段鶴君，張 晶，孫佳林，楊潤(rùn)暉，邵 兵，牛宇敏*

（1.北京市疾病預(yù)防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，北京 100193）

作為重要的動(dòng)物源性食品，牛奶的安全性受到社會(huì)廣泛關(guān)注［1］。其中激素類藥物在牛奶中的殘留是社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。一方面，激素類藥物可用于治療奶牛的生殖疾病，另一方面，激素能提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。因此，激素被奶農(nóng)非法使用，以促進(jìn)奶牛性成熟，并增加原奶產(chǎn)量［2］。此外，部分激素被違法添加至牛奶中，使運(yùn)動(dòng)員產(chǎn)生興奮從而提高機(jī)能狀態(tài)［3］。研究表明，過(guò)量攝入激素會(huì)造成人類生殖系統(tǒng)功能異常，甚至引發(fā)前列腺癌和乳腺癌等癌癥［4-6］。世界許多國(guó)家和組織對(duì)牛奶中激素類藥物制定了最大殘留限量，以保護(hù)消費(fèi)者安全。歐盟理事會(huì)指令96/22/EC 和2003/74/EC 禁止某些具有激素作用的物質(zhì)用于畜牧業(yè)［7-8］。中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部第250 號(hào)公告明令禁止己烯雌酚等激素類藥物用于食品動(dòng)物［9］。世界反興奮劑機(jī)構(gòu)將勃地酮、美睪酮等雄激素和氫化可的松、潑尼松等糖皮質(zhì)激素列入禁用清單［10］。

激素類藥物包括糖皮質(zhì)激素、孕激素、雄激素和雌激素等，化合物種類眾多。目前激素類藥物的檢測(cè)方法包括放射免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法［11］、氣相色譜法（GC）［12］、液相色譜法（LC）［13］以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［14-15］等。相比之下，液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有更高的質(zhì)量精度和更強(qiáng)的檢測(cè)通量，在激素類藥物高通量篩查和檢測(cè)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)［16-17］。在樣品制備方面，《GB/T 21981-2008 動(dòng)物源食品中激素多殘留檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》［18］規(guī)定了動(dòng)物性食品中50 種激素的檢測(cè)需使用ENVI-Carb 和氨基柱兩種固相萃取柱，不適用于激素類藥物的快速篩查。QuEChERS 方法由于操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低且溶劑使用較少，已被用于肉類樣品中激素類藥物的多殘留檢測(cè)［19-20］，但在牛奶樣品中的應(yīng)用研究較少。因此，本研究擬采用QuEChERS 方法實(shí)現(xiàn)牛奶基質(zhì)中激素的多殘留檢測(cè)。

本研究選擇常用的四大類獸用激素類藥物（包括雄激素、雌激素、腎上腺皮質(zhì)激素、孕激素）共51種化合物為研究對(duì)象，通過(guò)超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC-Q-TOF MS）獲得化合物的母離子、二級(jí)碎片離子精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間，構(gòu)建激素類藥物的定性篩查數(shù)據(jù)庫(kù)；通過(guò)優(yōu)化QuEChERS 前處理?xiàng)l件，建立了牛奶中51 種激素的篩查和定量方法，并應(yīng)用于北京本地市售牛奶樣品的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Waters ACQUITYTMUPLC 液相色譜-Sciex5600 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，分別購(gòu)自美國(guó)Waters 公司和Sciex 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；Vortex-Genin 2渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific Industries公司）；離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

51種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（名稱見(jiàn)表1）的純度大于95%，均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均在-18 ℃低溫儲(chǔ)存。

表1 51種激素的名稱、分子式、測(cè)量質(zhì)量數(shù)、主要碎片、保留時(shí)間、檢出限及定量下限Table 1 Chemical names，molecular formulas，measured mass，main fragments，retention times，limits of detection and limits of quantitation of 51 hormones

氧化鋯包覆硅膠（Z-Sep）填料、反相硅膠鍵合相吸附劑（C18）填料購(gòu)自美國(guó)Supelco 公司，N-丙基乙二胺（PSA）、增強(qiáng)型脂質(zhì)去除凈化管（EMR-Lipid dSPE）購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 0 g，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中并用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取100 μL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：用空白基質(zhì)提取液將10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.1～500 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，臨用前現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g（精確至0.01 g）牛奶樣品，加入5 mL乙腈渦旋混勻，超聲提取30 min，于9 500 r/min 4 ℃下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至裝有75 mg Z-Sep 填料的離心管中；凈化管渦旋混勻2 min 后，于9 500 r/min 4 ℃下離心10 min，吸取上清液，在微弱的氮?dú)饬飨麓蹈?。加?0%甲醇水定容至1 mL，12 000 r/min離心5 min，取上清液待測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件色譜柱：Waters Acquity BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；樣品室溫度：15 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）；梯度洗脫程序：0～18 min，3%～100% B；18～20 min，100% B；20～21 min，100%～3% B；21～25 min，3% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI+）；噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：241 kPa；輔助氣壓力：379 kPa；霧化氣壓力：379 kPa；去簇電壓：60 V；掃描方式：全掃描一級(jí)質(zhì)譜掃描（TOF MS），質(zhì)量采集范圍100～1 000 Da；信息依賴觸發(fā)的二級(jí)質(zhì)譜掃描（IDA），質(zhì)量采集范圍50～1 000 Da，碰撞電壓（CE）：35 V，碰撞電壓差（CES）：15 V；分辨率 ＞ 45 000。質(zhì)譜校正溶液：大氣壓化學(xué)電離源（APCI）正離子校正液；校正周期：每5針樣品穿插1針校正溶液以校正質(zhì)譜質(zhì)量數(shù)。

1.5 定性檢測(cè)

1.5.1 高分辨質(zhì)譜庫(kù)建立在LibraryView 中輸入51 種激素的分類、中英文名稱及化學(xué)式，得到每個(gè)化合物的理論質(zhì)量數(shù)。進(jìn)樣50 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在TOF MS 模式下得到每種激素的保留時(shí)間和母離子精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定值；在IDA 模式下，得到每種激素的碎片離子譜圖，將二級(jí)譜圖導(dǎo)入高分辨質(zhì)譜譜庫(kù)，與相應(yīng)的保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定值、中英文名稱等信息關(guān)聯(lián)，完成譜庫(kù)構(gòu)建。

1.5.2 定性篩查分析通過(guò)PeakView 軟件對(duì)目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、母離子及碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)與譜庫(kù)的匹配情況以及同位素分布等參數(shù)進(jìn)行定性篩查分析。如檢出的色譜峰保留時(shí)間與譜庫(kù)中的保留時(shí)間偏差小于2.5%、母離子精確質(zhì)量數(shù)與理論質(zhì)量數(shù)的偏差小于5 ppm，且同位素偏差在10 ppm以內(nèi)，則初步判定試樣中含有該激素。進(jìn)一步在IDA 模式下比對(duì)其二級(jí)碎片離子，如果有2 個(gè)及以上豐度較高的碎片離子與譜庫(kù)中相應(yīng)的碎片離子質(zhì)量數(shù)偏差在10 ppm 以內(nèi)，且相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)工作液中對(duì)應(yīng)碎片離子的相對(duì)豐度一致，可判定試樣中含有該激素。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度為50 μg/L的51種激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用UPLC-Q-TOF MS 在全掃描模式下獲得各激素的一級(jí)質(zhì)譜圖，并優(yōu)化出最佳的碎裂電壓、干燥氣溫度及流速、霧化氣壓力、鞘氣溫度和流速、毛細(xì)管電壓。在ESI+條件下，所有化合物均有響應(yīng)。進(jìn)一步比較了不同流動(dòng)相（甲醇、乙腈）以及添加劑（0.1%甲酸）的影響。如圖1 所示，當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水時(shí)，會(huì)促進(jìn)目標(biāo)物的電離，顯著提高目標(biāo)化合物的響應(yīng)，所以最終選擇甲醇和0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相條件下51種激素的一級(jí)全掃描總離子流圖（50 μg/L）Fig.1 Total ion chromatograms of 51 hormones（50 μg/L） under different mobile phase conditions

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

牛奶樣品含有豐富的脂肪和蛋白質(zhì)，乙腈通常被用作提取溶劑，以去除牛奶中大部分蛋白質(zhì)。本研究采用乙腈作為提取溶劑，51 種目標(biāo)化合物的回收率為61.3%～119%。然而乙腈提取液中含有大量的脂肪等干擾物，一方面影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)還會(huì)縮短色譜柱的使用壽命。為進(jìn)一步去除脂肪，以加標(biāo)回收率和基質(zhì)效應(yīng)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)比了5種除脂方法：冷凍除脂、EMR 填料除脂、C18填料除脂、PSA填料除脂、Z-Sep填料除脂?；|(zhì)效應(yīng)為目標(biāo)物在空白基質(zhì)中的峰面積與溶劑中峰面積的百分比。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)為70%～130%時(shí)，表示無(wú)基質(zhì)效應(yīng)；高于130%時(shí)，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；低于70%時(shí)，表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)［21-22］。

不同填料凈化后目標(biāo)化合物在不同回收率范圍的化合物個(gè)數(shù)如圖2A所示，經(jīng)PSA填料除脂后僅有4 種化合物的回收率為80%～120%，經(jīng)EMR 填料凈化除脂后有9 種化合物的回收率為80%～120%。冷凍除脂、C18填料和Z-Sep 填料3 種除脂方法，回收率在80%～120%范圍的激素分別為44、46 和47 種。不同填料凈化后目標(biāo)化合物在不同基質(zhì)效應(yīng)范圍內(nèi)的化合物個(gè)數(shù)如圖2B 所示，冷凍除脂后有41 種化合物無(wú)基質(zhì)效應(yīng)，C18填料凈化后有47 種化合物無(wú)基質(zhì)效應(yīng)，Z-Sep 填料凈化后有48 種化合物無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。進(jìn)一步比較了牛奶加標(biāo)樣品經(jīng)Z-Sep 填料和C18填料凈化后UPLC-Q-TOF MS 識(shí)別的絕對(duì)峰個(gè)數(shù)，如圖2C 所示，經(jīng)Z-Sep 填料凈化后UPLC-Q-TOF MS 獲得的識(shí)別峰個(gè)數(shù)為2 285 個(gè)，比經(jīng)C18填料凈化后獲得的識(shí)別峰個(gè)數(shù)（3 715個(gè)）減少約38%。因此本研究選擇Z-Sep填料進(jìn)行凈化。

圖2 不同除脂方式凈化后目標(biāo)化合物在不同回收率范圍（A）與不同基質(zhì)效應(yīng)范圍（B）的個(gè)數(shù)，牛奶加標(biāo)樣品經(jīng)C18填料和Z-Sep填料凈化后獲得的識(shí)別峰個(gè)數(shù)（C）Fig.2 The number of target compounds purified by different degreasing methods in different recovery ranges（A） and different matrix effect ranges（B），and the number of recognition peaks obtained from the spiked milk purified with C18 and Z-Sep sorbents（C）

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量下限在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，樣品按“1.3”方法進(jìn)行前處理后加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)UPLC-Q-TOF MS 測(cè)定，繪制工作曲線，外標(biāo)法定量。以信噪比（S/N）≥ 3 對(duì)應(yīng)的添加水平作為方法檢出限（LOD），S/N≥ 10對(duì)應(yīng)的添加水平作為定量下限（LOQ）。結(jié)果表明，51種激素在0.10～500 μg/L 范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。目標(biāo)物的名稱、分子式、測(cè)量質(zhì)量數(shù)、主要碎片、保留時(shí)間、LOD 和LOQ 如表1 所示。51 種激素的LOD 為0.03～1.67 μg/kg，LOQ 為0.10～5.00 μg/kg。

2.3.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差選用空白牛奶樣品，分別添加5、10、50 μg/kg 的目標(biāo)物，每個(gè)加標(biāo)水平做6 個(gè)平行，結(jié)果見(jiàn)表2。除十一酸睪酮、苯丙酸諾龍、康復(fù)龍、皮質(zhì)甾酮的回收率為44.6%～59.6%外，其余47種目標(biāo)化合物的回收率為61.3%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在20%以內(nèi)。本方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足測(cè)定要求。

表2 51種激素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of 51 hormones（n=6）

2.4 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法檢測(cè)北京本地超市售賣的20 份牛奶樣品，其中19 份樣品檢出孕酮，檢出量為0.80～4.51 μg/kg，1 份樣品檢出痕量的氫化可的松，檢出量為0.62 μg/kg，其他激素化合物均未檢出。圖3為1 份陽(yáng)性樣品的提取離子流圖、一級(jí)質(zhì)譜同位素豐度比圖譜與二級(jí)質(zhì)譜鏡像圖。《GB 31650-2019 食品中獸藥最大殘留限量》［23］規(guī)定氫化可的松僅作外用，未指定殘留限量。段永生等［24］對(duì)市售10 種牛奶及進(jìn)口乳清粉進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)所有樣品均含有孕酮，含量為1.7～2.6 μg/kg。吳肖肖等［25］在10份牛奶樣品檢測(cè)到1份樣品含有氫化可的松，含量為0.35 μg/kg。本文實(shí)際樣品中的激素種類和含量范圍與上述文獻(xiàn)的測(cè)定結(jié)果基本一致。

圖3 陽(yáng)性樣品的提取離子流圖（A、B）、一級(jí)質(zhì)譜同位素豐度比圖譜（C、D）與二級(jí)質(zhì)譜鏡像圖（E、F）Fig.3 Extracted ion chromatograms（A，B），isotope ratio mass spectra（C，D） and secondary mass spectra mirror images（E，F(xiàn)） of positive samples

3 結(jié) 論

本文利用QuEChERS 結(jié)合UPLC-Q-TOF MS 分析技術(shù)，建立了牛奶中51 種激素的同時(shí)定量檢測(cè)方法。本方法利用Z-Sep 填料進(jìn)行樣品凈化，有效降低了測(cè)定過(guò)程中脂肪的干擾，具有較好的回收率和靈敏度，滿足激素檢測(cè)的技術(shù)要求，可應(yīng)用于大批量樣品的快速、準(zhǔn)確測(cè)定。