CTSB）為CAG直接靶點。

2.5 色譜共洗脫

色譜共洗脫（target identification by chromatographic co-elution, TICC）是一種在非變性條件下，利用液相色譜技術(shù)檢測小分子化合物靶蛋白的方法［83］。與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后，小分子化合物在液相色譜中的保留時間將與結(jié)合蛋白的保留時間一致。隨后，通過質(zhì)譜檢測與小分子化合物同時洗脫的蛋白質(zhì)就可以獲取關(guān)于候選靶標(biāo)蛋白的信息。利用該策略，Emili課題組鑒定了抗真菌天然產(chǎn)物 4513-0042的靶標(biāo)蛋白 Erg6p［83］。TICC主要用于研究真核系統(tǒng)中的藥物-靶點相互作用。2020年，Sch?kermann等［84］用TICC技術(shù)鑒定抗生素靶點，證明了TICC適用于抗生素研究。通過合理的色譜保留時間，大量潛在的抗生素靶標(biāo)（臨床相關(guān)的抗生素靶標(biāo)以及必需蛋白質(zhì)）被覆蓋，蛋白質(zhì)復(fù)合物得以完整保存。該方法不需要藥物或蛋白質(zhì)的固定化或衍生化，適用于多種天然產(chǎn)物和合成化合物。同時該方法可以檢測較低豐度的蛋白，但該方法對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性要求較高，同時檢測結(jié)果可能會受其他共洗脫蛋白的影響。

3 總結(jié)與展望

我國天然產(chǎn)物資源豐富，但是由于天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜且可能會有“多成分、多靶點”的情況，通過對其靶點鑒定及作用機制解析，可以優(yōu)化并指導(dǎo)藥物研究［6,85］。早期農(nóng)藥靶標(biāo)與作用機制的研究往往采用生理生化的方法，從藥物對生物表型、營養(yǎng)物質(zhì)、激素分布和各類氧化還原酶的影響方面進行研究，現(xiàn)在樣品制備方法與檢測儀器都有了很大的改善，新型藥物靶標(biāo)與作用機制的研究已經(jīng)更加深入精準(zhǔn)［86］。本文綜述了幾種靶標(biāo)鑒定的方法，化學(xué)修飾法是最早應(yīng)用于靶標(biāo)鑒定的方法，然而天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、可修飾位點有限，同時結(jié)合小分子標(biāo)簽后可能會改變化合物活性，因此并不一定適用于天然產(chǎn)物的靶點鑒定。基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的直接親和富集的方法是小分子靶點識別的主流方法，非標(biāo)記的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法也為尋找小分子化學(xué)物的靶標(biāo)提供了新的選擇。此外，基于表型篩選的鑒定策略，針對基于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)靶標(biāo)鑒定方法的缺陷，提供了很好的補充和輔助。

當(dāng)前，我國在新農(nóng)藥創(chuàng)制方面仍面臨著許多挑戰(zhàn)，如農(nóng)藥品種和劑型老化、原創(chuàng)靶標(biāo)少、對現(xiàn)有農(nóng)藥抗性加劇、新劑型短缺等［2］。開發(fā)高效、低毒、選擇性好、安全系數(shù)高的綠色農(nóng)藥已成為農(nóng)藥研發(fā)的重要目標(biāo)。在新農(nóng)藥創(chuàng)制過程中，新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)具有十分重要的意義。新靶標(biāo)一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，不僅會成為一系列農(nóng)藥創(chuàng)制的突破口，還將延緩抗性問題，為病蟲草害的防治提供幫助。同基于表型篩選的方法進行新農(nóng)藥創(chuàng)制相比，基于靶標(biāo)的藥物創(chuàng)制由于其靶標(biāo)已知，會耗時更短、更簡便、花費更少［87］，同時相較于基于表型篩選的藥物，對作物更加安全，在農(nóng)藥研發(fā)過程中的重要性不言而喻。但無論哪種方法，得到的靶標(biāo)蛋白都不是確切的，需要通過多種方式進行驗證。隨著化學(xué)蛋白質(zhì)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的技術(shù)被開發(fā)出來用于鑒定化合物蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)應(yīng)用于醫(yī)藥上，對于農(nóng)藥創(chuàng)制而言，可以借鑒其中的鑒定技術(shù)，通過上述各種化學(xué)生物學(xué)研究策略和技術(shù)手段識別天然產(chǎn)物復(fù)雜體系的直接靶標(biāo)，從根本上闡明其發(fā)揮生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，這對于新農(nóng)藥的開發(fā)和創(chuàng)制具有重要意義。