畢 武 孫 輝 任 強

1.湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南 長沙 410001；2.濟寧醫(yī)學(xué)院，山東 日照 276826

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，是我國常用大宗中藥材之一，為歷版《中國藥典》所收載[1]。主產(chǎn)甘肅東南部，以岷縣產(chǎn)量多，質(zhì)量好，其次為云南、四川、陜西、湖北等省。藥理研究表明，當(dāng)歸具有活血、補血、促進造血、抗腫瘤等功用[2-7]；化學(xué)成分研究表明，當(dāng)歸中主要含有有機酸類、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油等化學(xué)成分[8]，其中阿魏酸在2020年版《中國藥典》作為定量測定的指標(biāo)性成分。

中藥飲片是中藥臨床應(yīng)用的主要形式之一，多以湯劑在臨床使用，因此中藥飲片質(zhì)量均一性在臨床應(yīng)用中意義重大。中藥飲片由于其來源藥材質(zhì)量參差不齊，化學(xué)成分含量差異很大，從而影響臨床用藥的療效和穩(wěn)定性。為克服中藥飲片這種應(yīng)用形式的不足，近年來有專家提出“中藥精準(zhǔn)煮散飲片”的概念[9]。中藥煮散最早可追溯至先秦，在唐宋盛行，是將中藥粉碎成一定粒度與水共煎，去渣取汁制成的中藥液體制劑。中藥煮散注重“藥力盡出”，但由于煮散需將藥材粉碎，導(dǎo)致藥材鑒別困難，到明清時期逐步被便于鑒別和流通的飲片所取代。

隨著現(xiàn)代科技的進步，中藥飲片應(yīng)用形式的不足有望改進，中藥煮散被再度提出。中藥精準(zhǔn)煮散飲片是通過標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化工藝將中藥飲片的形狀規(guī)格微小化、均勻化處理，使飲片批量規(guī)模穩(wěn)定化，批內(nèi)質(zhì)量均一化，同時有利于有效成分的溶出和自動化調(diào)劑[10]。目前已有研究人員對制何首烏、雞血藤、三七、枳殼、肉桂等藥材進行了精準(zhǔn)煮散飲片的研究[10-14]，近期也有人對當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的指紋圖譜和含量測定進行了研究[15]，本研究重點對當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量均一性進行了研究，以期為當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的實際應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀LC-20AT(Shimadzu Corporation);Diamonsil(200 mm×4.6 mm, 5.0 μm)色譜柱；水浴鍋DZKW-D-2(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電子天平(準(zhǔn)確至千分之一，Shimadzu Corporation)；溶劑過濾器(天津津騰公司)；醫(yī)用離心機TGL-185(長沙平凡儀器儀表有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 材料 阿魏酸(純度98%，批號：20140928，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。乙腈、冰醋酸為色譜純(Fisher)，其它試劑為分析純。

研究樣品為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，具體編號、產(chǎn)地及規(guī)格詳見表1。當(dāng)歸原飲片形態(tài)如圖1所示，當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片如圖2所示。

A：DG-1；B：DG-2；C：DG-3

A：40目；B：24目；C：5目

表1 當(dāng)歸藥材的來源信息

2 方法

2.1 煮散飲片與原飲片出膏率比較 取同一批次當(dāng)歸原飲片(批號：180626016)，粉碎，過篩，得到5～10目(2～4 mm)，10～24目(0.8～2 mm)和24～65目(0.25～0.8 mm)等不同粒度的煮散飲片。稱取原飲片及不同粒度煮散飲片各100 g，加8倍量水浸泡30 min，煮沸30 min，濾得煎煮液，剩下的殘渣加6倍量水煎煮30 min。合并兩次煎煮液，濃縮成100 mL溶液，得到1.0 g/mL藥液。精密吸取各供試液2 mL于蒸發(fā)皿中，干燥至恒重，稱重，計算出膏率。

2.2 煮散飲片與原飲片指標(biāo)成分含量比較

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取適量阿魏酸對照品，加70%甲醇制成對照品儲備溶液，然后依次稀釋成每1 mL含5 μg、10 μg、50 μg、100 μg、250 μg、500 μg的系列對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別稱取不同批次的市售原飲片(S1～S3)各100 g，3批當(dāng)歸原飲片(S1～S3)等比例混合成400 g，粉碎過篩，取10～65目當(dāng)歸煮散飲片300 g，于紙上均勻攤平，平均分為9份，任意選取3份(S4～S6)，各稱量100 g，6份樣品按前述方法分別煎煮濃縮為1.0 g/mL藥液。精密量取，濃縮液2 mL置20 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，取適量試液離心，取上清液，即得供試液。

2.2.3 色譜條件 Diamonsil C18(2)(200 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱，以乙腈(B)-0.1%冰醋酸水(A)為流動相；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫0～18 min 19% B；18～30 min 19%～90% B；30～32 min 90%～19% B；32～40 min 19% B；檢測波長為316 nm，按阿魏酸峰計算理論板數(shù)應(yīng)不低于5000。

2.2.4 線性關(guān)系考察 將配制好的系列對照品溶液按照“2.2.3”項下色譜條件進樣分析。以對照品的峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，計算回歸方程，考察阿魏酸在上述色譜條件下的線性關(guān)系。

2.3 煮散飲片與原飲片指標(biāo)成分一致性比較 按 2.2 項下的方法制備供試液，準(zhǔn)確吸取各供試品溶液注入HPLC記錄色譜峰信息。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”(2004A版)對市售原飲片處理前后指紋圖譜相似度進行比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同粒度煮散飲片出膏率考察 出膏率考察結(jié)果如表2所示，從結(jié)果可以看出，與原飲片(出膏率5.27%)相比，不同粒徑的煮散飲片出膏率隨著粒徑的減小呈顯著增加的趨勢，出膏率分別為5.17%、5.69%、6.31%。由于煮散飲片粒徑不同出膏率不同，其中10～24目和24～65目出膏率相對較高，所以在后續(xù)實驗中采用10～65目的煮散飲片。此外，實驗顯示，煮散飲片粒度越大，飲片的澄清度越高，所有飲片都沒有出現(xiàn)糊化。

表2 當(dāng)歸原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片出膏率

3.2 色譜條件考察 將準(zhǔn)備好的對照品溶液和供試品溶液按“2.2.3”項下的色譜條件進樣分析，對照品及提取液色譜圖如圖3所示，發(fā)現(xiàn)該色譜條件下阿魏酸分離度良好。以對照品的峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸計算，回歸方程為：Y=13 176X-78 286(R2=0.9998)，表明阿魏酸在10～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 煮散飲片與原飲片指標(biāo)成分含量的均一性 采用高效液相色譜法測定了不同形式飲片中指標(biāo)性成分阿魏酸的含量，不同批次精準(zhǔn)煮散飲片提取液與當(dāng)歸原飲片中指標(biāo)成分的含量具體見表3和表4。結(jié)果表明，混合煮散前，各批次當(dāng)歸飲片藥材中指標(biāo)成分阿魏酸平均含量為0.32 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.82%，批間差異較大；但將其混合制成煮散飲片后，阿魏酸成分的含量明顯增加，平均值為0.38 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為下降為2.63%，說明煮散后質(zhì)量均一性有所改善。

表4 阿魏酸在當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片提取液中的含量測定

3.4 煮散飲片與原飲片的指紋圖譜均一性 由于飲片制成的湯劑成分較為復(fù)雜，因此采用了中藥整體質(zhì)量控制常用的指紋圖譜法對煮散飲片和原飲片進行比較，具體結(jié)果如圖4所示，見表5。結(jié)果顯示：應(yīng)用現(xiàn)有的檢測方法，當(dāng)歸煮散飲片和原飲片樣品的色譜峰可以很好地匹配，相似度結(jié)果顯示：煮散飲片(S4～S6)的相似度均>0.997，指紋圖譜匹配更好。說明了精準(zhǔn)煮散飲片與市售的原飲片在提取出的成分屬性上沒有顯著差異，采用指紋圖譜相似度分析法可用來鑒別當(dāng)歸煮散飲片的真?zhèn)吻闆r。以精準(zhǔn)煮散飲片水煎液中阿魏酸的平均峰面積為基準(zhǔn)，計算精準(zhǔn)煮散飲片和市售飲片水煎液主要共有峰的相對峰面積，結(jié)果見表6。精準(zhǔn)煮散飲片與市售飲片無顯著差異。

圖4 當(dāng)歸原飲片(S1-S3)及精準(zhǔn)煮散飲片(S4-S6)圖譜

表5 當(dāng)歸原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片水煎液指紋圖譜的相似度

表6 當(dāng)歸原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片水煎液中 共有峰的相對峰面積

4 討論

為實現(xiàn)飲片的標(biāo)準(zhǔn)化和均勻化，精準(zhǔn)煮散飲片首先需要將飲片粉碎混勻，飲片粉碎粒度與飲片的出膏率等指標(biāo)密切相關(guān)，因此粉碎粒度是一個關(guān)鍵指標(biāo)。為了考察當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散的效果，本實驗比較了不同粒度的當(dāng)歸煮散飲片與原飲片出膏率差異，當(dāng)歸煮散飲片的出膏率與藥材粉碎的粒徑密切相關(guān)，粒徑減小出膏率明顯增加，據(jù)此獲得了合適的粉碎粒度，為下一步實驗的進行奠定了基礎(chǔ)。

為了解當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片與原飲片質(zhì)量的一致性，進一步采用HPLC法對其指標(biāo)成分阿魏酸含量測定，指紋圖譜法對飲片水煎煮后的總體成分相似度及其共有峰面積進行了綜合比較。含量測定結(jié)果表明，煮散后指標(biāo)性成分阿魏酸雖有一定程度增加，但并不顯著，可能與藥材中阿魏酸含量情況有關(guān)，因此煮散飲片原藥材的質(zhì)量及其評價指標(biāo)也很重要；指紋圖譜評價結(jié)果顯示，當(dāng)歸煮散飲片與其原飲片色譜峰數(shù)量基本一致，說明其提取物在種類上無顯著變化，但煮散飲片主要共有峰的峰面積有不同程度的增加。總的來說，煮散飲片可以較好地保持原飲片的質(zhì)量。

值得注意的是，阿魏酸雖為《中國藥典》2020版當(dāng)歸含量測定的指標(biāo)成分，但專屬性不足，用于評價當(dāng)歸煮散飲片的質(zhì)量還有待商榷。此外，精準(zhǔn)煮散飲片適合于根和莖類藥材、纖維含量較高且市場上飲片規(guī)格較多的飲片。一般含有揮發(fā)性成分的飲片，因粉碎過程中會導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分損失，且藥材粉碎后表面積增大增加揮發(fā)性成分揮發(fā)的速度，制成精準(zhǔn)煮散飲片需要重點關(guān)注。當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，揮發(fā)油總量也是其重要的控制指標(biāo)，在考察當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片時需要考慮對該類成分的評價，本研究考慮到粉碎和煎煮過程損失較大會導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確，所以未考慮揮發(fā)性成分，這是本文的不足之處。由于煮散飲片經(jīng)過粉碎后會出現(xiàn)性狀鑒定困難等不足，在實際應(yīng)用過程中需借助指紋圖譜等現(xiàn)代技術(shù)展開深入的研究，探討在保證當(dāng)歸煮散飲片原料真實性的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)煮散飲片質(zhì)量的有效性和均一性。俱蓉等[15]雖然考察了當(dāng)歸主要揮發(fā)性成分藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯I，但未能考察揮發(fā)性成分的指紋圖譜以綜合評價揮發(fā)性成分的穩(wěn)定性和均一性。

研究結(jié)果表明，當(dāng)歸煮散飲片與原飲片質(zhì)量具有良好的一致性，當(dāng)歸煮散飲片具有臨床應(yīng)用的可行性。由于煮散飲片可實現(xiàn)不同批次原料的均一性，因此，當(dāng)歸煮散飲片具有良好的臨床應(yīng)用前景。此外，隨著DNA條形碼鑒別技術(shù)、代謝組學(xué)技術(shù)和指紋圖譜技術(shù)等可克服煮散形態(tài)鑒別困難的技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，煮散飲片應(yīng)用更加規(guī)范化、科學(xué)化和精準(zhǔn)化?，F(xiàn)階段，在眾多新型飲片中，精準(zhǔn)煮散飲片因其更高的質(zhì)量均一性將成為普通飲片向“精準(zhǔn)化”轉(zhuǎn)型和升級的重藥飲片形式之一，也是中藥傳承、創(chuàng)新和發(fā)展的重要表現(xiàn)形式。