劉 勇,楊 濤,梁艷山,曹興華,柯雪茹,陳 杰,馬曉媛

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院手術(shù)麻醉科,烏魯木齊 830099)

迷迭香為是雙子葉植物綱、唇形科、迷迭香屬植物灌木,其提取物迷迭香酸具有抗氧化、抗炎和免疫抑制作用[1]。前期研究表明,小鼠腹腔注射迷迭香酸可減輕腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI),減輕運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性[2],但迷迭香酸對(duì)CIRI具有保護(hù)作用的藥理機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致CIRI的重要原因,而活性氧是影響氧化應(yīng)激的主要因素[3],活性氧可誘導(dǎo)多種生物反應(yīng),包括組織損傷、炎癥反應(yīng)、休克和凋亡。本課題組期望通過觀察不同劑量迷迭香酸對(duì)腦缺血再灌注小鼠活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)/Nod樣受體蛋白-3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein-3,NLRP-3)炎癥小體信號(hào)通路表達(dá)的影響,探討迷迭香酸抑制CIRI的作用機(jī)制,為進(jìn)一步的臨床使用和新藥研發(fā)提供依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只體重27～30 g雄性美國(guó)癌癥研究所(institute of cancer research,ICR)小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,飼養(yǎng)于清潔環(huán)境,晝夜12 h光照節(jié)律,自由飲水進(jìn)食,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)通過新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)操作符合倫理要求,倫理審批編號(hào):IACUC-20210301-27。

1.1.2試劑

迷迭香酸(貨號(hào)R4033)購自美國(guó)默克公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)1兔多克隆抗體、SOD2小鼠單克隆抗體、熒光探針DHE購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)單克隆抗體、核因子-E2相關(guān)因子-2(nuclear factor-E2 related factor-2,Nrf-2)多克隆抗體、caspase-1兔單克隆抗體、GAPDH小鼠單克隆抗體、兔抗NLRP-3單克隆抗體、兔抗凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis related spot like protein,ASC)多克隆抗體、IL-1β小鼠單克隆抗體購自美國(guó)CST公司。辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的多克隆山羊抗兔或山羊抗鼠IgG二級(jí)抗體購自武漢谷歌生物公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥方法

按隨機(jī)數(shù)字表法將60只小鼠分為假手術(shù)組、模型組、迷迭香酸10、20、40 mg/kg組,每組12只。迷迭香酸水溶性白色粉末用生理鹽水稀釋成1 mg/mL,采用腹腔注射給藥模式,尾靜脈注射最大劑量不超過0.5 mL,參考前期相關(guān)文獻(xiàn)均采用腹腔注射方式。

1.2.2建模方法

手術(shù)前用50 mg/kg體重的戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉,手術(shù)期間體溫保持在(37.0±0.5)℃。缺血再灌注損傷伴大腦中動(dòng)脈閉塞,單絲插入持續(xù)60 min,大腦中動(dòng)脈由硅樹脂涂層尼龍單絲制成,該單絲被引入左頸總動(dòng)脈的切口,并延伸至頸動(dòng)脈分叉的遠(yuǎn)端,以暫時(shí)閉塞大腦中動(dòng)脈。大腦中動(dòng)脈閉塞60 min后,拔出單絲恢復(fù)血流。缺血再灌注損傷治療后,小鼠腹腔注射迷迭香酸10、20、40 mg/kg,24 h后再處死小鼠進(jìn)行以下研究。將整個(gè)腦組織放置于4 ℃冰臺(tái)上,或冷凍在液氮中并保存在-80 ℃進(jìn)行分析,或固定在4%多聚甲醛中進(jìn)行組織學(xué)研究。

1.2.3假手術(shù)組小鼠制備方法

采用相同的麻醉和手術(shù)方法建模,小鼠模型制備好后,只游離血管,不插入單絲栓線;術(shù)后腹腔注射同等容量溫度的無菌蒸餾水。

1.2.4小鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分測(cè)定

用迷迭香酸處理小鼠后,由1名不了解小鼠處理情況的觀察者對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。小鼠經(jīng)適應(yīng)訓(xùn)練后進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),每次實(shí)驗(yàn)時(shí)間5 min,實(shí)驗(yàn)間隔為30 min。參考Longa的6級(jí)5分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分為無神經(jīng)損傷癥狀,1分為提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直,2分為提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢屈曲,3分為行走時(shí)輕度向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈,4分為行走時(shí)嚴(yán)重向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈,5分為不能自發(fā)行走、向?qū)?cè)跌倒。

1.2.5ROS檢測(cè)

取出腦組織,立即在室溫下用甲醛溶液固定1 d,并用70%乙醇保存,然后用石蠟包埋。在旋轉(zhuǎn)切片機(jī)上將每個(gè)標(biāo)本切成7 μm厚的切片,并安裝在涂有3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APES)的載玻片上。每個(gè)部分在二甲苯中脫蠟,在水中乙醇濃度降低的情況下再水化,并用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,滑梯上裝有中性香脂。另一方面,腦組織于-80 ℃在APES涂層玻片上制備6 μm厚的冷凍切片。細(xì)胞接種在96孔黑色透明的底部微孔板上。處理后,用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次,并用10 μmol/L熒光探針DHE在PBS中培養(yǎng),然后用外熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度。

1.2.6Western blot

將約100 mg冷凍腦組織均勻化于1 mL RIPA緩沖液中,然后以10 000×g離心20 min。用Bradford法測(cè)量上清液的蛋白質(zhì)濃度?？偟鞍自诜兴信囵B(yǎng)5 min。在6%～12%聚丙烯酰胺上分離等量的總蛋白,并電泳轉(zhuǎn)移至由甲醇預(yù)活化的聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜。用5%脫脂牛奶封閉膜2 h,并在4 ℃下與特定一級(jí)抗體孵育過夜。用HRP偶聯(lián)的山羊抗兔或山羊抗鼠IgG作為二級(jí)抗體(1∶6 000)檢測(cè)免疫反應(yīng)帶。免疫反應(yīng)帶使用光敏HRP Western blot檢測(cè)系統(tǒng)顯示,并使用分子分析軟件通過密度測(cè)定法定量。主要抗體包括針對(duì)SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2、NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β的兔和小鼠多克隆抗體。

HO-1、Nrf-2的Western blot是將所取得的實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織標(biāo)本按比例(1 mg∶10 μL)加入裂解液進(jìn)行冰浴勻漿,4 ℃下12 000×g離心10 min,取上清液用于總蛋白定量測(cè)定。10%～12%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5% BSA封閉90 min后,4 ℃孵育一抗Nrf-2(1∶800)、HO-1(1∶1 000)過夜。PBS清洗后37 ℃孵育二抗(1∶5 000)90 min。TBST清洗后顯影、保存圖片并采用Quantity One軟件分析目標(biāo)蛋白及其同塊膠內(nèi)參的灰度值,計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分比較

假手術(shù)組術(shù)后神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分均為0分。與模型組比較,迷迭香酸10、20、40 mg/kg組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分總體降低,其中迷迭香酸40 mg/kg組總體降低最明顯(P<0.05),見表1。

表1 各組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分比較(n=12,n)

2.2 各組腦損傷病理改變及ROS水平比較

與假手術(shù)組比較,模型組腦損傷病理評(píng)分、ROS水平增高(P<0.05);與模型組比較,迷迭香酸20 mg/kg組ROS水平降低,迷迭香酸40 mg/kg組腦損傷病理評(píng)分、ROS水平降低,其中迷迭香酸40 mg/kg組降低最明顯(P<0.05),見圖1。

A:各組病理圖片染色(上排,HE,200×)和熒光顯微鏡觀察ROS水平(下排)結(jié)果;B:基于HE標(biāo)準(zhǔn)的病理評(píng)分結(jié)果;C:用熒光探針DCFH-DA測(cè)量ROS水平;a:P<0.05,與假手術(shù)組比較;b:P<0.05,與模型組比較。圖1 各組腦損傷病理改變及ROS水平比較

2.3 各組SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2相對(duì)表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較,模型組SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05);與模型組比較,迷迭香酸20 mg/kg組SOD1、HO-1、Nrf-2相對(duì)表達(dá)水平升高,迷迭香酸40 mg/kg組SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2相對(duì)表達(dá)水平升高,其中迷迭香酸40 mg/kg組升高最明顯(P<0.05),見圖2。

A:Western blot檢測(cè)結(jié)果;B:各組SOD1相對(duì)表達(dá)水平比較;C:各組SOD2相對(duì)表達(dá)水平比較;D:各組HO-1相對(duì)表達(dá)水平比較;E:各組Nrf-2相對(duì)表達(dá)水平比較;a:P<0.05,與假手術(shù)組比較;b:P<0.05,與模型組比較。圖2 各組SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2相對(duì)表達(dá)水平比較

2.4 各組NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β相對(duì)表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較,模型組NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,迷迭香酸10、20、40 mg/kg組NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β相對(duì)表達(dá)水平降低,其中迷迭香酸40 mg/kg組降低最明顯(P<0.05),見圖3。

A:Western blot檢測(cè)結(jié)果;B:各組NLRP-3相對(duì)表達(dá)水平比較;C:各組ASC相對(duì)表達(dá)水平比較;D:各組caspase-1相對(duì)表達(dá)水平比較;E:各組IL-1β相對(duì)表達(dá)水平比較;a:P<0.05,與假手術(shù)組比較;b:P<0.05,與模型組比較。圖3 各組NLRP-3、ASC、caspase-1、IL-1β相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

隨著生活水平的提高、生活方式的改善及人口老齡化,以高癱瘓率和死亡率為特征的卒中發(fā)病率明顯增加[4-5],卒中是成年人嚴(yán)重長(zhǎng)期殘疾的主要原因[6],腦缺血再灌注模型已被公認(rèn)為腦缺血模型。根據(jù)既往研究,缺血性腦損傷的主要病理機(jī)制與氧化應(yīng)激、興奮性毒性、炎癥、線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡有關(guān)[7-9],甚至可能在幾分鐘內(nèi)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10-12]。迷迭香酸作為重要的抗氧化劑之一,已被證明可以去除活性氮、過氧亞硝酸鹽和許多其他各種活性氧[13-15],且可通過磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threoninekinase,AKT)介導(dǎo)的抗氧化作用對(duì)肺缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[16-18]。還有研究表明,迷迭香酸通過激活Nrf-2信號(hào)通路、減少抗氧化損傷、抑制炎癥反應(yīng)和抑制肝細(xì)胞凋亡[19-20]。此外,其他學(xué)者也認(rèn)為迷迭香酸可通過B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B cell lymphoma/leukemia 2 gene,Bcl-2)信號(hào)通路對(duì)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[21-23]。然而,迷迭香酸是否在腦缺血再灌注誘導(dǎo)的腦損傷中發(fā)揮作用且如何發(fā)揮作用,目前尚不清楚。

本研究中證實(shí),與假手術(shù)組比較,腦缺血再灌注確實(shí)會(huì)導(dǎo)致腦損傷,并伴有更高的神經(jīng)功能缺損、腦梗死體積和腦水腫。注射迷迭香酸后,神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分明顯下降,表明迷迭香酸有逆轉(zhuǎn)小鼠腦損傷的潛在作用。由于腦缺血再灌注與ROS水平升高和腦水腫密切相關(guān),導(dǎo)致患者預(yù)后惡化[24-25]。同時(shí),本研究評(píng)估了ROS信號(hào)通路,發(fā)現(xiàn)當(dāng)ROS在細(xì)胞內(nèi)積累時(shí),就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激,從而對(duì)機(jī)體造成損害。本研究還發(fā)現(xiàn),腦損傷小鼠的ROS水平明顯升高,迷迭香酸給藥后ROS水平明顯降低,表明迷迭香酸可通過抑制ROS保護(hù)小鼠免受腦缺血再灌注誘導(dǎo)的腦損傷。此外,與ROS比較,受損腦組織標(biāo)本中的SOD1、SOD2、HO-1、Nrf-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平受到抑制,這表明抗氧化劑水平下調(diào),預(yù)防CIRI的能力降低。此外,由于炎癥小體在通過IL-1β釋放調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中的重要作用,ROS調(diào)節(jié)的NLRP-3信號(hào)通路也被進(jìn)一步評(píng)估[26]。本研究發(fā)現(xiàn),NLRP-3信號(hào)通路在腦缺血再灌注中被激活,隨后激活其下行信號(hào)表達(dá),包括ASC和caspase-1。但注射迷迭香酸后,NLRP-3通路失活,最終導(dǎo)致IL-1β分泌,表明迷迭香酸通過抑制ROS和NLRP-3對(duì)腦損傷起到保護(hù)作用。

本研究采用Western blot、HE染色和免疫組織化學(xué)法分析各組相關(guān)指標(biāo)的蛋白表達(dá)和組織標(biāo)本的損傷情況。結(jié)果表明,迷迭香酸通過改變腦缺血再灌注誘導(dǎo)小鼠腦內(nèi)ROS/NLRP-3信號(hào)通路的表達(dá),進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激對(duì)抗腦損傷,這些發(fā)現(xiàn)可為研究人員從自然生產(chǎn)功能的角度研究CIRI。

綜上所述,迷迭香酸對(duì)CIRI小鼠具有保護(hù)作用,保護(hù)性作用與抑制ROS/NLRP-3炎癥小體信號(hào)通路和抗氧化作用的改善有關(guān),這為將來臨床治療提供了一種有前景的治療策略和途徑。