陳 容，劉育形，王澤林，李澍才，張 晶*，邵 兵

（1.北京市疾病預(yù)防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013；2.四川省食品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 611731）

獸藥是畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中的關(guān)鍵投入品，在保障動(dòng)物健康和確保食品產(chǎn)量方面發(fā)揮著重要作用。由于獸藥的不規(guī)范使用、濫用或違禁使用，造成殘留超標(biāo)或違禁藥物檢出，可能會(huì)導(dǎo)致急性中毒、過(guò)敏反應(yīng)、細(xì)菌耐藥性等不良后果，不僅給消費(fèi)者帶來(lái)明顯或潛在的健康威脅，而且會(huì)損害我國(guó)相關(guān)食品在國(guó)際貿(mào)易中的聲譽(yù)，造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，獸藥殘留一直是動(dòng)物性食品安全的重點(diǎn)關(guān)注領(lǐng)域。GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》［1］等標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)規(guī)定了肉、蛋、奶等多種動(dòng)物性食品的獸藥殘留限量，其中蛋類涉及的禁用藥物種類最多，包括甲硝唑、氯丙嗪等不得檢出的9種以及磺胺類、青霉素類、四環(huán)素類等產(chǎn)蛋期禁用的34 種；在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250 號(hào)公告［2］中，禁用藥物包括β-激動(dòng)劑、萬(wàn)古霉素類及部分農(nóng)藥等33類。為保障消費(fèi)者的健康，確保禽蛋產(chǎn)品質(zhì)量安全，建立快捷、高通量、準(zhǔn)確可靠的禁用藥物同時(shí)分析方法十分必要。

目前關(guān)于動(dòng)物性食品中藥物殘留的分析方法主要有酶聯(lián)免疫法［3］、氣相色譜法［4］、高效液相色譜法［5］以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）［6-8］。LC-MS/MS 法具有高選擇性、高靈敏度、低檢出限的特點(diǎn)，是動(dòng)物性食品藥物殘留分析的首選方法［9-10］。動(dòng)物性食品藥物殘留分析應(yīng)用較為廣泛的前處理方法主要包括固相萃取法［11-13］和QuEChERS法［14-15］。前者需經(jīng)過(guò)富集、分離、凈化等步驟，耗時(shí)較長(zhǎng)；固相萃取柱多是基于極性分離和離子交換分離原理，因此不適用于化合物數(shù)量多、性質(zhì)差異大的分析場(chǎng)景；且固相萃取柱成本較高。QuEChERS 法具有快速、低成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物性食品的藥物殘留分析中，可實(shí)現(xiàn)多種性質(zhì)差異較大的化合物的高通量分析。關(guān)于藥物殘留分析的標(biāo)準(zhǔn)與研究主要針對(duì)一類藥物或幾類性質(zhì)相似的藥物，針對(duì)禽蛋中違禁藥物的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道［16-18］。本文建立了禽蛋中包括磺胺類、β-激動(dòng)劑類、四環(huán)素類、萬(wàn)古霉素類等90種違禁藥物的QuEChERS/超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜高通量分析方法，實(shí)現(xiàn)禽蛋中多種違禁藥物的同時(shí)分析，為禽蛋產(chǎn)品的質(zhì)量安全保障提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)爻校?0 種標(biāo)準(zhǔn)品和29 種內(nèi)標(biāo)（純度＞90%）購(gòu)自加拿大TRC 公司。十八烷基鍵合硅膠吸附材料（C18）、QuEChERS Z-sep/C18（120 mg Z-Sep+，300 mg Discovery DSC-18）凈化管、N-丙基乙二胺鍵合固相吸附材料（PSA）購(gòu)自美國(guó)Supelco 公司；多壁碳納米管（MWNTs，8～15 nm）購(gòu)自南京先豐納米材料科技有限公司；QuEChERS dSPE EMR-lipid凈化填料購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司。

除特殊說(shuō)明外，所用試劑均為分析純。甲醇（LC-MS 級(jí)）、乙腈和超純水均購(gòu)自迪馬科技有限公司；甲酸（純度＞99%）購(gòu)自美國(guó)Acros 公司；乙二胺四乙酸二鈉鹽（Na2EDTA）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氟化銨（NH4F，純度＞99.99%）購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q 超純水凈化處理系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITYTM超高效液相色譜儀-Xevo?TQ-XS 串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Allegra X-30R Centrifuge 冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman 公司）；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific Industries 公司）；Milli-Q超純水器（美國(guó)Millipore公司）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品及其內(nèi)標(biāo)于10 mL 容量瓶中，用含0.1%甲酸的甲醇溶液配制成1 000 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存；用甲醇將90種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，將29種內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液配制成1 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)中間液，再用10%甲醇水稀釋至所需濃度。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取雞蛋樣品2 g（精確至0.01 g）于50 mL 聚丙烯離心管中，分別加入50 μL 100 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合內(nèi)標(biāo)溶液，加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1，體積比）作為提取溶劑，渦旋30 s后加入25 mg乙二胺四乙酸二鈉鹽，渦旋15 s，超聲提取30 min，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min。準(zhǔn)確稱取50 mg（精確至0.0001 g）QuEChERS dSPE EMR-lipid 凈化填料于2 mL 聚丙烯離心管中，加入1 mL上述上清液，渦旋1 min，4 ℃下14 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)至進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.5 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速：0.35 mL/min。正離子模式流動(dòng)相：A 相為0.1%甲酸水，B 相為甲醇；梯度洗脫程序：0～1 min，3%～10% B；1～2.5 min，10%～15% B；2.5～5 min，15% B；5～7 min，15%～30% B；7～10.5 min，30%～50% B；10.5～12.5 min，50%～100% B；12.5～13.5 min，100% B；13.5～14 min，100%～3% B；14～14.5 min，3% B。負(fù)離子模式流動(dòng)相：A 相為水，B 相為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，10%～15% B；1～2.5 min，15%～50% B；2.5～6 min，50%～65% B；6～7.5 min，65%～95% B；7.5～8 min，95%～100% B；8～8.5 min，100% B；8.5～8.6 min，100%～10% B。

1.6 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣（N2）流速：800 L/h；碰撞室壓力：15.9 Pa。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

將500 μg/L的單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。分別在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，在最優(yōu)碰撞電壓條件下，確定目標(biāo)物母離子的m/z 值；然后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜全掃描，通過(guò)優(yōu)化碰撞能，選擇響應(yīng)最高的碎片離子作為目標(biāo)物的定量離子，響應(yīng)次高的碎片離子作為定性離子，質(zhì)譜參數(shù)如表1。

表1 90種目標(biāo)物及29種內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters，linear ranges and correlation coefficients of 90 target drugs and 29 internal standards

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于本實(shí)驗(yàn)的化合物數(shù)量較多，且各化合物的理化性質(zhì)差異較大，為達(dá)到更好的響應(yīng)值和分離度，比較了ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、SHIMADZU C18-AQ（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Epic Biphenyl（2.1 mm×100 mm，1.8μm）不同類型反相色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，使用HSS T3 色譜柱時(shí)所有物質(zhì)均可得到較好的峰形，且分離度和響應(yīng)值優(yōu)于其他3 種色譜柱，推測(cè)是因?yàn)門(mén)3 柱的鍵合疏水相比例較低，除常規(guī)的反相機(jī)制外，還可對(duì)極性物質(zhì)達(dá)到較好的保留效果。因此實(shí)驗(yàn)選擇ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱，進(jìn)一步對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化。

正離子模式下，以甲醇為有機(jī)相，考察了0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸-0.5 mmol/L NH4F 水溶液2 種水相對(duì)目標(biāo)物分離效果的影響。發(fā)現(xiàn)在0.1%甲酸-0.5 mmol/L NH4F 水溶液條件下，福莫特羅、達(dá)氟沙星、硝呋烯腙等目標(biāo)物的峰形較寬，存在拖尾；而在0.1%甲酸水溶液條件下，目標(biāo)物的響應(yīng)值更高，且峰形較尖銳對(duì)稱。以0.1%甲酸水溶液為水相，比較了甲醇和乙腈2 種有機(jī)相的分離效果，如圖1 所示，在乙腈體系下，硝呋烯腙、毒殺芬、丙酸睪酮等目標(biāo)物的峰形展寬，而在甲醇體系下目標(biāo)化合物的峰形、響應(yīng)值和分離度均較好，可滿足分析要求。因此，正離子模式下選擇0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相。負(fù)離子模式下分別比較了乙腈、甲醇兩種有機(jī)相，研究表明水相中加入NH4F 可改變雌二醇等目標(biāo)物的響應(yīng)值［19］，因此實(shí)驗(yàn)比較了水、1 mmol/L NH4F 兩種水相的分離效果。結(jié)果顯示，乙腈-水體系下目標(biāo)物的響應(yīng)值更高、峰形更好，因此負(fù)離子模式下選擇水-乙腈作為流動(dòng)相。

圖1 正離子模式不同有機(jī)相條件下目標(biāo)物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of targets under different organic phase conditions in positive ion mode A：methanol；B：acetonitrile

2.3 樣品前處理優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇乙腈是動(dòng)物性食品獸藥殘留提取常用的有機(jī)溶劑，在乙腈中加入一定比例的水和酸可以提高提取效率，減少共沉淀造成的目標(biāo)物損失。研究表明，隨著甲酸含量的增加，磺胺類等堿性物質(zhì)的回收率降低，當(dāng)甲酸含量為0.2%時(shí)，提取效果較好［20-21］。因此本文選擇0.2%甲酸-乙腈為提取溶劑并進(jìn)行了優(yōu)化。稱取2 g禽蛋樣品，分別加入10 mL 0.2%甲酸-乙腈水溶液（1∶1）、0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1）和0.2%甲酸-乙腈溶液，加入50 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/L），超聲離心。從表觀看，0.2%甲酸-乙腈水溶液（1∶1）產(chǎn)生的上清液較混濁，另兩種溶液的提取液均很澄清；取上清液進(jìn)行分析，結(jié)果表明以0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1）提取時(shí)大部分目標(biāo)物的峰面積大于其他兩種提取溶劑，以0.2%甲酸-乙腈提取時(shí)目標(biāo)物的峰面積最小，這可能是由于高比例的乙腈使得樣品發(fā)生團(tuán)聚，目標(biāo)物被包裹在樣品基質(zhì)中。綜上，本實(shí)驗(yàn)選用0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1）作為提取溶劑。

2.3.2 Na2EDTA 對(duì)目標(biāo)物回收率的影響由于四環(huán)素、喹諾酮等藥物易與基質(zhì)中的金屬離子和蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致提取率偏低。研究表明，提取溶液中加入EDTA 可使金屬離子與之發(fā)生螯合，從而使目標(biāo)物解離［22-23］。因此考察了Na2EDTA 對(duì)目標(biāo)化合物提取率的影響。向2 g 雞蛋中加入25 mg Na2EDTA，用10 mL 0.2%甲酸-乙腈水溶液（3∶1）超聲提取30 min，離心后取上清液進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，加入Na2EDTA 后有48 種目標(biāo)物的回收率增加，其中多西環(huán)素的平均回收率提高了24%，喹諾酮類藥物的平均回收率增加了16.4%～21.4%。

2.3.3 樣品凈化復(fù)雜的樣品基質(zhì)會(huì)對(duì)目標(biāo)物的回收率和色譜行為造成不良影響，為提升分析效果，延長(zhǎng)色譜柱壽命，通常需對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化以去除干擾成分。目前QuEChERS 法因高效、快捷和操作方便常用于動(dòng)植物食品殘留檢測(cè)的前處理［24-25］。本研究比較了C18、PSA、增強(qiáng)型除脂材料（EMRlipid）、MWNTs、Z-Sep/C18凈化管 5 種凈化材料的處理效果。分別稱取50 mg C18、20 mg PSA、50 mg EMR-lipid、50 mg Z-Sep/C18、10 mg MWNTs 填料，考察雞蛋基質(zhì)的加標(biāo)回收率和基質(zhì)效應(yīng)（圖2）。由圖2 可知，采用MWNTs 填料凈化時(shí)回收效果最差，有27 種物質(zhì)的回收率在60%以下，其中恩諾沙星、二氟沙星等7 種目標(biāo)物的回收率低于10%，這可能是MWNTs 對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生不可逆吸附所致；采用EMR-lipid 填料凈化時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率為53.2%～134%，其中85 種藥物的回收率為60%～120%，從基質(zhì)效應(yīng)來(lái)看，使用EMR-lipid 填料時(shí)，僅氟苯尼考有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其他化合物無(wú)顯著影響或有輕微抑制效應(yīng)。這可能是由于EMRlipid 凈化填料能夠選擇性去除雞蛋提取液中的脂質(zhì)等干擾成分，且不會(huì)對(duì)分析物造成顯著影響。因此選擇EMR-lipid 填料作為凈化材料。

圖2 采用不同凈化材料時(shí)雞蛋基質(zhì)中目標(biāo)物回收率的分布情況Fig.2 Distribution of target recovery in egg matrix with different purifying agents

2.4 方法確證

本研究通過(guò)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值考察了各目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)。如表2 所示，目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)為55.7%～138%，因此采用內(nèi)標(biāo)校正曲線或基質(zhì)空白提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。采用基質(zhì)空白提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行分析。硝呋烯腙、呋喃苯烯酸鈉、水楊酸、毒殺芬、呋喃丹等12種物質(zhì)因未獲得同位素內(nèi)標(biāo)，故采用基質(zhì)外標(biāo)曲線法校正，其余物質(zhì)使用內(nèi)標(biāo)曲線法校正。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/L），相應(yīng)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，90 種目標(biāo)物在對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）不小于0.99（表1）。對(duì)空白基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)分析，以信噪比（S/N）≥3 為檢出限（LOD），S/N≥10 為定量下限（LOQ），得到本方法的檢出限為0.05～1 μg/kg，定量下限為0.1～3 μg/kg（表2）。

表2 雞蛋中90種目標(biāo)物的定量下限、平均加標(biāo)回收率、RSD及基質(zhì)效應(yīng)（n=6）Table 2 Limits of quantitation（LOQs），average recoveries，RSDs and matrix effects of 90 targets in eggs（n=6）

對(duì)雞蛋空白基質(zhì)進(jìn)行LOQ、2倍LOQ、10倍LOQ 3個(gè)水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行，在優(yōu)化條件下進(jìn)行分析，計(jì)算目標(biāo)物的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。如表2 所示，雞蛋中90 種目標(biāo)物的平均回收率為60.8%～111%，RSD 為1.6%～18%。同時(shí)還考察了鴨蛋和松花蛋的加標(biāo)回收率，90 種目標(biāo)物在二者中的平均回收率分別為58.6%～118%、61.4%～120%，RSD 分別為0.90%～13%、1.2%～17%，符合藥物多殘留分析的要求。

2.5 方法應(yīng)用

應(yīng)用此方法對(duì)超市采集的106 件禽蛋樣品（包括80 件雞蛋、18 件咸鴨蛋、7 件皮蛋、1 件鵪鶉蛋）進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。共有12件樣品檢出7種禁用藥物，檢出量為0.49～22.30 μg/kg；咸鴨蛋中檢出甲硝唑、沙丁胺醇、恩諾沙星、磺胺喹啉4 種禁用藥物，檢出量為0.49～19.07 μg/kg。GB 31650-2019［1］規(guī)定甲硝唑允許作治療用，但不得在動(dòng)物性食品中檢出；磺胺類藥物（含甲氧芐啶）、喹諾酮類、多西環(huán)素等在產(chǎn)蛋期禁用，GB 31650.1-2022［26］規(guī)定這幾類藥物在禽蛋中的最大殘留限量為10 μg/kg，因此7件樣品存在藥物殘留超標(biāo)現(xiàn)象。

表3 106件禽蛋樣品中違禁藥物的檢出情況Table 3 Detection of prohibited drugs in 106 poultry egg samples

3 結(jié) 論

本文建立了禽蛋中90 種違禁藥物的QuEChERS/超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法。通過(guò)對(duì)前處理過(guò)程的優(yōu)化，有效降低了基質(zhì)中干擾物的影響。與現(xiàn)有方法相比，本方法實(shí)現(xiàn)了禽蛋中禁用藥物的高通量檢測(cè)，降低了檢測(cè)成本，并應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)中。該方法可用于日常禽蛋產(chǎn)品中違禁藥物的監(jiān)測(cè)，為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量安全保障提供技術(shù)支持。