馮 超，盧大勝，汪國(guó)權(quán)，徐 騫，邱歆磊，金玉娥，陳宇航

（上海市疾病預(yù)防控制中心，國(guó)家環(huán)境保護(hù)新型污染物環(huán)境健康影響評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200336）

我國(guó)是全世界最大的農(nóng)藥生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，由于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化水平低、農(nóng)民用藥的安全意識(shí)淡薄，我國(guó)的農(nóng)藥污染情況相比國(guó)外更為嚴(yán)重［1-2］，呈現(xiàn)種類多、地域差異大的趨勢(shì)［3］。然而，受限于人員與設(shè)備，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法僅適用于日常的靶向監(jiān)測(cè)，不能實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物的擬靶向廣譜篩查與鑒定。目前，食品安全領(lǐng)域的擬靶向篩查技術(shù)主要基于色譜與高分辨質(zhì)譜的聯(lián)用［4-5］，化合物的鑒定主要參考其色譜行為（保留時(shí)間RT）和質(zhì)譜特征，包括一級(jí)質(zhì)譜特征（精確質(zhì)荷比、同位素輪廓、中性丟失和加合形態(tài)）與二級(jí)質(zhì)譜特征（MS2）［6］。然而，廣譜和高通量的化合物篩查與鑒定需考慮以下3 方面：1）化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。雖然實(shí)驗(yàn)室自建的數(shù)據(jù)庫(kù)可信度更高，但建庫(kù)不僅需儲(chǔ)備大量的標(biāo)物，其過程也極為耗時(shí)耗力，所以商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)（或方法包）仍為多數(shù)實(shí)驗(yàn)室首選；2）低歧視性的樣品提取與廣譜的儀器分析方法。目前高穩(wěn)定性和低歧視性的QuEChERs 方法是該領(lǐng)域的主流提取方法［7］，色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用則是污染物廣譜篩查中最理想的儀器，特別是多色譜系統(tǒng)（如氣相色譜-質(zhì)譜與液相色譜-質(zhì)譜）的互補(bǔ)可以更完整地了解樣品中的化合物全貌［3］；3）高效的數(shù)據(jù)分析方法。分析方法主要包括靶向、擬靶向與非靶向3種；靶向方法主要基于數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物色譜與質(zhì)譜特征的匹配［8］進(jìn)行數(shù)據(jù)篩查；擬靶向方法則主要針對(duì)已知分子結(jié)構(gòu)，但缺乏RT與MS2信息的化合物。擬靶向方法通常僅通過一級(jí)質(zhì)譜特征（MS1）匹配篩查數(shù)據(jù)，結(jié)果的可靠性低，假陽(yáng)性多，需進(jìn)一步借助其他技術(shù)來排除假陽(yáng)性，這些技術(shù)包括通過組學(xué)差異挖掘數(shù)據(jù)中的質(zhì)譜特征［9］，以及近年來在代謝組學(xué)和環(huán)境科學(xué)中逐漸流行的機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)［10-11］；非靶向方法則主要針對(duì)未知結(jié)構(gòu)的化合物，如果未知物與已知化合物的結(jié)構(gòu)以及質(zhì)譜特征存在相似性，則可通過匹配質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中的特征二級(jí)碎片或者特征中性丟失發(fā)現(xiàn)潛在的同系物或環(huán)境轉(zhuǎn)化物［12］，繼而通過質(zhì)量虧損、化合物轉(zhuǎn)化規(guī)律和質(zhì)譜裂解規(guī)律推導(dǎo)疑似化合物的結(jié)構(gòu)，或在了解化合物變化規(guī)律的前提下，通過預(yù)測(cè)或推導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)，繼而在擬靶向的基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩查與鑒定［13］。然而，由于化合物在質(zhì)譜離子化時(shí)普遍存在源內(nèi)裂解的現(xiàn)象，以及同分異構(gòu)化合物在質(zhì)譜中難以被區(qū)分，擬靶向方法和非靶向方法的鑒定結(jié)果仍缺乏可信度，需要標(biāo)準(zhǔn)品幫助確證結(jié)果，因此標(biāo)準(zhǔn)品的匱乏始終是化合物鑒定的瓶頸［14］，尤其對(duì)于農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物。近年生物轉(zhuǎn)化技術(shù)也在分析化學(xué)領(lǐng)域得到了應(yīng)用，主要通過肝微粒［15］或微生物（細(xì)菌和藻類等）［16］等媒介模擬農(nóng)藥在環(huán)境媒介下的轉(zhuǎn)化得到農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物，從而有效獲取轉(zhuǎn)化物的色譜與質(zhì)譜特征，實(shí)現(xiàn)化合物的一級(jí)鑒定［14］。

本研究基于廣譜低歧視的QuEChERS 提取方法和液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱聯(lián)用（LC-Q-Orbitrap）檢測(cè)，在組學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)和生物轉(zhuǎn)化等多學(xué)科技術(shù)的幫助下，搭建了基于數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的靶向篩查方法，并借助組學(xué)和人工智能（AI）預(yù)測(cè)技術(shù)建立了農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的擬靶向篩查方法。同時(shí)，運(yùn)用肝微粒體外孵育技術(shù)建立了疑似轉(zhuǎn)化物的高置信度確證方法。該方法具有高效、廣譜和高特異性等特點(diǎn)，可滿足不同食品類型中多農(nóng)藥殘留及其轉(zhuǎn)化物的快速篩查與確證需求（圖1）。鑒于多農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物在食品中的殘留分析重點(diǎn)在于廣譜的樣品提取方法、低歧視的數(shù)據(jù)采集方法和高通量與高置信度的數(shù)據(jù)挖掘方法，本研究將通過以下4 方面討論如何在真實(shí)樣本中系統(tǒng)地篩查并確證農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物的陽(yáng)性結(jié)果：1）廣譜的農(nóng)藥提取方法；2）高分辨質(zhì)譜中的二級(jí)質(zhì)譜特征采集方式；3）基于數(shù)據(jù)庫(kù)多元參數(shù)匹配的靶向數(shù)據(jù)篩查；4）基于AI預(yù)測(cè)與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的擬靶向篩查。

圖1 擬靶向篩查方法的技術(shù)框架Fig.1 Framework of suspect screening method

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

所有農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer（Augsburg，Germany）或者 LGC Standards（Teddington，UK），純度均大于95%；甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸鈉、無水硫酸鎂（HPLC 級(jí)試劑）均購(gòu)自Sigma-Aldrich（Steinheim，Germany），其他試劑均為HPLC級(jí)；去離子水采用Milli-Q-Plus超純水設(shè)備制備。

磷酸緩沖液（0.1 mol/L）、NADPH 再生系統(tǒng)（0.1 mol/L）和混合人肝微粒（20 mg/mL，0.5 mL/管）均購(gòu)自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；固相萃取小柱（Oasis HLB，6 cc，500 mg）購(gòu)自Waters（Milford，USA）；食品基質(zhì)如玉米（Rye，EUPT-CF10）、檸檬（Lemon，EUPT-FV19）、綠豆（Green bean，EUPT-FV20）、紅甘藍(lán)（Red cabbage，EUPT-FV21，EUPT-FV-SM11）、洋蔥（Onion，EUPT-FVSM12）、茄子（Aubergine，EUPT-FV-SM13）、西紅柿（Tomato，EUPT-FV-SM14）和小麥（Wheat kernel，EUPT-FV-SM15）均來自歐盟農(nóng)藥參比實(shí)驗(yàn)室（EURL，www.eurl-pesticides.eu）；75件菊花茶采自北京、浙江和上海三地的商超和菜場(chǎng)；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

液相色譜控制、質(zhì)譜調(diào)諧采集與進(jìn)樣序列控制軟件分別為Chromeleon、Tune 和Xcalibur v4.0；靶向和擬靶向數(shù)據(jù)分析軟件為TraceFinder v4.1 和Compound Discoverer v3.3；機(jī)器學(xué)習(xí)的RT 模型構(gòu)建平臺(tái)為R（Retip Package，www.retip.app），特征二級(jí)碎片預(yù)測(cè)軟件為CFM-ID v4.5；靶向數(shù)據(jù)庫(kù)為實(shí)驗(yàn)室自建，約含1 000 多種農(nóng)藥原形物與200 多種轉(zhuǎn)化物；擬靶向數(shù)據(jù)庫(kù)為文獻(xiàn)與在線數(shù)據(jù)庫(kù)收集（來自PPDB和Swisspest19），約含1 200多種農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物。

1.3 提取方法

取1 g 干樣/5 g 半干樣/10 g 濕樣于50 mL 離心管，加入10 mL（干樣）/5 mL（半干樣）/不加（濕樣）水，干樣/半干樣在加水后分別浸泡20 /10 min。然后，加入10 mL含1%乙酸的乙腈，渦旋振蕩1 min后，先后加入1 g乙酸鈉和4 g無水硫酸鎂，劇烈振搖后離心2 min（5 000 r/min，約2 000 G），將約1 mL的上清液過0.22 μm 的PVDF 濾膜（Millex FG，Millipore，USA），待上機(jī)。對(duì)于色素、硫化物和油脂等含量較高的食品如中草藥、韭菜和牛油果，將提取的上清液作2～5倍稀釋后上機(jī)分析。

1.4 色譜條件

液相色譜為Dionex UltiMate 3000 高效液相色譜系統(tǒng)（Thermo Fisher ScientificTM，USA），Thermo Accucore aQ（150 mm×2.1 mm：2.6 μm）色譜柱，柱溫20 °C，流速0.4 mL/min。流動(dòng)相A 為2 %甲醇（含0.1 %甲酸和5 mmol/L 甲酸銨），流動(dòng)相B 為98%甲醇（含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸銨）。梯度洗脫程序?yàn)椋?5～0 min，100% A；0～4 min，100%～80% A，4～5.5 min，80%～60% A，5.5～10.5 min，60%～0% A；10.5～12.9 min，0% A；12.9～15 min，0%～100% A。

1.5 質(zhì)譜條件

四極桿-靜電場(chǎng)軌道肼質(zhì)譜（Q-Orbitrap MS，Q Exactive）分別采用ESI+與ESI-電離模式，配備加熱電噴霧離子源（HESI），源參數(shù)為：噴霧電壓分別為3.8 kV（ESI+）與3.2 kV（ESI-），離子傳輸管溫度為320 ℃，鞘氣（霧化氣）流速為 40 arb.unit，輔助氣流速為10 arb.unit，輔助氣溫度為350 ℃。質(zhì)譜采集中同時(shí)進(jìn)行MS1和MS2掃描，一次MS1掃描搭配5次MS2掃描。

MS1掃描模式為全掃描（FS），掃描范圍為m/z80～1 200；分辨率為70 000 FWHM；自動(dòng)增益控制（AGC）為1×106；最大注入時(shí)間（MAX IT）為100 ms。

MS2掃描模式分為數(shù)據(jù)依賴（DDA，DDA-List）和非數(shù)據(jù)依賴（DIA或AIF）兩類，其中DDA 參數(shù)：分辨率為17 500 FWHM；AGC 為1×105；MAX IT 為50 ms；事件循環(huán)次數(shù)（Loop count）為5；質(zhì)量隔離窗（Isolation window）為2 Da；歸一化碰撞能量（NCE）為20、40、60；二級(jí)觸發(fā)響應(yīng)閾值為2×104；同位素排除（Exclude isotope）為 ON；峰頂觸發(fā)時(shí)間（Apex trigger）為2～6 s；動(dòng)態(tài)排除時(shí)間（Dynamic exclusion）為5 s。DDA-List 將關(guān)注化合物加合形態(tài)的m/z導(dǎo)入特定列表（Inclusion list），其他參數(shù)與DDA 一致。DIA 將m/z100～900 分為16 個(gè)間隔50 Da 的質(zhì)量區(qū)間段，對(duì)每個(gè)質(zhì)量段內(nèi)的母離子進(jìn)行混合MS2掃描。AIF 同時(shí)將質(zhì)量段內(nèi)的所有母離子進(jìn)行MS2掃描。DIA 和AIF 中的分辨率、AGC 和碰撞能量等參數(shù)與DDA模式一致。

1.6 保留時(shí)間預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建

基于實(shí)驗(yàn)室已有約400 種農(nóng)藥的小規(guī)模數(shù)據(jù)，基于R 平臺(tái)的Retip 包中的4 種機(jī)器學(xué)習(xí)算法（決策樹：隨機(jī)森林、XGBoost、lightGBM；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)：Keras），化合物的分子描述符組（Molecular descriptor set，每個(gè)化合物約含3 800 個(gè)變量信息）和化合物在本方法下的RT 信息，將數(shù)據(jù)以訓(xùn)練集和測(cè)試集（8∶2）的分配形式用4 種不同算法進(jìn)行訓(xùn)練，構(gòu)建混合預(yù)測(cè)模型（Ensemble model），測(cè)試集在RT 偏差＜1.0 min的閾值內(nèi)陽(yáng)性物質(zhì)的篩查率達(dá)到97%［17］。

1.7 肝微粒孵育方法

在3 mL 的EP 管中加入約420 μL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L），再加入60 μL 的NADPH 再生系統(tǒng)（0.1 mol/L）和5 μL農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)（2 mg/mL），然后加入20 μL混合人肝微粒（20 mg/mL），于37 ℃水浴中孵育2 h，加入200 μL 的冰乙腈（-18 ℃）終止反應(yīng)，離心1 min（4 000 r/min，約2 000 G），取上清液過0.22μm的PVDF濾膜后，待上機(jī)。

1.8 數(shù)據(jù)篩查策略

樣本中數(shù)據(jù)篩查的策略如圖1所示：待測(cè)物經(jīng)提取和儀器數(shù)據(jù)采集（FS-DDA-List）后，數(shù)據(jù)中農(nóng)藥原形物采用基于自建數(shù)據(jù)庫(kù)的靶向方法進(jìn)行分析，化合物鑒定的維度圍繞RT、MS1和MS2三個(gè)維度的信息，質(zhì)譜特征（Mass feature）依次通過1）m/z（Δm/z＜5 ppm，響應(yīng)＞2×105，S/N＞5）；2）溶劑空白（Blank，10 倍背景扣除）；3）同位素輪廓（IP，Δm/z＜5 ppm，響應(yīng)偏差＜30%，總體打分＞70%）；4）RT（＜ 0.3 min）；5）MS2（至少匹配2個(gè)的二級(jí)特征，Δm/z＜10 ppm，響應(yīng)＞1×104）共5個(gè)參數(shù)進(jìn)行過濾，均能滿足的質(zhì)譜特征可認(rèn)為是陽(yáng)性結(jié)果（鑒定級(jí)別=1）。數(shù)據(jù)中農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物用基于結(jié)構(gòu)列表的擬靶向方法分析，由于列表中的化合物缺失RT 和MS2信息，因此方法基于自建的RT 預(yù)測(cè)模型［17］，以及美國(guó)環(huán)保署（EPA）推薦的MS2預(yù)測(cè)軟件（CFM-ID）［11］，對(duì)列表中已知結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行RT 與MS2預(yù)測(cè)，除了RT 過濾參數(shù)（＜1.0 min）設(shè)定較為寬泛外，其他過濾參數(shù)與靶向方法一致。如滿足以上篩查特征，則被認(rèn)為是疑似結(jié)果（鑒定級(jí)別=3），如果農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的篩查結(jié)果可通過肝微粒體外合成輔助確證，則結(jié)果的置信度達(dá)2級(jí)。

2 結(jié)果與討論

2.1 廣譜的農(nóng)藥提取方法

為確保方法對(duì)食品基質(zhì)的普適性以及對(duì)絕大多數(shù)親水性較弱的農(nóng)藥有較好的回收率，本研究對(duì)提取進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，提取時(shí)不同含水量樣品的取樣與加水量不同，但提取過程盡可能一致。通過乙腈和鹽析輔助的液液萃取方法將樣本中親水的雜質(zhì)與親有機(jī)相的農(nóng)藥進(jìn)行兩相分離，去除絕大多數(shù)高極性物質(zhì)。方法適用于不同含水量的食品（如谷物、中草藥和奶粉等干樣，禽蛋、水產(chǎn)品和菌菇等半干樣，以及多數(shù)的果蔬等濕樣）。由于前期實(shí)驗(yàn)或報(bào)道證明，石墨化炭黑（GCB）或者N-丙基乙二胺（PSA）均易造成個(gè)別物質(zhì)的吸附，如乙酰甲胺磷和滅菌丹等農(nóng)藥易被PSA 吸附［18］，六氯苯等平面結(jié)構(gòu)農(nóng)藥易被GCB 吸附［19］。此外，復(fù)雜基質(zhì)（如綠茶和中草藥）中大量雜質(zhì)也難以通過分散性填料有效凈化。因此，本方法不使用任何選擇性的凈化試劑，主要采用多倍稀釋方法對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的提取液進(jìn)行凈化，以降低所有基質(zhì)的上樣量和防止個(gè)別物質(zhì)的損失（圖2A）。

圖2 基于QuEChERS的不同類型食品基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化提取方法（A）和PPDB數(shù)據(jù)庫(kù)上1 364種農(nóng)藥的油水分配系數(shù)（LogP）預(yù)測(cè)（B）Fig.2 Unified QuEChERS-based extraction method for different food types（A） and LogP prediction of 1 364 pesticides from PPDB database（B）

研究通過對(duì)PPDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（sitem.herts.ac.uk）中1 364 個(gè)農(nóng)藥活性物質(zhì)的LogP［20］進(jìn)行匯總與預(yù)測(cè)（圖2B），調(diào)研了不同親水性/極性農(nóng)藥提取和儀器分析的可行性。結(jié)果表明，只有極少數(shù)（小于5%）農(nóng)藥（如百草枯、敵草快、草銨膦等）的LogP值小于0，即屬于較高極性化合物，這類物質(zhì)不僅難以通過液液萃取直接從水相中萃取，還需使用離子對(duì)色譜、HILIC體系［21］或者超臨界流體色譜（SFC）［22］才能實(shí)現(xiàn)良好的色譜保留。而對(duì)于絕大多數(shù)中低極性農(nóng)藥的分析，均可通過與本方法［6］一致的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（反相體系，ESI 源）進(jìn)行分析，少部分的低極性農(nóng)藥（如有機(jī)氯或擬除蟲菊酯類農(nóng)藥）則需采用氣相色譜-質(zhì)譜（EI源）進(jìn)行分析［23］。

基于以上提取方法和理論依據(jù)，研究來自歐盟農(nóng)藥殘留參比實(shí)驗(yàn)室（EURL）的果蔬和飼料等食品基質(zhì)，如玉米（谷物，干樣）、檸檬（水果，濕樣）、綠豆（蔬菜，半干樣）和紅甘藍(lán)（蔬菜，濕樣）中不同類型（如擬除蟲菊酯、有機(jī)磷、新煙堿、三唑等）農(nóng)藥的加標(biāo)回收率（表1）。結(jié)果顯示，不同基質(zhì)中不同類型化合物的回收率為66.3%～126%，方法對(duì)不同基質(zhì)和農(nóng)藥的適用性良好，驗(yàn)證了該提取體系的可靠性。

表1 4類食品基質(zhì)中多農(nóng)藥殘留的回收率Table 1 Recoveries of pesticide multi-residues in four types of food matrices

2.2 高分辨數(shù)據(jù)采集模式的比較

為使低歧視的儀器分析方法盡可能采集到各類農(nóng)藥的MS1和MS2特征，研究評(píng)價(jià)了目前最常見的3種不同高分辨質(zhì)譜二級(jí)采集模式在紅甘藍(lán)（Red cabbage，EUPT-FV-SM11）中陽(yáng)性農(nóng)藥篩查中（圖3A）的應(yīng)用，二級(jí)采集模式分別為FS-DDA（數(shù)據(jù)依賴性掃描模式）、FS-DIA（數(shù)據(jù)非依賴性性掃描模式）、FS-AIF（全碎片掃描模式）和FS-DDA-List（帶列表的數(shù)據(jù)依賴性掃描模式）。結(jié)果顯示，在無RT輔助確證的情況下，使用DDA、DIA、AIF、DDA-List共篩選出12、16、16、16個(gè)陽(yáng)性結(jié)果和1、8、18、1個(gè)假陽(yáng)性結(jié)果（圖3B）。由于數(shù)據(jù)依賴性的掃描方法會(huì)依據(jù)質(zhì)譜特征的響應(yīng)強(qiáng)度排序進(jìn)行二級(jí)掃描，所以DDA 的4 個(gè)假陰性（黃色標(biāo)注）結(jié)果是由其相對(duì)的低豐度（響應(yīng)普遍低于5×107）引起（圖3A）；而DIA 和AIF 等非數(shù)據(jù)依賴性的掃描方式則可以檢出所有（16種）陽(yáng)性特征，但其假陽(yáng)性數(shù)量卻顯著高于DDA 方式，原因是這些模式下二級(jí)碎片的共流混雜度太高導(dǎo)致MS2數(shù)據(jù)的特異性較差，除非有RT 協(xié)助確證，否則將極大增加后續(xù)排除假陽(yáng)性結(jié)果的工作量。為了解決DDA模式下的響應(yīng)歧視問題，DDA-List通過設(shè)置擬靶向化合物列表的方式，優(yōu)先篩查列表中目標(biāo)物，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高陽(yáng)性檢出率和低假陽(yáng)性率。以上研究表明，非數(shù)據(jù)依賴性的掃描方式可獲取更全面的化合物二級(jí)質(zhì)譜信息，但數(shù)據(jù)的特異性不如依賴性的掃描方式，需要其他維度（如RT）補(bǔ)充以進(jìn)一步排除假陽(yáng)性數(shù)據(jù)，而帶列表的數(shù)據(jù)依賴性掃描方式則可以兼顧數(shù)據(jù)的檢出率和特異性。

圖3 紅甘藍(lán)中陽(yáng)性農(nóng)藥列表（A）和不同掃描模式下紅甘藍(lán)中陽(yáng)性/假陽(yáng)性農(nóng)藥的篩查結(jié)果（B）Fig.3 List of positive pesticides in red cabbage（A） and screening result of positive/false positive pesticides in red cabbage under different scanning modes（B）

2.3 基于數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的靶向篩查

2.3.1 多元參數(shù)的特征過濾在液相色譜-高分辨質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)中，靶向數(shù)據(jù)的特征挖掘主要基于數(shù)據(jù)庫(kù)的多元參數(shù)匹配，涉及RT 偏差、MS1（m/z偏差、同位素輪廓打分）和MS2（特征碎片離子）等參數(shù)。研究基于一個(gè)小麥樣本（EUPT-FV-SM15）在ESI+模式下采集的FS-DDA數(shù)據(jù)，依次通過m/z、溶劑空白、同位素輪廓、RT 和MS25 個(gè)維度的參數(shù)進(jìn)行特征過濾。結(jié)果顯示，滿足質(zhì)荷比偏差的疑似特征共1 779 種，溶劑背景的扣除將可將特征數(shù)降至1 666 個(gè)，而同位素輪廓和RT 對(duì)特征數(shù)的過濾貢獻(xiàn)較大，依次將特征數(shù)削減至267 個(gè)和72個(gè)。經(jīng)MS2確證后（僅全掃描的數(shù)據(jù)需要二次進(jìn)樣確證），能達(dá)標(biāo)的物質(zhì)僅剩13種（圖4）。將該過濾后的結(jié)果與官方公布的陽(yáng)性結(jié)果相比，陽(yáng)性結(jié)果除一個(gè)ESI-出峰的化合物（Fluroxypyr）外都在其中，且無假陽(yáng)性的特征。因此，在多元參數(shù)的限定下，可以最大程度地減少候選特征數(shù)和篩查工作量，增加結(jié)果的置信度。

圖4 不同維度參數(shù)過濾下的質(zhì)譜特征數(shù)Fig.4 Number of mass feature under different dimension parameter filtering

2.3.2 靶向數(shù)據(jù)篩查的應(yīng)用研究在紅甘藍(lán)樣品中發(fā)現(xiàn)了疑似苯菌酮（Metrafenone）化合物（圖5A），其+H 特征峰的質(zhì)荷比偏差（Δm/z）小于5 ppm，響應(yīng)（＞2×105）和信噪比（S/N＞5）均滿足要求，而其+Na 的加合形態(tài)也能滿足Δm/z＜ 5 ppm，RT偏差也小于0.5 min。由于化合物含鹵素（溴），其同位素輪廓的特異性較好，且每個(gè)同位素特征（M+1、M+2、M+3等）與理論的響應(yīng)偏差（＜30%）和Δm/z（＜ 5 ppm）均滿足要求，同位素輪廓打分為100%（＞70%）（圖5B）。除MS1特征，該化合物MS2的特征也與mzCloud 數(shù)據(jù)庫(kù)匹配良好（94.1 分，圖5B）。此外，化合物還存在明顯的源內(nèi)裂解（in-source CID）現(xiàn)象，在MS1特征中存在的m/z209.080 70 和m/z229.970 00 兩個(gè)離子與苯菌酮的特征離子（m/z409.064 12）具有相同的RT和相似的峰形（圖5D），且這兩個(gè)特征屬于苯菌酮的主要特征MS2（圖5C），其MS2中個(gè)別離子（如m/z181.049 3和m/z168.964 6等）也存在于苯菌酮的MS2輪廓中。

圖5 基于多元參數(shù)綜合鑒定疑似苯菌酮農(nóng)藥Fig.5 Comprehensive identification of suspected metrafenone pesticides based on multivariate parameters

2.4 基于AI預(yù)測(cè)與生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的擬靶向篩查方法

傳統(tǒng)的擬靶向篩查基于疑似列表做MS1特征匹配來發(fā)現(xiàn)疑似特征，篩查結(jié)果的置信度較低。本方法受益于組學(xué)和AI 預(yù)測(cè)技術(shù)，在扣除空白特征、MS1特征匹配的基礎(chǔ)上，基于疑似特征可能的化合物結(jié)構(gòu)（SMILES）來預(yù)測(cè)保留時(shí)間（RT）和MS2后進(jìn)行特征過濾。在實(shí)際應(yīng)用中，基于MS1特征篩查，本方法在75件菊花茶中發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的殘留，且其預(yù)測(cè)RT偏差均滿足要求（＜1.0 min）。為進(jìn)一步確證轉(zhuǎn)化物的篩查結(jié)果，研究通過肝微粒體外孵育技術(shù)，獲得部分農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的色譜與質(zhì)譜特征，其中8 種轉(zhuǎn)化物的MS2得到解析，且其RT 偏差（＜ 0.3 min）與樣本特征較一致（表3）。如咪鮮胺的疑似轉(zhuǎn)化物BTS44596（圖6），其孵育RT 與樣本RT 的偏差為 0.11 min，通過AI輔助的質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析后，注釋了其主要特征碎片（m/z335.293 64、308.000 43、216.921 83）的結(jié)構(gòu)，確證了該化合物的分子結(jié)構(gòu)。最后，通過孵育后的特征與樣品中的特征進(jìn)行色譜與質(zhì)譜特征的匹配，確證該轉(zhuǎn)化物的陽(yáng)性結(jié)果，鑒定的置信度為2a級(jí)，有關(guān)化合物的鑒定置信度級(jí)別見表4［14］。

表3 菊花茶中8種農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物的篩查與鑒定結(jié)果Table 3 Summary of eight pesticide transformation products in chrysanthemum tea

表4 高分辨質(zhì)譜中化合物的鑒定置信度級(jí)別Table 4 Proposed identification confidence levels in high resolution mass spectrometry

圖6 經(jīng)肝微粒孵育后獲得的咪鮮胺轉(zhuǎn)化物（BTS44596）的鑒定與碎片注釋Fig.6 Identification and fragment ions annotation of transformation products of prochloraz（BTS44596） after liver microsome incubation

2.5 方法的可靠性驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)室自2014 年以來，歷年參與EURL 舉辦的盲樣篩查考核（EUPT-FV-SM）。在無參考標(biāo)物的情況下，實(shí)驗(yàn)室在2019～2021 連續(xù)3 年的考核中，基于該方法體系，在72 h 內(nèi)，分別在卷心菜（EUPTFV-SM11，Lab002）、洋蔥（EUPT-FV-SM12，Lab023）、茄子（EUPT-FV-SM13，Lab021）3 類盲樣中實(shí)現(xiàn)10 多種不同類型農(nóng)藥100%的陽(yáng)性檢出，也在西紅柿（EUPT-FV-SM14，Lab010）中鑒定出多個(gè)農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物（如Propamocarb-N-oxide、Spirotetramat-enol、Bifenazate-diazene 等），證明了該方法對(duì)農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物篩查的廣譜、高效和高可信度等特征。

3 結(jié) 論

本研究基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物的篩查與鑒定體系，對(duì)各類食品基質(zhì)和不同農(nóng)藥進(jìn)行廣譜提取，低歧視儀器采集以及高通量和高置信度的數(shù)據(jù)挖掘與確證，特別是在缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，可通過生物轉(zhuǎn)化方法提升疑似農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物鑒定的置信度。研究通過來自歐盟參比實(shí)驗(yàn)室的真實(shí)樣本驗(yàn)證了該方法體系的可靠性，并在歷年全國(guó)代表性食品監(jiān)測(cè)中使用該方法體系發(fā)現(xiàn)并確證了不少農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物。通過組學(xué)、機(jī)器學(xué)習(xí)和生物轉(zhuǎn)化等多種技術(shù)的融合，該研究突破了目前食品安全領(lǐng)域農(nóng)藥轉(zhuǎn)化物篩查與鑒定的瓶頸。在未來研究中，期望通過不斷擴(kuò)充實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)并提高數(shù)據(jù)分析的智能化，實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥及其轉(zhuǎn)化物快速與廣譜的檢測(cè)。