郭巧珍，楊 奕，劉麗萍，陳紹占，張 晶

（北京市疾病預(yù)防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100013）

桃以其香甜的味道和豐富的營養(yǎng)成分成為世界上最受歡迎的水果之一。根據(jù)《2020 中國果品產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告》統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2019年我國的桃種植面積和產(chǎn)量均居世界第1位［1］。桃的果實成熟期主要在高溫高濕的夏季，病蟲害發(fā)生率極高。為保障果實品質(zhì)和產(chǎn)量，農(nóng)藥的使用必不可少［2］。農(nóng)藥殘留問題是桃類水果面臨的主要挑戰(zhàn)，也是國內(nèi)外最受關(guān)注的食品安全問題之一。GB 2763-2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［3］中規(guī)定了376種（類）食品中564種農(nóng)藥的限量，其中涉及桃的有178種。有針對性地開展農(nóng)藥殘留風(fēng)險監(jiān)測是保障農(nóng)產(chǎn)品安全的重要措施之一，為此，有必要了解桃中農(nóng)藥殘留的實際狀況。

目前，水果中農(nóng)藥的檢測多集中于蘋果、葡萄、芒果、草莓等水果［4-9］，對于桃中農(nóng)藥的檢測報道較少，已有報道也多集中于單一類別農(nóng)藥的檢測。程超等［4］研究了水果（包括桃）中有機磷的檢測；Costa 等［10］比較了不同QuEChERS 鹽析方法對罐頭桃和新鮮桃中農(nóng)藥殘留分析的影響；鄧雅靜［11］詳細(xì)研究了桃中抗菌劑的膳食暴露風(fēng)險；Li等［12］在我國不同產(chǎn)地的312 份桃中檢出39 種農(nóng)藥，并對其進行了膳食風(fēng)險評估，認(rèn)為有9種殺蟲劑為高風(fēng)險農(nóng)藥；Dong 等［13］對桃中苯磺隆和苯甲環(huán)唑的殘留水平進行了測定和暴露評估；李海飛等［14］采用QuEChERS 聯(lián)合在線凝膠滲透色譜/氣相色譜-質(zhì)譜（GPC/GC-MS）測定了蘋果、桃中的三唑類農(nóng)藥并對方法進行了評價；2021 年我國發(fā)布了GB23200.121《植物源性食品中331 種農(nóng)藥及其代謝物殘留測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》［15］。以上研究均采用單位分辨的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法，為目前農(nóng)藥殘留領(lǐng)域的主流分析方法［7，16-18］。

果蔬中通常存在農(nóng)藥多殘留現(xiàn)象，因此農(nóng)藥高通量檢測具有重要的實際意義。盡管目前已有很多基于GC-MS/MS 或LC-MS/MS 建立的農(nóng)藥多殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法或報道，但是由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性以及檢測窗口和采集點數(shù)的限制，低分辨的質(zhì)譜檢測方法在開展超高通量檢測時可能會存在假陽性或假陰性問題。以飛行時間質(zhì)譜為代表的高分辨質(zhì)譜（HRMS）分析技術(shù)具有超高的分辨能力和掃描速度，在多殘留分析中具有更多的優(yōu)勢。Li等［19］基于GC-HRMS篩查了水果中的439種農(nóng)藥殘留，殷雪琰等［20］基于氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法快速篩查和確證了農(nóng)產(chǎn)品中的222種農(nóng)藥殘留，畢軍等［21］利用QuEChERS-冷凍誘導(dǎo)液液萃取/液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測定了蔬菜水果中的77 種農(nóng)藥殘留，Wang等［22-23］利用四極桿靜電場軌道阱類型的LC-HRMS 成功建立了水果中數(shù)百種農(nóng)藥的篩查方法。即便如此，與LC-MS/MS方法相比，液相色譜-高分辨質(zhì)譜在水果農(nóng)藥殘留檢測中的實際應(yīng)用仍然較少。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜建立了鮮桃中農(nóng)藥的多殘留篩查方法，并對23份鮮桃樣本進行分析，以為水果中的農(nóng)藥殘留監(jiān)測和風(fēng)險評估提供方法學(xué)借鑒和數(shù)據(jù)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（Acquity UPLC- Xevo ? G2-XS QTOF MS，美國Waters公司），電子天平（德國梅特勒公司），KS501IKA 旋渦混勻器（艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司），冷凍離心機（美國Beckman 公司），超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），Eppendorf 移液器（艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司）。Millipore-Elix-QE-QG 超純水機（美國Millipore公司）。

LC-MS 級、色譜級乙腈（美國 J.T.Baker 公司），超純水（Milli-Q Water System 純化制備），乙酸（純度大于98%，Acros Organics 公司），亮氨酸腦啡肽（LE，純度＞96%，Sigma公司），無水醋酸鈉和無水硫酸鎂（百靈威公司），QuEChERS 填料（PSA、Carb 和無水硫酸鎂，迪馬公司）。農(nóng)藥類標(biāo)準(zhǔn)溶液（純度均≥95%）購自天津阿爾塔公司。

1.2 樣本信息

實驗用鮮桃樣品于2022 年5～7 月分別購買自北京、河北、江西、安徽、陜西、河南、江蘇、山西、山東、湖南、浙江等地，共23份。

1.3 樣本提取

將1 kg鮮桃清洗晾干后去除果核，取可食部分用多功能輔食機攪碎混勻。

稱取鮮桃約5 g（精確至0.01 g）于50 mL 離心管中，加入5 mL 含有1%乙酸的乙腈溶液，再加入0.5 g 無水醋酸鈉和2 g 無水硫酸鎂，渦旋混勻，超聲提取20 min，振蕩后于4 ℃ 下9 000 r/min 離心10 min。取上層清液1 mL 加入分散固相萃取填料PSA 25 mg，石墨化炭黑（Carb）7.5 mg 和無水硫酸鎂100 mg凈化，旋渦后于4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL用UPLC-QTOF MS測定。

基質(zhì)樣品制備：稱取5 g鮮桃樣品（篩查結(jié)果中農(nóng)藥種類少且含量低的樣品），每份樣品按上述萃取過程進行處理，所得基質(zhì)提取液用于配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、10、50、100、500μg/L。

1.4 儀器分析

色譜條件：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，粒徑1.7 μm，美國Waters公司）。柱溫：50 ℃ ，流速：0.45 mL/min，進樣體積：5.0 μL，流動相 A 為含0.1%甲酸的乙腈，流動相 B 為含 0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫：0～0.25 min，A 為2%，0.26～20 min，A 由2%升至99%，保持至第24 min，第25 min回到初始流動相，保持5 min，為下一針進樣做準(zhǔn)備。

質(zhì)譜條件：離子源溫度、毛細(xì)管電壓等參數(shù)值見表1。為保證質(zhì)量數(shù)精度，數(shù)據(jù)采集時以亮氨酸腦啡肽（50 ng/mL，m/z556.277 1）進行實時校準(zhǔn)。質(zhì)譜條件中共包含3 個通道（Function），其中Function 1 和Function 2 為不同碰撞能量（CE）下的質(zhì)譜信息，對應(yīng)的CE 值分別為6 eV 和10 ～45 eV，F(xiàn)unction 3為亮氨酸腦啡肽的實時校正質(zhì)譜圖。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Parameters of QTOF MS

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采集和處理使用美國Waters公司的UNIFI 2.0 軟件完成。在“1.4”參數(shù)條件下采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集完成后，建立處理方法；導(dǎo)入已建立的農(nóng)藥質(zhì)譜庫信息，包括化合物名稱、分子式、母離子的精確質(zhì)荷比、2 個以上特征碎片離子的精確質(zhì)荷比、保留時間等。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部312公告［24］設(shè)置篩查參數(shù)：化合物的保留時間應(yīng)至少大于死時間的2倍，目標(biāo)物與參考標(biāo)準(zhǔn)品以相同條件測定所獲得保留時間的絕對偏差應(yīng)不大于0.2 min。母離子精確質(zhì)荷比的相對偏差不大于5 ppm，子離子精確質(zhì)荷比的相對偏差不大于10 ppm。同時，利用實驗室質(zhì)控樣品進行本實驗室內(nèi)的篩查參數(shù)優(yōu)化，兼顧同位素峰與碎片離子相對豐度比，在最優(yōu)條件下進行樣品篩查檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩查方法的優(yōu)化

化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫是開展高通量篩查的基礎(chǔ)。參考文獻及農(nóng)藥殘留相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)文件，選取包含殺蟲劑、抗菌劑、除草劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等在內(nèi)的540 種農(nóng)藥開展篩查。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“1.4”條件下進行質(zhì)譜信息采集，構(gòu)建液相色譜高分辨質(zhì)譜庫，質(zhì)譜庫信息包括農(nóng)藥名稱、保留時間、母離子和碎片離子等。

2.1.1 前處理條件優(yōu)化目前水果蔬菜中農(nóng)藥高通量測定的前處理方法主要為QuEChERS 法，該法具有簡單便捷、快速準(zhǔn)確、成本低廉等優(yōu)點。本研究通過加標(biāo)實驗對QuEChERS 方法的提取溶劑和凈化填料進行優(yōu)化，兼顧數(shù)據(jù)庫中540種農(nóng)藥的種類和化學(xué)性質(zhì)，選取50種農(nóng)藥（表2）開展方法學(xué)考察，這50種藥物的辛醇水分配系數(shù)為-0.9～6.7，覆蓋范圍廣，具有較強的代表性。

表2 代表性農(nóng)藥在鮮桃中的加標(biāo)回收率Table 2 Spiked recoveries of the representatives pesticides in fresh peach samples

乙腈是QuEChERS方法中最常用的有機提取溶劑，實驗對比了乙腈和含有1%乙酸的乙腈溶液的提取效果。結(jié)果表明酸化乙腈能增強化合物的質(zhì)譜響應(yīng)，因此采用1%乙酸乙腈進行提取。桃中含有多種糖類、氨基酸、維生素、膳食纖維等，為降低這些內(nèi)源性物質(zhì)對目標(biāo)化合物的影響，需對提取液進行凈化處理。對比了分散填料C18、PSA、石墨化炭黑（Carb）單獨處理或復(fù)配處理的凈化效果，樣品中50種加標(biāo)化合物經(jīng)不同填料處理后回收率大于60%的農(nóng)藥種數(shù)見圖1。結(jié)果顯示，僅使用1種填料時，盡管PSA 的效果優(yōu)于C18，但88%的農(nóng)藥在鮮桃基質(zhì)中的抑制效應(yīng)較明顯；當(dāng)PSA 與Carb聯(lián)合使用時，基質(zhì)抑制的農(nóng)藥比例降為58%，推測是兩種填料可有效去除鮮桃中有機酸、色素等干擾物質(zhì)的緣故。由于Carb 的用量增加可以降低基質(zhì)效應(yīng)，故進一步對Carb 的使用量進行優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)對于1 mL 提取液，使用25 mg PSA 和7.5 mg Carb 可去除干擾，有效凈化目標(biāo)化合物。因此本實驗采用1%乙酸乙腈提取后，取1 mL提取液用25 mg PSA和7.5 mg Carb凈化。

圖1 經(jīng)不同凈化填料處理后回收率高于60%的農(nóng)藥種數(shù)Fig.1 Number of pesticides with recoveries higher than 60% in peach samples after purifed with different fillers extract solution volume：1 mL

2.1.2 方法確證在質(zhì)譜檢測中目標(biāo)化合物的電離易受到基質(zhì)的干擾，導(dǎo)致離子抑制或增強，使得基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值與純?nèi)軇┑捻憫?yīng)不一致，且不同化合物受到的基質(zhì)影響不同。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)過大時，會降低靈敏度，影響方法準(zhǔn)確性，因此需要對基質(zhì)效應(yīng)進行評價?；|(zhì)效應(yīng)（ME）%=基質(zhì)匹配峰面積/純?nèi)軇┓迕娣e×100%。ME%大于120%為基質(zhì)增強效應(yīng)，小于80%為基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，所選取的50 種農(nóng)藥中32%屬于基質(zhì)增強效應(yīng)（122%～160%），50%屬于基質(zhì)抑制效應(yīng)（38.7%～79.4%）。

用基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，利用最低濃度母離子提取離子色譜峰的信噪比（S/N）推算目標(biāo)物農(nóng)藥的檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10）。結(jié)果表明，目標(biāo)農(nóng)藥在鮮桃中的LOD 為0.1～5.0 μg/kg，LOQ 為0.4～15 μg/kg。

為最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行定量分析。在均質(zhì)的空白樣品中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加高、中、低3個濃度水平，每個水平設(shè)6個平行，計算目標(biāo)化合物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，代表性化合物的回收率為70.3%～127%（表2），RSD為0.60%～23%。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

（續(xù)表2）

2.2 樣品篩查及定量

23 份樣品經(jīng)“1.3”方法處理后，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜的MSE模式進行質(zhì)譜信息采集，獲得樣本的總離子流圖，利用本實驗室建立的農(nóng)藥譜庫進行篩查，篩出的物質(zhì)詳細(xì)信息見表3。在23 份桃樣本中檢出33 種農(nóng)藥，其中殺蟲劑占49%（16 種），抗菌劑占33%（11 種），其余為除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑（圖2）。檢出頻率最高的農(nóng)藥包括殺蟲劑除蟲菊素和抗菌劑吡唑醚菌酯（圖3）、氧化萎銹和苯醚甲環(huán)唑，在15 份樣本中均有檢出，檢出率為65%；其次是新型抗菌劑8-羥基喹啉，檢出率61%。所有樣品均有一種或多種農(nóng)藥檢出，有兩種以上農(nóng)藥同時檢出的樣本，大多是一種或兩種殺菌劑和一種或多種殺蟲劑共殘留。

圖2 鮮桃樣品中農(nóng)藥的檢出情況Fig.2 Detection of pesticides in fresh peach samples

圖3 抗菌劑吡唑醚菌酯在標(biāo)準(zhǔn)品（上）及鮮桃樣品（下）中的色譜圖及對應(yīng)的質(zhì)譜碎片圖Fig.3 The chromatograms and mass fragments of pyraclostrobin in standard（up） and fresh peach samples（down）

表3 鮮桃中篩查出的農(nóng)藥種類及信息Table 3 The pesticide information screened from the fresh peach samples

采用基質(zhì)校準(zhǔn)曲線對23份鮮桃樣品中檢出的33種農(nóng)藥進行定量，結(jié)果見表4。從檢出濃度來看，90%的檢出含量小于0.1 mg/kg；超過1 mg/kg的農(nóng)藥有3種，分別是多菌靈（2.10 mg/kg）、丙環(huán)唑（1.80 mg/kg）和肟菌酯（1.80 mg/kg）。篩查出的33種農(nóng)藥中有18種農(nóng)藥在GB2763-2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》［3］中有最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其余無相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。共檢測到抗菌劑多菌靈和氟硅唑超標(biāo)樣本各1份。

表4 鮮桃中的農(nóng)藥殘留情況Table 4 The residue of pesticides in fresh peach samples

2.3 與文獻比較

本研究在不同產(chǎn)地的桃樣品中檢出了33 種農(nóng)藥殘留，高檢出率的農(nóng)藥包括抗菌劑（吡唑醚菌酯、氧化萎銹、苯醚甲環(huán)唑）、殺蟲劑（除蟲菊素）等。Li等［12］在300余份鮮桃樣品中檢出了39種農(nóng)藥，樣本總檢出率為92.3%。本研究的檢出種數(shù)和檢出率與之相當(dāng)，但具體農(nóng)藥種類有所差異，兩者檢出的農(nóng)藥中有10種相同，包括抗菌劑5種（多菌靈、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑、氟硅唑和戊唑醇），殺蟲劑5種（啶蟲脒、滅幼脲、甲基毒死蜱、噠螨靈和螺螨酯），文獻［12］的檢出含量為0.001～3.4 mg/kg，稍高于本研究；除此之外，其余20余種農(nóng)藥各不相同，說明桃種植過程中的農(nóng)藥使用非常多樣化。Costa等［10］在新鮮桃中檢出戊唑醇、苯并環(huán)唑、馬拉硫磷等，Liu 等［25］在水果中檢測到多菌靈，Bibi等［26］在橘類水果中檢出莠去津和嘧菌酯，Jafarian 等［27］在棗中檢測到甲草胺和螺螨酯。本實驗檢出的農(nóng)藥與上述報道中的檢出農(nóng)藥一致，說明這些農(nóng)藥在水果栽培中被廣泛使用。但是本文中氯芬新、多效唑、溴蟲腈等未被推薦用于桃的農(nóng)藥也被檢出，且最高殘留濃度為0.071 mg/kg，說明果農(nóng)或種植企業(yè)未遵循用藥指導(dǎo)，或者果園內(nèi)不同水果未區(qū)分用藥?？紤]到這些藥物的潛在危害，需進一步開展殘留水平監(jiān)測和健康暴露評估，為相關(guān)部門做好用藥監(jiān)管和控制提供技術(shù)支持。

3 結(jié) 論

農(nóng)藥殘留的高通量篩查離不開快速可靠的提取凈化前處理技術(shù)和強大的儀器分析技術(shù)。本研究基于改良的QuEChERS 技術(shù)建立了桃中農(nóng)藥殘留的高通量篩查前處理方法，代表性農(nóng)藥經(jīng)樣品前處理及分析，回收率均在70%～130%之間，RSD 小于25%，滿足高通量監(jiān)測的技術(shù)指標(biāo)要求。對23 份桃樣品進行篩查，共檢出33種農(nóng)藥，其中殺蟲劑16種，抗菌劑11種，其余為除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑。

由于樣本數(shù)量有限，篩查結(jié)果不能代表相關(guān)產(chǎn)品的殘留情況。后續(xù)會進一步收集不同產(chǎn)地的桃樣品進行分析，以更準(zhǔn)確更全面地反映農(nóng)藥使用情況，為食品安全管理提供更充分的數(shù)據(jù)支持。