肖琳婧 秦學(xué)玲 付興情 金 蒙 龍 琴 張赟華

云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650106

上清丸源自《丹溪心法》“朱丹溪方上清散加減”[1]，但與現(xiàn)行處方一致的上清丸最先記載于《北京市中藥成方選集》[2]?，F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為WS3-B-1878-95，標(biāo)準(zhǔn)收載大蜜丸和水丸兩種劑型，后根據(jù)藥典業(yè)發(fā)(1999)第175號(hào)文增加水蜜丸的規(guī)格。上清丸由菊花、薄荷、川芎、白芷、荊芥、防風(fēng)、桔梗、連翹、梔子、黃芩(酒炒)、黃柏(酒炒)及大黃(酒炒)十二味藥材組成。具有清熱散風(fēng)、解毒通便的功效。臨床上常用于頭暈耳鳴、目赤、鼻流黃涕、口舌生瘡、牙齦腫痛、大便秘結(jié)[3]。文獻(xiàn)[4-6]報(bào)道，可采用HPLC方法對(duì)上清丸中的歐前胡素、黃芩苷、綠原酸、蒽醌等成分進(jìn)行含量測(cè)定，但對(duì)上清丸中關(guān)黃柏?fù)絺渭包S柏中鹽主要活性成分鹽酸小檗堿含量測(cè)定未見(jiàn)報(bào)道。

長(zhǎng)期以來(lái)黃柏的價(jià)格高于關(guān)黃柏，因其化學(xué)成分相似，黃柏藥材在市場(chǎng)上常有用關(guān)黃柏冒充或摻入正品黃柏中使用的情況存在，與正品黃柏相比，關(guān)黃柏中鹽酸小檗堿與鹽酸巴馬汀含量相近，而正品黃柏二者含量差異較大，以關(guān)黃柏代替黃柏或兩者混合入藥勢(shì)必會(huì)影響藥效[7-11]。上清丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)黃柏行顯微鑒別，存在關(guān)黃柏?fù)絺位蛱娲读系娘L(fēng)險(xiǎn)，為打擊關(guān)黃柏替代或摻偽黃柏投料生產(chǎn)上清丸的違規(guī)行為，非常有必要建立HPLC法測(cè)定上清丸中鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿含量，并通過(guò)其峰面積的比值對(duì)關(guān)黃柏?fù)絺位蛱娲读线M(jìn)行檢查。

上清丸為2022年全國(guó)藥品抽檢中成藥重點(diǎn)監(jiān)管品種之一，本次專項(xiàng)抽驗(yàn)，共抽取上清丸樣品103批次。抽樣地域覆蓋了全國(guó)26個(gè)省、自治區(qū)、直轄市，涉及14家生產(chǎn)企業(yè)，包括大蜜丸、水丸、水蜜丸3種劑型。本實(shí)驗(yàn)采用了HPLC測(cè)定了103批樣品中黃柏2個(gè)生物堿的含量，并通過(guò)鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿峰面積的比值，對(duì)上清丸中對(duì)關(guān)黃柏?fù)絺位蛱娲读线M(jìn)行檢查。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀；賽多利斯BS224S電子天平；賽多利斯SECURA225D電子天平。

A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.缺黃柏陰性供試品溶液

1.2 試藥 鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-201814，含量以86.7%計(jì))、鹽酸巴馬汀對(duì)照品(批號(hào)：110732-201913，含量以85.7%計(jì))、黃柏對(duì)照藥材(批號(hào)：121510-201807)、關(guān)黃柏對(duì)照藥材(批號(hào)：120937-201408)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，另購(gòu)買5批黃柏藥材，均經(jīng)鑒定，甲醇為色譜純(默克公司)，水為純化水，甲醇、乙醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

1.3 樣品 方法學(xué)考察用的上清丸(水蜜丸，批號(hào)：A12003，廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn))，其余103批次上清丸樣品來(lái)源于14家生產(chǎn)企業(yè)，由于國(guó)家專項(xiàng)抽檢，涉及數(shù)據(jù)保密，生產(chǎn)企業(yè)由A～N代替。具體信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Waters xbridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(加入磷酸二氫鉀使其達(dá)到0.02 mol/L)(20∶80)等度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含取鹽酸小檗堿50 μg、鹽酸巴馬汀 5 μg 的混合溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取本品重量差異項(xiàng)下大蜜丸，剪碎，精密稱定，取約2 g；取水丸或水蜜丸適量，研細(xì)，取約1 g，置具塞三角錐形瓶中，精密加入鹽酸∶甲醇(1∶100)25 mL，稱定重量，超聲40 min，放冷，再稱定重量，用鹽酸∶甲醇(1∶100)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備 按處方比例，在實(shí)驗(yàn)室模擬工藝，配制缺黃柏細(xì)粉，取約1 g，同供試品溶液制備，即得陰性供試品溶液。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性試驗(yàn) 按“2.2、2.3、2.4”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品，在上述試驗(yàn)條件下，采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)定，記錄色譜圖，如圖1所示。結(jié)果表明上述液相色譜條件下，供試品溶液色譜中呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿峰計(jì)均不低于4000，陰性供試品在相應(yīng)位置處未見(jiàn)色譜峰，表明其他藥味不干擾兩種待測(cè)成分的測(cè)定，方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密稱定鹽酸小檗堿對(duì)照品10 mg置于20 mL量瓶中，鹽酸小檗堿母液(C=500 μg/mL)；精密稱定取鹽酸巴馬汀10 mg置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得鹽酸巴馬汀母液(C=100 μg/mL)；精密吸取鹽酸小檗堿母液5 mL、5 mL、1 mL、1 mL置于10 mL、25 mL、10 mL、100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，再精密吸取小檗堿稀釋液(C=100 μg/mL)1 mL置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻即得系列線性溶液；精密吸取鹽酸巴馬汀母液精密吸取5 mL、5 mL、1 mL、1 mL置于10 mL、25 mL、10 mL、100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，再精密吸取巴馬汀稀釋液(C=50 μg/mL)1 mL置于100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻即得系列線性溶液。

精密吸取上述線性對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以各成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，線性測(cè)定數(shù)據(jù)、計(jì)算得回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系考察表

2.7 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品適量，按上述方法制備，連續(xù)6次測(cè)定，測(cè)得鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的峰面積RSD (n=6)分別為1.54%、1.58%，儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h各進(jìn)樣1次，測(cè)定各組分的峰面積，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀峰面積RSD(n=6)分別為0.55%、1.06%，樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取上清丸(水蜜丸，批號(hào)：A12003，廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司)按“2.3.2”項(xiàng)下操作，平行提取6份，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表3，表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的上清丸樣品(鹽酸小檗堿1.42 mg/g、鹽酸巴馬汀0.02 mg/g、)上清丸(水蜜丸，批號(hào)：A12003，廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn))，稱定6份，每份取約0.5 g，精密稱定，采用加樣回收試驗(yàn)方法，分別按下表精密加入兩種對(duì)照品溶液，具體稱樣量、加入量。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，表明該方法可行。

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.11 限度設(shè)定和結(jié)果分析 為研究黃柏關(guān)黃柏?fù)絺位蛱娲读?，擬定其限度，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值，具體見(jiàn)表5。考慮不同產(chǎn)地黃柏和關(guān)黃柏藥材的區(qū)域性差異及樣品收集的局限性，以0.05為限度，即F值不得大于0.05[10]，可較好地區(qū)分上清丸中以關(guān)黃柏?fù)絺位蛱娲伏S柏投料。

表5 各樣品中A鹽酸巴馬汀/A鹽酸小檗堿比值的情況

取上清丸103樣品，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各精密吸取5 μL，注入HPLC中，計(jì)算鹽酸小檗堿的含量及鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值，結(jié)果見(jiàn)表6。各生產(chǎn)企業(yè)鹽酸小檗堿的含量統(tǒng)計(jì)圖如圖2所示，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值如圖3所示。

圖2 不同生產(chǎn)企業(yè)上清丸鹽酸小檗堿含量統(tǒng)計(jì)圖

圖3 不同生產(chǎn)企業(yè)上清丸鹽酸小檗堿含量統(tǒng)計(jì)圖

表6 103批次上清丸鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果及比值

結(jié)果表明上清丸(大蜜丸)中鹽酸小檗堿含量差異較小，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值均小于0.05，說(shuō)明不同生產(chǎn)企業(yè)黃柏質(zhì)量把關(guān)較嚴(yán)，均未出現(xiàn)關(guān)黃柏?fù)絺位蛱娲读系膯?wèn)題。上清丸(水丸)中鹽酸小檗堿與企業(yè)相關(guān)性較強(qiáng)，L企業(yè)鹽酸小檗堿含量較M和N企業(yè)低，但均未出現(xiàn)鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值均大于0.05的情況。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 研究比較不同提取溶劑(60%乙醇、甲醇、鹽酸∶甲醇=1∶100)，不同提取方式(超聲20 min、40 min、60 min)，最終確定最佳提取條件是鹽酸∶甲醇(1∶100)超聲提取40 min。此條件提取較完全，通過(guò)上述色譜條件，可以較好地測(cè)定上清丸中鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀含量。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 研究通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀在345 nm波長(zhǎng)附近均最大吸收并參照中國(guó)藥典2020年版一部關(guān)黃柏含量測(cè)定項(xiàng)下的規(guī)定[12]，選擇345 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)在篩選流動(dòng)相時(shí)，通過(guò)對(duì)乙腈-水、甲醇-水的運(yùn)行，篩選出乙腈-水系統(tǒng)優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)，但色譜峰出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，進(jìn)而以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，但拖尾情況未完全解決。最后以乙腈-0.1%磷酸(加入磷酸二氫鉀使其達(dá)到0.02 mol/L)水溶液為流動(dòng)相等度洗脫時(shí)，供試品中鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀達(dá)到基線分離，峰型較好，并且干擾較少，出峰時(shí)間適中，故選取此條件為流動(dòng)相。

3.4 結(jié)果分析 通過(guò)測(cè)定103批上清丸中鹽酸小檗堿含量，上清丸(大蜜丸)中各企業(yè)樣品含差異較小，但同一企業(yè)各批次間含量差異較大，說(shuō)明各批次間均一性較差。為了提高上清丸的一致性，相關(guān)企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)投料黃柏的質(zhì)量控制。上清丸(水丸)中L企業(yè)樣品較M、N企業(yè)低，說(shuō)明L企業(yè)黃柏的質(zhì)量較差，提示該企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)黃柏質(zhì)量的控制。在上清丸中關(guān)黃柏?fù)絺位蛱娲读蠙z查中，所有企業(yè)黃柏投料把關(guān)較嚴(yán)，鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積比值均小于0.05，未出現(xiàn)關(guān)黃柏?fù)絺位蛱娲读系那闆r。

實(shí)驗(yàn)建立HPLC的方法測(cè)定上清丸鹽酸小檗堿的含量，對(duì)市售上清丸中關(guān)黃柏?fù)絺位蛱娲S柏投料進(jìn)行檢查。所建立的方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，不同企業(yè)不同批次上清丸中鹽酸小檗堿含量存在一定差異，可能與制劑生產(chǎn)所用黃柏的產(chǎn)地、來(lái)源、采收季節(jié)以及原藥材批間質(zhì)量差異等因素有關(guān)，提示相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注黃柏原藥材質(zhì)量及酒炒黃柏的工藝，不斷提高和完善上清丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，確保上清丸質(zhì)量穩(wěn)定和臨床療效一致。