李文俊,姬燕梅,楊云紅,田海濤,孫 嫄,周 丹,李吉勝,郭 妮,蒙 妮,金醒昉

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院心臟大血管外科,昆明 650051)

高血壓是基因、環(huán)境、民族、代謝等多種因素共同作用的結(jié)果,而代謝異常在高血壓發(fā)生、發(fā)展中的作用和機制尚不明確。代謝產(chǎn)物可跳過復(fù)雜的調(diào)控過程直接反映出最終的代謝變化,在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。代謝組學(xué)是分析代謝產(chǎn)物種類、數(shù)量動態(tài)改變及其規(guī)律的科學(xué),從相對簡單的微生物到植物、哺乳動物等復(fù)雜的多生物體系,各種各樣的生物系統(tǒng)都受益于代謝組學(xué)研究[1]。通過代謝組學(xué)可檢測到生物學(xué)途徑中的微妙改變,以深入了解各種生理條件和疾病的機制[2]。云南是少數(shù)民族聚居地之一,高血壓發(fā)病率較高。本研究通過對云南彝族高血壓患者和對照組血清代謝產(chǎn)物進行分析,探索代謝產(chǎn)物與云南彝族高血壓發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,為其機制研究提供新思路和新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年11月至2020年10月課題組于流行病學(xué)調(diào)查中選取彝族原發(fā)性高血壓患者20例(高血壓組)與健康者10例(對照組)作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥40歲;(2)非長期臥床;(3)云南彝族地區(qū)居住年限超過3年;(4)具備基本溝通能力;(5)自愿加入此項研究,并簽署知情同意書;(6)符合高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn);(7)無心、腦、腎、肺或其他任何主要人體器官實質(zhì)性改變。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)短期內(nèi)人體組分急性改變,如嚴(yán)重的脫水、水腫、發(fā)熱或感染等;(2)患有精神疾病;(3)患有重要器官功能衰竭(如急性心力衰竭、腎功能衰竭、呼吸衰竭等);(4)已知患有冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、腦血管疾病、癡呆、呼吸系統(tǒng)疾病(慢性阻塞性肺疾病、哮喘等);(5)不愿意參與本研究。

1.2 方法

1.2.1相關(guān)檢查

受試者均經(jīng)過病史詢問、體格檢查及實驗室輔助檢查。(1)一般情況:包括身高、體重、腰圍(waist circumference,WC)、臀圍(hip circumference,HC)、收縮壓、舒張壓、心率等。(2)實驗室指標(biāo):空腹血糖(glucose,GLU)、血脂[包括總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)]、甲狀腺功能、血常規(guī)等。(3)問卷調(diào)查:采用現(xiàn)場集中、面對面詢問,每位受試者由1～2名調(diào)查人員進行問卷調(diào)查,受試者不能理解的客觀問題,允許由其陪伴或翻譯人員代答,對主觀問題及部分涉及必須回答的問題,由受試者親自回答,翻譯人員進行翻譯。

1.2.2試劑及儀器

主要試劑:甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水。實驗儀器:Vanquish超高效液相(美國Thermo Fisher Scientific公司),Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific公司),Heraeus Fresco17離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司),天平(德國Sartorius公司),明澈純水儀(美國Millipore公司),超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)。

1.2.3樣本制備

靜息狀態(tài)下抽取患者肘前靜脈血3 mL置于肝素抗凝管中,立即于4 ℃冰箱內(nèi)保存。采血后2 h內(nèi)于室溫下3 000 r/min離心10 min,取上層血清100 μL(其余于-80 ℃冰箱凍存)。

1.2.4儀器分析與數(shù)據(jù)處理

1.2.4.1代謝物提取

移取100 μL樣品至EP管中,加入400 μL提取液[甲醇∶乙腈=1∶1(V/V),含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物],渦旋混勻30 s;超聲10 min(冰水浴);-40 ℃靜置1 h;將樣品于4 ℃、12 000 r/min離心15 min;取上清液于進樣瓶中上機檢測;所有樣品另取等量上清液混合成質(zhì)量控制樣品上機檢測。

1.2.4.2上機檢測

采用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100.0 mm,1.7 μm)液相色譜柱對目標(biāo)化合物進行色譜分離。液相色譜A相為水相,含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水,B相為乙腈。采用梯度洗脫:0～<0.5 min,95%B;0.5～7.0 min,95%B→65%B;7.0～8.0 min,65%B→40%B;8.0～9.0 min,40%B;9.0～9.1 min,40%B→95%B;9.1～12.0 min,95%B。流動相流速:0.5 mL/min,柱溫25 ℃,樣品盤溫度4 ℃,進樣體積3 μL。

1.2.4.3數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后,使用自主編寫的R程序包(內(nèi)核為XCMS)進行峰識別、峰提取、峰對齊和積分等處理,然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進行物質(zhì)注釋,算法打分的Cut-off值設(shè)為0.3。采用有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)進行模式識別。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組的年齡、性別、WC、HC、TC、TG、LDL-C、HDL-C、收縮壓、舒張壓、GLU、促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);高血壓組收縮壓、舒張壓高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)),見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組主成分分析

采用有監(jiān)督的PLS-DA進行模式識別發(fā)現(xiàn)在正、負離子下兩組血清樣品分離較好,其模型的擬合能力和預(yù)測能力指數(shù)分別為:正離子在Y軸方向模型的累積解釋率(R2Y)=0.900,模型的累積預(yù)測率(Q2)=0.390;負離子R2Y=0.933,Q2=0.373,見圖1。模型驗證結(jié)果顯示,正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal PLS-DA,OPLS-DA)模型具有較高的可靠性。

A:所有樣品血清代謝產(chǎn)物的正離子OPLS-DA評分圖;B:所有樣品血清代謝產(chǎn)物的負離子 OPLS-DA評分圖。圖1 兩組血清代謝組的非靶向代謝組學(xué)

2.3 高血壓代謝標(biāo)志物篩選

共檢測出代謝物8 470種,其中正離子5 055種,二級質(zhì)譜定性匹配分析得到物質(zhì)名稱的有421種;負離子3 415種,二級質(zhì)譜定性匹配分析得到物質(zhì)名稱的有190種。以變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)>1,P<0.05作為篩選條件,共發(fā)現(xiàn)80個差異代謝產(chǎn)物,其中負離子模式下有38個差異代謝物,正離子模式下體驗42個差異代謝物;以VIP>1,P<0.05、差異倍數(shù)(fold change,FC)>2或<0.5作為篩選條件,共發(fā)現(xiàn)4個差異代謝產(chǎn)物(潛在的生物標(biāo)志物),其中負離子模式下有3個差異代謝物,正離子模式下有1個差異代謝物,分別為鄰苯二酚(Pyrocatechol)、馬尿酸(Hippuric acid)、N-乙酰芳胺(N-Acetylarylamine)、辛弗林丙酮(Synephrine acetonide),見表2、3。

表2 正離子差異代謝物

表3 負離子差異代謝物

2.4 代謝通路分析

以代謝反應(yīng)為線索,串聯(lián)可能的代謝途徑及對應(yīng)的調(diào)控蛋白,整理出對應(yīng)人類(Homo sapiens)差異代謝物映射的通路共有51條,通過氣泡圖,篩選出4條影響最大的代謝通路分別為甘油磷脂代謝,鞘脂代謝,苯丙氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,見圖2。

A:正離子通路富集分析圖;B:負離子通路富集分析圖;橫坐標(biāo)位置和氣泡大小代表路徑影響;縱坐標(biāo)位置和氣泡顏色代表豐富程度。圖2 正負離子通路富集分析圖

將差異代謝產(chǎn)物與已知代謝途徑庫(KEGG)進行生物信息還原,篩選出差異代謝通路包括:正離子的鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、醚脂代謝、組氨酸代謝、半胱氨酸和L-甲硫氨酸代謝、嘧啶代謝、色氨酸代謝;負離子的苯丙氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝,丁酸代謝,抗壞血酸和醛糖代謝,?；撬岷蛠喤；撬岽x,檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán)),糖酵解或糖異生、戊糖磷酸途徑,維生素B6代謝,丙酮酸代謝,磷酸肌醇代謝通路。

3 討 論

代謝產(chǎn)物可跳過復(fù)雜的調(diào)控過程直接反映最終的代謝變化,代謝產(chǎn)物在包括高血壓在內(nèi)的多種疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。通過代謝組學(xué)檢測到生物學(xué)途徑中的微妙改變,可以深入了解各種生理條件和疾病機制[2]。

有學(xué)者采用代謝組學(xué)研究聯(lián)盟的隊列數(shù)據(jù)研究血液代謝物與高血壓的關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)在調(diào)整性別、年齡、BMI、種族和多項指標(biāo)后,在12 479例高血壓患者和31 827例無腎功能損傷的對照人群中發(fā)現(xiàn)了38種與高血壓相關(guān)的代謝物,該研究為迄今為止最大的橫斷面高血壓代謝組學(xué)研究[3]。通路分析進一步表明,氨基酸、絲氨酸/甘氨酸和膽汁酸在高血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用,確定了32種循環(huán)代謝物是潛在的干預(yù)靶點,但仍需要進一步進行體內(nèi)試驗來確定其在高血壓病因或進展中的具體作用。本研究結(jié)果顯示,本院彝族高血壓組與對照組比較中,最明顯的差異代謝產(chǎn)物為鄰苯二酚、馬尿酸、N-乙酰芳胺、辛弗林丙酮。而有研究顯示,在服用美托洛爾的患者尿液中,許多腸道微生物群依賴性代謝物(包括羥基馬尿酸、馬尿酸和甲基尿酸)水平明顯升高[4];在慢性腎臟病大鼠模型中,發(fā)現(xiàn)血漿犬尿酸和馬尿酸水平明顯升高[5]。代謝組學(xué)分析確定了多種與慢性腎臟病病因密切相關(guān)的代謝物,包含16-羥基棕櫚酸酯、犬尿酸酯、高香草酸鹽硫酸鹽、馬尿酸鹽、高瓜氨酸和1,5-脫水葡糖醇[6]。另有研究表明,殘余腎功能與馬尿酸血漿水平呈負相關(guān),較高的殘余腎肌酐清除率與較低的犬尿酸、硫酸吲哚醇、吲哚-3-乙酸、對甲酚葡糖苷酸和馬尿酸血漿水平有關(guān)[7]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶在調(diào)節(jié)人體血壓方面起重要作用,在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的作用下,馬尿酰-組二酰-亮氨酸作為底物可轉(zhuǎn)化為馬尿酸[8],故考慮馬尿酸與腎臟功能相關(guān),從而影響血壓。

同時,本研究中云南彝族高血壓患者與對照人群差異代謝通路包含鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、氨基酸代謝(色氨酸代謝,苯丙氨酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝)、脂肪酸代謝(丁酸代謝)、能量代謝(糖酵解、磷酸戊糖途徑)等。有學(xué)者通過非靶向代謝組學(xué)鑒定出原發(fā)性高血壓患者尿液中包括L-甲硫氨酸等10種潛在生物標(biāo)志物,涉及的代謝途徑包括氨基酸代謝、脂肪酸代謝、類固醇激素、生物合成和氧化應(yīng)激[9],這與本研究結(jié)果一致。體內(nèi)研究支持鞘脂在高血壓病理生理學(xué)中的作用,例如自發(fā)性高血壓大鼠顯示總神經(jīng)酰胺和鞘氨醇血漿水平升高[10]。內(nèi)皮細胞功能與鞘脂代謝密切相關(guān),正常的鞘脂代謝對于維持內(nèi)皮細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要,異常情況下的鞘脂代謝物或關(guān)鍵酶(包括鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、1-磷酸鞘氨醇等)可能對內(nèi)皮細胞的功能有保護或破壞作用[11]。越來越多的實驗和臨床研究強調(diào)了鞘脂在心血管疾病,尤其是缺血性心臟病、高血壓、心力衰竭和卒中等疾病中的病理生理學(xué)關(guān)鍵作用[12]。神經(jīng)酰胺水平增加與不良心血管風(fēng)險和事件密切相關(guān),抑制神經(jīng)酰胺的合成或加速其降解可改善多種心血管疾病[13]。粗糧攝入與血壓之間的負相關(guān)可能是由鞘脂代謝物介導(dǎo)[14]。鞘脂是脂質(zhì)的不同種類,也是細胞膜中的結(jié)構(gòu)分子和信號分子,參與關(guān)鍵細胞功能的調(diào)節(jié),在維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面具有關(guān)鍵作用,已被用作預(yù)測人群疾病的潛在生物標(biāo)記[15]。

有研究顯示,高血壓患者和健康人群間血清代謝物存在差異,其主要參與脂肪酸代謝,甘油磷脂代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,與胰島素抵抗、血管重塑、巨噬細胞等相關(guān)[16]。而高鹽飲食誘導(dǎo)富馬酸、L-乳酸、肌酐、L-丙氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸水平明顯升高,與糖酵解相關(guān)的氨基酸代謝通路明顯改變[17]。在人類和動物代謝組學(xué)研究中,確定了數(shù)種共同的代謝通路,包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨酰-tRNA生物合成和精氨酸生物合成,其與胰島素抵抗、炎癥狀態(tài)和一氧化氮產(chǎn)生受損等密切相關(guān)的代謝標(biāo)志物和通路有助于原發(fā)性高血壓的發(fā)展,可為早期診斷或預(yù)測提供依據(jù)[18]。研究發(fā)現(xiàn),補充L-苯丙氨酸可通過改善血管功能和腎功能來減輕鹽敏感性高血壓大鼠的鹽誘導(dǎo)高血壓[19]。隱匿性高血壓患者中亮氨酸/異亮氨酸、纈氨酸、L-甲硫氨酸、苯丙氨酸等氨基酸水平高于健康人群;隱匿性高血壓患者動態(tài)收縮壓與亮氨酸/異亮氨酸、纈氨酸、L-甲硫氨酸、苯丙氨酸、C0-肉堿和C3-肉堿水平呈明顯正相關(guān),證明了生命早期和晚期支鏈氨基酸代謝改變的不同階段[20]。血漿苯丙氨酸和苯基乙酰谷氨酰胺可用于預(yù)測冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄癥,腸道微生物可能是預(yù)防冠狀動脈支架內(nèi)再狹窄癥進展的干預(yù)靶點[21]。而色氨酸人體必需的外源性芳香族氨基酸,在人體中色氨酸不僅可以合成蛋白質(zhì),還可以通過其代謝產(chǎn)物參與機體的情緒調(diào)節(jié)和新陳代謝過程[22]。研究發(fā)現(xiàn),高血壓患者腸道中代謝產(chǎn)物吲哚乙酸水平明顯降低,予小鼠高鹽飲食后可影響腸道菌群的組成,降低糞便中吲哚乙酸水平,同時提高小腸內(nèi)促炎性Th17細胞數(shù)量,刺激炎癥反應(yīng),導(dǎo)致小鼠血壓升高和心血管疾病發(fā)生,故腸道菌群的代謝產(chǎn)物吲哚乙酸對高血壓的發(fā)生、發(fā)展可能具有抵抗作用[23]。

目前與高血壓密切相關(guān)的代謝產(chǎn)物多為短鏈脂肪酸(short chain fat acids,SCFA),如醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽,其主要由膳食纖維、盲腸和結(jié)腸中未吸收的碳水化合物通過腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生,在高血壓實驗?zāi)Ｐ椭锌山档脱獕?。本研究的血清差異代謝物中未檢測到SCFA。研究顯示,SCFA在血漿和糞便中顯示出拮抗結(jié)果,在高血壓受試者中發(fā)現(xiàn)SCFA在糞便中的水平明顯升高,在血漿中的水平較低,表明SCFA吸收效率較低[24]。腸道微生物群通過SCFA參與高血壓的病理生理學(xué)[25]。丁酸鹽與收縮壓線性相關(guān),不受性別、種族或干預(yù)組的影響,血清或糞便丁酸鹽與血壓呈負相關(guān),故考慮丁酸鹽是以SCFA為中心的降壓干預(yù)目標(biāo)[26]。研究顯示,原發(fā)性高血壓患者的丙酸鹽水平較低,丁酸鹽水平明顯升高[27],表明丁酸鈉可能通過調(diào)節(jié)腸道微生物群及其衍生代謝物和腎素-血管緊張素系統(tǒng)來影響高血壓[28]。另有研究顯示,丙酸鹽可降低血壓,減弱心臟肥大、纖維化、血管功能障礙[29]。膳食鈉減少會增加循環(huán)SCFA,膳食鈉可能會影響人類的腸道微生物組,增加的SCFA與血壓降低和動脈順應(yīng)性改善有關(guān)。腸道微生物群參與血壓調(diào)節(jié)和高血壓,適度的鈉減少會增加血清SCFA,使血壓和動脈僵硬度降低[30]。目前,補充醋酸鹽可保護米諾環(huán)素誘發(fā)的高血壓,靶向腸道微生物代謝物可作為預(yù)防高血壓發(fā)展早期干預(yù)措施的新視角,有助于減輕高血壓負擔(dān)[31]。

本研究受試者為本院彝族高血壓患者和健康對照者,故差異代謝物與其他研究不完全相同;研究存在樣本量小、單中心研究的不足,此后需要進一步開展大樣本量、多中心的臨床研究,以提供更多的科學(xué)依據(jù)。綜上所述,兩組受試者的代謝物和代謝通路存在差異,其可成為其診斷和治療的新靶點。