孫自力

（碭山縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)服務(wù)中心，安徽宿州 235300）

近年來，我國畜牧業(yè)快速發(fā)展，宿州市畜牧業(yè)的發(fā)展都呈現(xiàn)出良好的態(tài)勢，特別是生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到廣大養(yǎng)殖戶的追捧[1-3]。豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS）是高度接觸性傳染病，極易流行，并只在豬中進(jìn)行傳播[4-6]，大白、長白、杜洛克、大約克等品種的不同年齡段的公豬、母豬均可被感染，但妊娠母豬和1 月齡以內(nèi)的仔豬最容易感染[7-9]。不同年齡段、不同性別生豬感染上該病后癥狀不同，一般母豬感染后容易導(dǎo)致早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、弱仔；公豬感染后精液品質(zhì)下降，初生豬仔感染后死亡率升高，其他年齡豬則帶來不同的呼吸系統(tǒng)疾病[10-12]。

PRRSV是一類RNA病毒[13-14]，一般臨床診斷主要是通過病豬典型臨床癥狀、特征性組織學(xué)病理變化（尤其是間質(zhì)性肺炎）及病原學(xué)鑒定做出診斷[15-16]。如果生豬出現(xiàn)以下幾種臨床癥狀可以首先考慮感染高致病PRRSV 病毒：①患眼結(jié)膜炎、眼瞼部分水腫；體溫升高，達(dá)40 ℃左右；出現(xiàn)咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀，同時(shí)若觀察到患病豬藍(lán)耳尖，蹄端、外陰部、乳頭發(fā)紺，則臨床診斷可以成立[17-18]。②解剖后顯微鏡下觀察脾臟，邊緣出血性梗死，腎臟呈土黃色，表面有肉眼可見針尖至米粒大小的出血點(diǎn)，包括皮下、扁桃體、心臟、膀胱等均有出血點(diǎn)或出血斑，則病理學(xué)診斷成立[1]。③病原學(xué)鑒定則使用PRRSV實(shí)時(shí)熒光PT-PCR檢測，若檢測結(jié)果為陽性，則可確認(rèn)為該傳染病[19-20]。本研究針對(duì)實(shí)際工作中接觸到的一例疑似PRRSV 病毒感染案例，對(duì)其進(jìn)行診斷、檢測，并提出意見，希望可以為生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展、PRRSV疫病防控提供借鑒。

1 案例來源

養(yǎng)豬場養(yǎng)豬92 只，其中能繁母豬26 只，飼養(yǎng)方式為圈舍飼養(yǎng)，3月初養(yǎng)殖場負(fù)責(zé)人張某發(fā)現(xiàn)其中一只妊娠母豬精神不振、食欲減退，呼吸出現(xiàn)輕微困難，向縣畜牧中心專家進(jìn)行咨詢。

到達(dá)現(xiàn)場后發(fā)現(xiàn)，該妊娠母豬未流產(chǎn)，但有精神倦怠、厭食、低熱等癥狀，檢查后發(fā)現(xiàn)耳未發(fā)紫，不排除考慮是否為感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

2 診斷

2.1 采樣

一般采樣有3種方法：①組織研磨液，每份組織分別從3個(gè)不同部位稱取約1 g樣品，用手術(shù)剪刀剪碎后取出約0.05 g 于研缽中研磨，加入1.5 mL 無菌生理鹽水繼續(xù)研磨，液漿均勻后轉(zhuǎn)移至離心管離心，取上清液；②拭子，采集拭子樣品，放入1 mL無菌生理鹽水中，渦旋震蕩后直接使用；③血清，采集血液放入離心管，加入EDTA抗凝血試劑，離心機(jī)離心后吸取上層血清[2]。

本次檢測主要采集該妊娠母豬及共同生活其他母豬血液放入離心管，加入EDTA抗凝血試劑，離心機(jī)離心后吸取上層血清。

2.2 RNA核酸提取

硅基質(zhì)膜可提取純化的病原RNA 用作病原核酸擴(kuò)增檢測模板。

2.2.1材料試劑裂解液、洗液、洗脫液、吸附柱和收集管。

2.2.2提取步驟①使用移液槍取100 μL 樣品加入裂解液600 μL，之后顛倒直至樣品與裂解液完全混勻，室溫靜置3～5 min，是為了使樣品中的RNA充分裂解出，方便后續(xù)對(duì)RNA 提取操作。②使用移液槍將液體吸出液體，此操作要注意盡量不要吸到懸浮在液體中的雜質(zhì)，防止在離心時(shí)堵塞，然后將吸出液體吹至套上收集管的吸附柱中，將吸附柱放一一對(duì)稱放至離心機(jī)中，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為13 000 r/min，離心時(shí)間設(shè)置為30 s。③從離心管中取出套著收集管的吸附柱，扔掉收集管中收集的液體，之后加入洗液，體積為600 μL，在一一對(duì)應(yīng)放入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速13 000 r/min，時(shí)間30 s，并且將該步驟重復(fù)操作2 次，確保洗液徹底。④從離心管中取出套著收集管的吸附柱，扔掉收集管中液體，再放入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速13 000 r/min，時(shí)間2 min，此時(shí)是空柱離心目的是除去殘留洗滌液。⑤從離心管中取出吸附柱，將其放至新的刻度為1.5 mL 的離心管中，向吸附柱中央加入洗脫液50 μL，室溫靜置1 min 后，放入離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速13 000 r/min，離心時(shí)間30 s，此時(shí)目標(biāo)RNA在洗脫液下經(jīng)過離心，全部流至離心管中，之后取出離心管，管中所剩下液體即為所需模板RNA。

2.3 豬繁殖與呼吸綜合征實(shí)時(shí)熒光PT-PCR檢測

提取樣品RNA 在高效轉(zhuǎn)錄酶作用下以RNA 為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA 模板相互補(bǔ)的cDNA鏈，在熱啟動(dòng)Taq酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大1倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的DNA雜交，利用Taq聚合酶使熒光探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號(hào)，根據(jù)樣品Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果[3]。

2.3.1材料試劑陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、無菌無核酸酶水、RT—PCR反應(yīng)液、酶混合液、熒光探針

2.3.2操作步驟配制反應(yīng)體系試劑，體系組成部分如表1所示。

表1 反應(yīng)體系組成部分單位：μL

其中N是指被檢測樣品、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組總和。該檢測共設(shè)被檢樣品兩組（疑似豬繁殖與呼吸綜合征妊娠母豬與一起生活的正常母豬RNA提取模板），N 為4。因此無菌無核酸酶水用量25 μL，PT-PCR 反應(yīng)液用量62.5 μL，酶混合液用量5 μL，熒光探測針用量22.5 μL。

將以上配制反應(yīng)體系充分混勻，之后在每個(gè)反應(yīng)管中各加入23 μL，然后再分別在每個(gè)反應(yīng)管中加入2 μL 模板RNA，充分混勻并做好標(biāo)記，在熒光PCR 上進(jìn)行反應(yīng)，讀取最終Ct 值。PCR 反應(yīng)條件見表2。

表2 PCR反應(yīng)條件

2.4 鑒別診斷

2.4.1與豬瘟區(qū)別最常見急性豬瘟，在感染初期，精神沉郁，食欲降低，體溫升高至41～42 ℃，稽留高熱，眼部分泌物（黏性、膿性）增多，伴發(fā)結(jié)膜炎導(dǎo)致好流淚，怕冷、嗜睡、厭食、口渴、喜飲水，便秘或持續(xù)腹瀉，大便呈糊狀，灰色、黃白或淡黃色。全身顫抖、被毛蓬亂、毛孔顯現(xiàn)、步態(tài)不穩(wěn)等癥狀。后期表現(xiàn)呼吸困難、消瘦、打堆。耳尖、乳頭、會(huì)陰、四肢末端皮膚發(fā)紺，壞死，有些病豬雙耳尖及尾部出血，壞死，有紅色變?yōu)樗{(lán)黑色，易被其他豬撕咬[4]。病豬死亡快，一般在感染后10～20 d內(nèi)死亡。病程長者，眼睛有大量分泌物，眼瞼常黏連，抗生素治療無效。感染PRRSV 病毒初期臨床癥狀和病理變化與豬瘟相似，臨床上極易發(fā)生誤診。因此，應(yīng)綜合臨床癥狀、剖檢變化、實(shí)驗(yàn)室診斷來確診[5]。

2.4.2與豬鏈球菌病區(qū)別豬鏈球菌病發(fā)病急、傳播快，體溫升高41～43 ℃，精神沉郁、嗜睡、食欲降低，眼結(jié)膜發(fā)紅、眼內(nèi)分泌物增多、呼吸加快。少數(shù)病豬在后期耳尖、四肢末端、背部等充血[6]。該病最主要特點(diǎn)是無先兆癥狀突然發(fā)病，可以通過不同病型，使用青霉素、阿莫西林、氨芐西林等對(duì)豬鏈球菌病敏感的抗菌藥物治療[20]。

2.4.3與豬偽狂犬病區(qū)別豬偽狂犬病多是群體發(fā)病，要么不發(fā)，一發(fā)病就會(huì)不止一例，大約在25%左右。即便是出現(xiàn)一頭有神經(jīng)癥狀的，那些還沒出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的也一定有腹瀉或嘔吐的現(xiàn)象存在。患偽狂犬病的豬表現(xiàn)為精神緊張，精神沉郁，兩耳后豎，遇到聲音刺激后發(fā)生鳴叫，后期刺激則叫聲嘶啞?？诮怯信菽炈?、嘔吐、拉稀的癥狀[21-22]。

3 結(jié)果與分析

3.1 臨床癥狀觀察

主要觀察疑似感染妊娠病豬是否流產(chǎn)、早產(chǎn)、生理狀態(tài)及共同生活生豬生理狀態(tài)。該妊娠母豬未流產(chǎn)，但精神倦怠、厭食、低熱，檢查后發(fā)現(xiàn)耳未發(fā)紫，也未發(fā)現(xiàn)一次性血斑，共同生活其他母豬精神良好、進(jìn)食正常，不排除考慮是否為感染豬繁殖與呼吸綜合征[23]。

3.2 豬繁殖與呼吸綜合征實(shí)時(shí)熒光PT—PCR檢測結(jié)果

3.2.1試驗(yàn)結(jié)果成立判定標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 判定標(biāo)準(zhǔn)

3.2.2試驗(yàn)結(jié)果在本次試驗(yàn)中，陽性對(duì)照組Ct值≤30 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照組無Ct 值并且無特異性曲線，說明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立[8]。

疑似感染生豬樣本與共同生活生豬樣本，均未出現(xiàn)特異性曲線，且無Ct值讀取。說明檢測樣品均為陰性，表明該妊娠母豬并未感染PRRSV。

4 在動(dòng)物疫病防控工作開展情況

為了解到豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行和感染情況，以便為豬繁殖與呼吸綜合征病毒的預(yù)防控制提供客觀量化指標(biāo)，13 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)3 個(gè)園區(qū)隨機(jī)抽取的6 家規(guī)模養(yǎng)殖場，14 家非規(guī)模養(yǎng)殖戶采集的400 份豬血液樣本進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果見表4。由表4 可知，在隨機(jī)抽取6 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)共采集豬的血液樣本400 份。經(jīng)過PRRSV 病毒實(shí)時(shí)熒光PT-PCR檢測后，PRRSV 陽性數(shù)量40 份，陽性率10%。規(guī)模養(yǎng)殖場共采集120 份檢測樣本，均未檢測出PRRSV 陽性；非規(guī)模化養(yǎng)殖戶共采集280 份檢測樣本，其中40 份檢測為PRRSV 陽性，陽性率14.28%。唐寨鎮(zhèn)非規(guī)模養(yǎng)殖戶采集20 份檢測樣本，未檢測出PRRSV 陽性，陽性率為0；周寨鎮(zhèn)非規(guī)模養(yǎng)殖戶采集80 份檢測樣本，其中檢測出PRRSV 陽性樣本10 份，陽性率12.5%；玄廟鎮(zhèn)非規(guī)模養(yǎng)殖戶采集80 份檢測樣本，其中檢測PRRSV 陽性樣本20 份，陽性率25%；趙屯鎮(zhèn)非規(guī)模養(yǎng)殖戶采集40 檢測樣本，未檢測出PRRSV 陽性，陽性率0；程鎮(zhèn)非規(guī)模養(yǎng)殖戶采集40 份檢測樣本，其中檢測PRRSV 陽性樣本10 份，陽性率25%；葛集鎮(zhèn)非規(guī)模養(yǎng)殖戶采集20 檢測樣本，未檢測出PRRSV 陽性，陽性率為0。

表4 豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測

本次對(duì)隨機(jī)抽取的6 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)400 頭豬的血液進(jìn)行PRRSV 實(shí)時(shí)熒光PT-PCR 檢測，結(jié)果表明PRRSV病毒在規(guī)模養(yǎng)殖場均得到很好的防控，無一規(guī)模養(yǎng)殖場檢測出感染病豬，但是在非規(guī)模養(yǎng)殖戶中陽性率明顯高于規(guī)模養(yǎng)殖場，其中在周寨鎮(zhèn)、玄廟鎮(zhèn)、程莊鎮(zhèn)非規(guī)模養(yǎng)殖戶均有感染得病生豬，因此對(duì)于非規(guī)模養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中要特別重視對(duì)PRRSV 的預(yù)防控制，及時(shí)對(duì)PRRSV進(jìn)行鑒別診斷。

畜牧中心持續(xù)排查非洲豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病等重大動(dòng)物疫情，2022 年共排查養(yǎng)殖場點(diǎn)7.2 萬場次，排查生豬80.2 萬頭次，沒發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病等重大動(dòng)物疫情；嚴(yán)抓非洲豬瘟等重大動(dòng)物疫病各項(xiàng)防控措施的落實(shí)，非洲豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病等動(dòng)物疫情排查、生豬及產(chǎn)品調(diào)運(yùn)監(jiān)管、規(guī)模養(yǎng)豬場責(zé)任包保制度、生豬定點(diǎn)屠宰企業(yè)“兩項(xiàng)制度”、病死生豬無害化處理等各項(xiàng)防控措施得到全面落實(shí)；多次開展養(yǎng)殖場消毒滅源活動(dòng)，全年發(fā)放消毒藥356 件；開展了春秋兩季重大動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫活動(dòng)，圓滿完成了春秋兩季集中強(qiáng)制免疫工作，共免疫共防疫注射牲畜口蹄疫疫苗80 萬頭劑、高致病性禽流感疫苗600 萬mL、小反芻獸疫疫苗40 萬頭劑，流行病學(xué)調(diào)查和疫病監(jiān)測養(yǎng)殖場380 余家，自檢和上報(bào)采樣3 200 樣份樣品全部合格，確保了全縣無疫情發(fā)生，重大動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫成效顯著。

5 預(yù)防措施

豬是PRRSV的唯一宿主，妊娠母豬和一月齡仔豬最容易感染。病毒可以通過糞便、鼻腔分泌物、尿液等進(jìn)行排出傳播，感染其他正常豬，感染一般通過鼻與鼻親密接觸或污染糞污尿液接觸，距離越近，越容易感染[9]。該病毒在低溫下存活，冬天為高發(fā)期。要避免PRRSV的暴發(fā)，應(yīng)做到以下幾點(diǎn)。

（1）堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，在從外地引進(jìn)豬時(shí)，務(wù)必事先做好檢測事宜，確保外來豬為攜帶豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒，引進(jìn)的外來豬要進(jìn)行隔離，時(shí)間至少兩周，觀察狀態(tài)，確保安全后再放入豬群。定期對(duì)母豬、仔豬進(jìn)行該病的病原學(xué)血清檢測，及時(shí)淘汰可疑病豬。

（2）疫苗免疫是一種有效控制該病暴發(fā)的有效手段，定期對(duì)豬注射滅活疫苗，特別是后備種母豬，要在配種前進(jìn)行兩次免疫，嚴(yán)格按照我國制定的《高致病性豬藍(lán)耳病防治技術(shù)規(guī)范》和《豬病免疫推薦方案》落實(shí)各項(xiàng)防控措施[10]。

（3）加強(qiáng)豬圈舍內(nèi)部的消毒工作，對(duì)空圈舍及圈舍周圍環(huán)境用熱2%氫氧化鈉等溶液進(jìn)行徹底噴殺，對(duì)圈舍及豬本身使用百毒殺、復(fù)合酚等消毒劑，3天內(nèi)定期進(jìn)行消毒。

6 結(jié)語

綜上，PRRSV 一旦發(fā)展流行起來非常嚴(yán)重，能短時(shí)間內(nèi)引發(fā)大量豬的患病和死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失。養(yǎng)豬必須要嚴(yán)格地制定一系列防治體系，在養(yǎng)殖期間，要應(yīng)用科學(xué)的飼養(yǎng)管理知識(shí)，加強(qiáng)衛(wèi)生消毒工作，最好堅(jiān)持自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出的飼養(yǎng)制度[11]。此外，對(duì)新生仔豬或者母豬配種前，要做好疫苗的接種工作降低發(fā)病率，提高豬的養(yǎng)殖效益。