劉睿欽,孟華星,侯佳琪,張美妮△

(1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院,太原 030001;2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,太原 030001)

神經(jīng)纖維瘤病是一種罕見的基因突變引起的常染色體顯性遺傳病,影響神經(jīng)、肌肉、骨骼、內(nèi)臟器官、皮膚和其他系統(tǒng),神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤是該病的特征表現(xiàn),最常見的類型是Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis 1,NF1)和Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病。NF1占85%～90%,其特征是神經(jīng)纖維瘤、咖啡斑、雀斑和視神經(jīng)膠質瘤。Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病主要表現(xiàn)為雙側前庭神經(jīng)鞘瘤和腦膜瘤[1]。

NF1的發(fā)病率為1/3 000～1/2 000,患者容易發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的良性和惡性腫瘤,與該疾病相關的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤包括視神經(jīng)膠質瘤、膠質母細胞瘤、惡性周圍神經(jīng)鞘瘤和橫紋肌肉瘤等?；颊叩念A期壽命約比健康人少15年,主要死亡原因是惡性腫瘤、心血管意外和腦卒中[2]。該病尚無根治手段,主要是對癥治療,因此,完善基因檢測對于早期診斷和預防家系遺傳有重要意義。

NF1基因于1990年被發(fā)現(xiàn),該腫瘤抑制基因位于17q11.2染色體上,包含58個外顯子,編碼神經(jīng)纖維蛋白。神經(jīng)纖維蛋白抑制RAS信號傳導通路,對細胞增殖起負調節(jié)作用。NF1基因缺陷患者缺乏正常功能的神經(jīng)纖維蛋白,導致RAS通路不受控制的增殖,并形成一系列腫瘤綜合征。目前,文獻中報道了3 000余個NF1基因的不同致病突變位點[3]。

全基因組測序正越來越廣泛地用于診斷Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病,鑒于其在NF1基因缺陷臨床診斷和預防中的價值,本文報道了一種通過這種方法鑒定的新移碼變體,以填補基因庫空白,有助于基因咨詢及產(chǎn)前診斷,提高臨床診斷率。

1 臨床資料

1.1 臨床數(shù)據(jù)收集

從先證者、先證者的父母、叔叔、姑姑、堂妹、祖父及其父母和兄弟姐妹采集了詳細的病史,并對他們進行了標準的神經(jīng)系統(tǒng)查體。先證者完善血尿便常規(guī)、肝腎功、電解質、風濕系列抗體、甲狀腺功能化驗及顱腦、頸髓、胸髓磁共振檢查。先證者完善全基因組二代測序,先證者及其父母完成Sanger測序。此研究經(jīng)山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院倫理委員會批準[批號[2022]倫審字(S016)號],相關人員簽署知情同意書。

1.2 全基因組測序和生物信息學分析

對DNA進行測序,以發(fā)現(xiàn)致病基因。使用基因組分析工具包(www.broadinstitute.org/gatk)篩選單核苷酸多態(tài)性。變異用ANNOVAR(ANNOVAR.openbiology.org/en/late/)注釋。

1.3 Sanger測序和保守性分析

Sanger測序驗證全基因組測序發(fā)現(xiàn)的候選致病基因,并在家系中進行共分離分析。引物由Primer Premier 5.0(Premier Biosoft,美國)設計,PCR在LifeECO Thermal Cycler TC-96/G/H(b)C(Bioer Technology,中國)上進行,以擴增覆蓋突變位點的片段。PCR產(chǎn)物通過瓊脂凝膠電泳進一步純化,然后在ABI 3730XL DNA測序儀(Applied Biosystems,Thermo Fisher Scientific)上測序。Sanger測序結果通過Chromas Lite v2.01(Technelysium,Tewantin,Queensland,Australia)進行分析。

為評估突變位點的進化保守性,我們使用同源基因比對了不同動物物種的神經(jīng)纖維蛋白序列。

1.4 變量建模

使用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org)模擬野生型和突變蛋白的三維結構。隨后,用PyMOL分析氨基酸變化對蛋白質分子結構的影響。

2 結 果

2.1 臨床表現(xiàn)

先證者是一名9歲女孩,主因“發(fā)現(xiàn)牛奶咖啡斑9年”就診。既往史無特殊。個人史系第一胎足月剖宮產(chǎn),母親孕期平順,出生時一般狀況良好,腋窩、腹股溝、胸部、腹部和背部有咖啡色斑點(圖1),言語發(fā)育遲緩,多動、注意力不集中,學習成績中下。神經(jīng)系統(tǒng)專科查體:神志清楚,言語欠流利,理解力、計算力、定向力可,注意力差,查體合作?；颊唢B神經(jīng)、肌力、肌張力、腱反射正常,病理反射陰性,感覺和共濟查體正常。實驗室檢查:血常規(guī)嗜酸性血液粒細胞的絕對值為0.00×109/L,糖化血紅蛋白為4.77%,甲狀腺抗過氧化物酶抗體37.57 IU/mL,肝功能白蛋白39.4 g/L,肌酐40.7 μmol/L,尿酸465 μmol/L。尿常規(guī)、便常規(guī)、凝血系列和風濕系列抗體檢驗均未見異常。腰椎穿刺示腦脊液生化、常規(guī)無異常。顱腦、頸椎和胸椎磁共振平掃及加強成像、顱腦磁共振波譜和灌注加權成像均未見異常。本院裂隙燈檢查未見Lisch結節(jié)。

圖1 先證者Ⅳ-1全身多處牛奶咖啡斑

患者家系譜圖如圖2所示,世代由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ表示。正方形代表男性,圓形代表女性。黑色代表表現(xiàn)出牛奶咖啡斑的家系成員。先證者Ⅳ-1由箭頭指示。家系成員Ⅱ-2在兒童時期死于肺炎。NF1家系來自山西省。家系3代有5例患者。先證者(Ⅳ-1)的祖父、父親、叔叔和堂妹都出現(xiàn)了類似的牛奶咖啡斑,未見神經(jīng)纖維瘤及其他系統(tǒng)腫瘤、Lisch結節(jié)及特異性骨損傷。先證者母親及其直系親屬未見牛奶咖啡斑。

圖2 家族譜系圖

2.2 全外顯子組測序和生物信息學分析

本研究進行了全基因組測序和生物信息學分析,以準確定位該基因,并對先證者Ⅳ-1進行了全基因測序,靶區(qū)覆蓋率大于99.80%,靶區(qū)平均深度為120.060X,靶區(qū)20X覆蓋率大于99.50%。在外顯子水平的樣本中未發(fā)現(xiàn)與疾病相關的明顯拷貝數(shù)變異。在先證者Ⅳ-1的NF1基因第38位外顯子中發(fā)現(xiàn)了一個移碼突變,c.5600delT(p.I1867Tfs*6)堿基缺失將神經(jīng)纖維蛋白的1 867位氨基酸從異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸,并提前引入了一個終止密碼子,將神經(jīng)纖維蛋白從2 818個氨基酸截斷為1 871個氨基酸。

2.3 Sanger測序確認

先證者和她的父親表現(xiàn)出牛奶咖啡斑,他們的NF1基因中都有移碼突變(c.5600delT chr17:29657367),母親未表現(xiàn)出臨床癥狀,也沒有發(fā)現(xiàn)任何突變。在200名無關的漢族人對照中,沒有發(fā)現(xiàn)任何突變。

2.4 變量建模

應用SWISS-MODEL模擬神經(jīng)纖維蛋白,筆者從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org)中選擇了7PGT模型,這是相似度最高的模型,顯示出與神經(jīng)纖維蛋白74%的一致性,正常蛋白如圖3A所示。此外,將神經(jīng)纖維蛋白的第1 867位氨基酸從異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸,并用Chimera軟件在第1871位截斷該蛋白,然后使用SWISS-MODEL構建突變蛋白模型,如圖3B所示。該模型顯示神經(jīng)纖維蛋白缺失947個氨基酸并失去其正常結構。

應用PyMOL,筆者在正常蛋白和突變蛋白中的第1 867位氨基酸尋找6?范圍內(nèi)的氨基酸分子,并尋找原子之間的氫鍵。如圖3C所示,正常蛋白質在異亮氨酸氨基酸周圍有較多的氨基酸,形成11對氫鍵;如圖3D所示,突變蛋白在蘇氨酸氨基酸周圍的氨基酸較少,并未發(fā)現(xiàn)氫鍵。筆者推測,p.I1867Tfs*6變體改變了氨基酸1867周圍的分子間相互作用,并截斷了947個氨基酸,這影響了神經(jīng)纖維蛋白的構象和穩(wěn)定性,從而影響了正常的生物學功能。

3 討 論

本研究報道了1例與NF1相關的新型NF1基因移碼突變(c.5600delT),該突變將神經(jīng)纖維蛋白的第1 867位氨基酸從異亮氨酸轉換為蘇氨酸,并提前引入終止密碼子,因此神經(jīng)纖維蛋白從2 828個氨基酸被截斷為1 871個氨基酸,并且經(jīng)由GeneSplitter、NetGene2 和Human Splicing Finders預測,該突變影響神經(jīng)纖維蛋白功能。

根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院指南[4],NF1基因中的突變c.5600delT(p.I1867Tfs*6)被鑒定為致病性變異,因為(1)ESP數(shù)據(jù)庫、千人數(shù)據(jù)庫、ExAC數(shù)據(jù)庫中對照人群中未發(fā)現(xiàn)變異(PM2 中等);(2)非重復區(qū)框內(nèi)插入/缺失或終止密碼子喪失導致的蛋白質長度變化(PM4 中等);(3)突變與疾病在家系中共分離(在家系中多個患者中檢測到此變異)(PP1 支持);(4)多種統(tǒng)計方法預測出突變會對基因或者基因產(chǎn)物造成有害影響,包括保守性預測、進化預測、剪接位點影響等(PP3 支持)。

目前NF1臨床診斷仍基于1988年美國國立衛(wèi)生研究院神經(jīng)纖維瘤病共識發(fā)展會議制訂的NF1診斷標準,并于2021修訂[5]。無家族遺傳史且符合兩項或兩項以上臨床標準的患者被診斷為NF1;具有家族遺傳史且符合一個或多個臨床標準的患者被診斷為NF1。盡管此標準廣泛用于NF1的臨床診斷,但NF1存在一些非典型癥狀,并且一些癥狀與其他RAS相關疾病重疊。例如,如果只出現(xiàn)咖啡斑和雀斑,很大可能診斷NF1,但不能排除Legius綜合征。因此,基因檢測在NF1診斷方面具有決定性價值。

大約50%的NF1病例是家族遺傳,其余病例由NF1基因突變引起。NF1基因的自發(fā)突變率高達1/10 000,是已知人類基因中突變率最高的基因之一。目前,文獻中報道了超過3 000種NF1基因的不同致病突變。美國國家癌癥研究所數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)顯示,NF1基因導致神經(jīng)纖維蛋白同義、剪接供體、錯義、移碼、停止增益、剪接受體、內(nèi)含子、3′UTR和蛋白質改變變體的替代、缺失和插入突變。

真實世界的NF1基因研究表明,突變主要是點突變,如堿基替換、移碼突變和小缺失。有學者分析NF1突變類型,截斷變異比錯義突變更常見,這種突變類型差異在19歲以下的患者中尤為明顯[6]。此外,對30例NF1微缺失兒童和青少年的臨床特征分析表明,患兒在很小的年紀就常表現(xiàn)出嚴重的臨床癥狀。NF1基因微缺失患者體內(nèi)腫瘤總負荷顯著高于未缺失患者。此外,30例NF1微缺失兒童中有28例(93%)患有注意缺陷/多動障礙,有17例(56%)患有輕度至中度自閉癥[7]。本研究患者表現(xiàn)出多個牛奶咖啡斑和注意力缺陷/多動障礙。

通過檢索文獻,總結了近10年的12篇移碼突變的NF1病例報道[8-19],共31例患者,其中有8個家系。確診患者的年齡從新生兒到65歲不等,有9例女性患者,男女比例為22∶9。最常見的癥狀是牛奶咖啡斑(94%),此外,22例患者(71%)患有神經(jīng)纖維瘤,15例患者(48%)腋窩或腹股溝有雀斑。5例患者(16%)表現(xiàn)出Lisch結節(jié),3例患者(14%)發(fā)生了明顯的骨損傷。只有1例患者(3%)出現(xiàn)視神經(jīng)膠質瘤?；颊哌€表現(xiàn)為其他腫瘤,如縱隔神經(jīng)纖維瘤、叢狀神經(jīng)纖維瘤,胃惡性腫瘤和多發(fā)性腦錯構瘤以及輕度智力發(fā)育遲緩。所有病例均顯示由移碼突變引起的截斷變異,這些變異發(fā)生在外顯子5、24、25、28、29、32、37、39、42、43、46和54中。

NF1基因中的新的移碼變體c.5600delT(p.I1867Tfs*6)將神經(jīng)纖維蛋白第1 867位氨基酸從異亮氨酸轉換為蘇氨酸,并將其從2 818個氨基酸截斷為1 871個氨基酸,從而使神經(jīng)纖維蛋白缺失C末端結構域(CTD)和功能性核定位信號(NLS)。NLS由蛋白激酶A和蛋白激酶C磷酸化。CTD的絲氨酸2576、絲氨酸2578、絲氨酸2580和蘇氨酸2556被蛋白激酶A磷酸化,與14-3-3蛋白結合,這降低了神經(jīng)纖維蛋白的RAS-GAP功能。CTD被Ser 2808上的蛋白激酶C磷酸化,這對神經(jīng)纖維蛋白核定位功能非常重要[20],NLS靶向非結構蛋白并引導神經(jīng)纖維蛋白進入細胞核。筆者推測,致病性變體截斷神經(jīng)纖維蛋白的CTD和NLS,影響神經(jīng)纖維蛋白核定位功能,然后影響其對RAS通路的抑制,導致臨床癥狀。

本研究率先在NF1基因中鑒定出新的移碼突變,c.5600delT(p.I1867Tfs*6),此突變將神經(jīng)纖維蛋白的第1 867位氨基酸從異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸,并將其從2 818個氨基酸截斷為1 871個氨基酸。本研究擴大了NF1基因突變庫,為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供參考。然而,尚需要進一步的研究來更充分地闡明NF1基因型與表型的相關性。