程金鳳 孫大康 王倩倩 李洋 甄萌萌 程艷麗

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，濱州 256600；2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，濱州 256600；3臨邑縣人民醫(yī)院，德州 251500；4濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，濱州 256600

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥過程，脂質(zhì)沉積和炎性反應(yīng)是AS發(fā)病機(jī)制中重要的危險(xiǎn)因素［1］。高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）的血清含量降低，總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）含量升高是促進(jìn)AS發(fā)生的不利因素。在這些脂質(zhì)中，LDL發(fā)揮著關(guān)鍵作用［2-3］。AS病變的發(fā)展開始于LDL對(duì)血管內(nèi)膜滲透，積聚在內(nèi)膜下的LDL被氧化為氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，OxLDL），導(dǎo)致和加劇內(nèi)皮損傷；血液中的單核細(xì)胞遷移至損傷的動(dòng)脈血管壁并黏附在內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬OxLDL后形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而形成最早的粥樣硬化病變脂質(zhì)條紋［4-5］。AS斑塊中的局部炎癥主要由表達(dá)促炎介質(zhì)的活化巨噬細(xì)胞介導(dǎo)［6］，在AS病變中，活化的巨噬細(xì)胞吞噬OxLDL后，最終會(huì)分泌白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎細(xì)胞因子，后者促進(jìn)黏附分子的表達(dá)，刺激白細(xì)胞的募集，并破壞斑塊的穩(wěn)定性，加劇AS發(fā)展［7-10］。

運(yùn)動(dòng)對(duì)抑制動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的進(jìn)展有顯著效果［11-13］，可能與其改善糖尿病、高血壓和高脂血癥等AS相關(guān)危險(xiǎn)因素有關(guān)［14］，但是其確切的作用機(jī)制尚未完全闡明。生物鐘基因可參與調(diào)控AS的病理過程，其中，生物鐘基因Cry1（Cryptochrome 1）在AS過程中發(fā)揮保護(hù)作用，它可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥、血壓、糖脂代謝以及內(nèi)皮細(xì)胞功能來影響AS的進(jìn)展［15］。

我們課題組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果（尚未發(fā)表）發(fā)現(xiàn)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以提高小鼠主動(dòng)脈組織中Cry1基因的mRNA表達(dá)水平。據(jù)此我們提出假設(shè)，有氧運(yùn)動(dòng)可能通過誘導(dǎo)Cry1基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及炎性反應(yīng)，從而抑制AS的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)中，我們用ApoE-/-小鼠建立AS模型，探討運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的抗AS作用與Cry1基因表達(dá)之間的潛在聯(lián)系。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)雄性ApoE-/-小鼠22只購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為：SCXK（京）2021-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作過程已通過濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（20211101-95），采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，動(dòng)物飼養(yǎng)符合每籠3～5只。飼養(yǎng)條件：通風(fēng)條件良好，溫度：（25±1）℃，濕度：（55±5）%，每天12 h輪換照明。

2.實(shí)驗(yàn)方法

研究實(shí)施時(shí)間：2022年3月至2022年11月。ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組（11只）和運(yùn)動(dòng)組（11只）。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后換用高脂飼料（40%脂肪+1.25%膽固醇）。模型組小鼠不干預(yù)其活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組小鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)12周，5 d/周。運(yùn)動(dòng)方案如下：第1周適應(yīng)階段，由6 m/min、30 min逐漸增加至12 m/min、60 min，之后進(jìn)行穩(wěn)定的運(yùn)動(dòng)量（12 m/min、60 min）。所有小鼠給予自由飲水，每2周對(duì)小鼠進(jìn)行稱重并記錄其變化情況。

3.取材

運(yùn)動(dòng)結(jié)束并禁食12 h，用4%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉小鼠，血液樣本通過摘取眼球收集，離心后收集上清。經(jīng)PBS溶液灌流后，游離主動(dòng)脈弓至髂動(dòng)脈分叉處的整段主動(dòng)脈血管組織。將每組5只ApoE-/-小鼠的主動(dòng)脈血管組織置于4%多聚甲醛固定液（paraformaldehyde，PFA）中，用于后續(xù)蘇木精-伊紅（HE）染色、油紅O染色及免疫組織化學(xué)染色；每組6只ApoE-/-小鼠取整段血管組織存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)real-time PCR分析。

4.炎癥因子及血脂水平測(cè)定

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度，試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；比色法檢測(cè)小鼠血清中TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的濃度，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。測(cè)定嚴(yán)格按照說明書操作。

5.HE染色

組織經(jīng)固定、脫水透明、浸蠟包埋后進(jìn)行切片。厚度為4 μm，每隔10張取1張進(jìn)行HE染色。切片按順序放入二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min、無水乙醇Ⅰ 5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min，蘇木素浸泡2 min，分化液分化30 s，伊紅染色30 s，切片依次放入梯度酒精各3 s、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1 min進(jìn)行脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡圖像采集，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行斑塊面積定量分析。

6.油紅O染色

組織固定脫水后使用OCT包埋制備冰凍切片，切片厚度為10 μm，每隔10張取1張進(jìn)行油紅O染色。切片復(fù)溫干燥30 min，4% PFA固定10 min，蒸餾水洗，60%異丙醇浸潤5 min，油紅O染液浸潤10 min，蒸餾水洗，60%異丙醇溶液分化3 min，mayer蘇木素染液染色3 s，流水沖洗返藍(lán)，用甘油明膠進(jìn)行封片，顯微鏡鏡檢并進(jìn)行后續(xù)分析。

7.real-time PCR分析

用RNAiso Plus試劑從組織中提取總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒指示合成cDNA。按照CFX96 Real-Time PCR Detection system的操作方法，反應(yīng)體系20 μl，擴(kuò)增過程包括以下：95 ℃ 30 s，PCR反應(yīng)，40 cycles，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。采用2-△△CT方法計(jì)算GAPDH、Cry1的相對(duì)表達(dá)量，見表1。

表1 目的基因的引物序列

8.免疫組化

常規(guī)制備石蠟切片，切片放入60 ℃烤箱中60 min，經(jīng)二甲苯梯度脫蠟、各濃度乙醇溶液梯度脫水后，乙二胺四乙酸（EDTA）溶液高壓熱修復(fù)，滴加3%過氧化氫（H2O2）溶液孵育20 min，防止非特異性染色，山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min，一抗（Cry1 1∶100），4 ℃冰箱過夜。二抗37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，陽性區(qū)域呈棕黃色。蘇木素復(fù)染，酒精脫水，中性樹膠封片。顯微鏡圖像采集，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行平均光密度分析。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 25.0軟件操作，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈Cry1基因表達(dá)的影響

由圖1可知，運(yùn)動(dòng)組小鼠Cry1基因的mRNA表達(dá)水平明顯高于模型組（P＜0.01），表明有氧運(yùn)動(dòng)可以上調(diào)小鼠主動(dòng)脈組織中Cry1基因的表達(dá)水平。此外，我們通過免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的假設(shè)，運(yùn)動(dòng)組小鼠主動(dòng)脈組織中棕黃色顆粒較模型組表達(dá)增多（P＜0.01）。

圖1 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈Cry1基因表達(dá)的影響。A：小鼠主動(dòng)脈Cry1基因mRNA表達(dá)情況；B、C：小鼠主動(dòng)脈Cry1蛋白表達(dá)情況及其平均光密度分析（免疫組織化學(xué)染色×400）

2.有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠血脂及炎性細(xì)胞因子的影響

與模型組小鼠相比，運(yùn)動(dòng)組小鼠經(jīng)血清TC、TG、LDL-C水平降低（均P＜0.01），HDL-C水平顯著升高（P＜0.01），見表2；運(yùn)動(dòng)組小鼠炎性因子的水平較模型組顯著降低（均P＜0.01），見表3。

表2 兩組ApoE-/-小鼠血脂水平比較（mmol/L，）

表2 兩組ApoE-/-小鼠血脂水平比較（mmol/L，）

注：兩組小鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后換用高脂飼料（40%脂肪+1.25%膽固醇），模型組小鼠不干預(yù)其活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組小鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)12周，5 d/周；TC為總膽固醇，TG為三酰甘油，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇；與模型組比較，aP＜0.01

HDL-C 0.84±0.20 1.12±0.14a組別模型組運(yùn)動(dòng)組只數(shù)11 11 TC 14.23±1.91 11.76±1.61a TG 2.62±0.33 1.28±0.24a LDL-C 3.33±0.20 2.80±0.32a

表3 兩組ApoE-/-小鼠炎癥因子水平比較（ng/L，）

表3 兩組ApoE-/-小鼠炎癥因子水平比較（ng/L，）

注：兩組小鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后換用高脂飼料（40%脂肪+1.25%膽固醇），模型組小鼠不干預(yù)其活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)組小鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)12周，5 d/周；IL為白細(xì)胞介素，TNF為腫瘤壞死因子；與模型組比較，aP＜0.01

TNF-α 484.47±41.75 441.89±22.53a組別模型組運(yùn)動(dòng)組只數(shù)11 11 IL-1β 95.67±7.51 86.56±6.78a IL-6 109.62±7.01 68.44±8.40a

3.有氧運(yùn)抑制ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成

通過HE染色（圖2）可知，模型組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜下有泡沫細(xì)胞形成，并且伴隨有脂質(zhì)及膽固醇結(jié)晶的大量沉積，脂質(zhì)斑塊明顯。而運(yùn)動(dòng)組斑塊面積明顯減少，斑塊內(nèi)膽固醇結(jié)晶、泡沫細(xì)胞聚集情況有所減輕，AS斑塊占主動(dòng)脈管腔橫截面的面積百分比也明顯降低（P＜0.01），見圖3。由油紅O染色可知，模型組AS斑塊形成明顯，脂質(zhì)沉積情況顯著，12周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)組主動(dòng)脈斑塊內(nèi)的脂質(zhì)含量明顯降低（P＜0.01），見圖4。

圖2 兩組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部橫斷面HE染色（×200）

圖3 兩組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈橫斷面斑塊面積定量分析

圖4 兩組ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈橫斷面油紅O染色（×100）（A）及斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量定量分析（B）

4.有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，模型組和運(yùn)動(dòng)組ApoE-/-小鼠的體質(zhì)量大致相同，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。隨著運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，兩組喂養(yǎng)高脂飲食的ApoE-/-小鼠體質(zhì)量逐漸增加，并且在第8周開始出現(xiàn)顯著差異（P＜0.01），如圖5所示。

圖5 有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠體質(zhì)量的影響

討論

運(yùn)動(dòng)可以抑制AS的進(jìn)展［16-17］，但其確切機(jī)制尚未完全闡明。隨著研究的進(jìn)一步深入，生物鐘基因Cry1成為抑制AS形成的重要因素［15，18］。但有氧運(yùn)動(dòng)與Cry1基因之間的聯(lián)系尚無相關(guān)研究。

1.有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈生物鐘基因Cry1表達(dá)的影響

我們對(duì)被廣泛應(yīng)用于AS模型的ApoE-/-小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)。參考運(yùn)動(dòng)干預(yù)影響ApoE-/-小鼠AS的相關(guān)研究資料，大多數(shù)研究者采用12～15 m/min、30～60 min/次的方案，本試驗(yàn)確定了12 m/min、60 min/次的運(yùn)動(dòng)方案。在本研究中，有氧運(yùn)動(dòng)顯著提高了小鼠主動(dòng)脈組織中Cry1基因的表達(dá)。由于Cry1基因在AS的發(fā)展中具有抑制作用，因此，我們推測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的抗AS作用可能與Cry1基因表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。

2.有氧運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的Cry1基因表達(dá)升高通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及脂質(zhì)代謝抑制AS的形成

炎性反應(yīng)會(huì)損傷血管組織，引起AS斑塊破裂和血栓形成［19-20］，是AS發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子在AS相關(guān)炎癥中發(fā)揮著重要作用。IL-1β被視為臨床治療AS中抗炎治療的潛在靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組小鼠相比，給予IL-1β拮抗劑干預(yù)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈血管斑塊面積減小，抑制了AS的進(jìn)展［21］。IL-6參與調(diào)節(jié)急性期炎性反應(yīng)和慢性炎癥［22］，在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，冠心病患者血液樣本中IL-6的水平高于健康對(duì)照組［23］，并且冠心病患者病情的嚴(yán)重程度與IL-6水平呈正相關(guān)［24］。TNF-α也參與AS的發(fā)展，與ApoE-/-小鼠相比，TNF-α、ApoE雙敲除基因小鼠（TNF-α-/-，ApoE-/-）的AS斑塊面積更小，表明抑制TNF-α具有AS保護(hù)作用［25］。因此，降低這些炎性細(xì)胞因子的水平是AS抗炎治療的一個(gè)重要部分。在本研究中，運(yùn)動(dòng)組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著低于模型組，與Sun等［17］的研究結(jié)果一致。

在本研究中，我們?cè)u(píng)估了跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)AS斑塊形成的影響。模型組小鼠主動(dòng)脈病理切片出現(xiàn)典型的AS表現(xiàn)。模型組主動(dòng)脈切片顯示血管壁厚薄不均勻，存在大量泡沫細(xì)胞和AS斑塊，這一現(xiàn)象與Wu等［26］的研究相一致。與模型組小鼠相比，相同高脂飲食條件下的運(yùn)動(dòng)組小鼠經(jīng)12周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，其體質(zhì)量和主動(dòng)脈斑塊面積都有所下降。運(yùn)動(dòng)組小鼠主動(dòng)脈管壁上仍有斑塊形成，但其脂質(zhì)核心較小。并且，油紅O染色結(jié)果也顯示，運(yùn)動(dòng)組AS斑塊內(nèi)的脂質(zhì)沉積量小于模型組。我們還測(cè)量了小鼠血清中的血脂水平，運(yùn)動(dòng)組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平下降，血清HDL-C水平升高。但是在Wu等［26］的研究中，運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)小鼠血清TC、TG濃度的影響程度小，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相矛盾。我們分析造成這種結(jié)果主要是由于兩個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的運(yùn)動(dòng)模式、喂養(yǎng)時(shí)間和飲食配方不同。

本研究證明了跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的抗AS和抗炎作用，并且運(yùn)動(dòng)可以上調(diào)Cry1基因在動(dòng)脈壁中的表達(dá)，阻礙ApoE-/-小鼠AS的進(jìn)展。Narasimamurthy等［27］發(fā)現(xiàn)，在Cry-/-小鼠中，炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著增加，這是因?yàn)樯镧娀駽ry1可以直接與腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合抑制環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphatec，cAMP）的產(chǎn)生，從而抑制蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）誘導(dǎo)的p65磷酸化，進(jìn)而抑制核因子（NF）-κB的激活降低炎性反應(yīng)。當(dāng)生物鐘基因Cry1缺失時(shí)可能會(huì)釋放其對(duì)cAMP產(chǎn)生的抑制作用，最終導(dǎo)致炎性反應(yīng)的增加。然而，通過尾靜脈注射Cry1基因重組腺病毒載體使Cry1基因在ApoE-/-小鼠中高表達(dá)時(shí)，通過調(diào)節(jié)TLR/NF-κB通路，顯著降低了TNF-α、IL-1β和IL-6促炎因子的表達(dá)，緩解了AS的發(fā)生。此外，生物鐘基因Cry1過表達(dá)也減小了ApoE-/-小鼠的AS斑塊面積和TC、TG和LDL-C的濃度［18］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)上調(diào)Cry1基因表達(dá)的結(jié)果，我們認(rèn)為有氧運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的Cry1基因表達(dá)升高是運(yùn)動(dòng)抑制AS形成的可能調(diào)控機(jī)制之一。有氧運(yùn)動(dòng)通過提高主動(dòng)脈血管壁中生物鐘基因Cry1的表達(dá)，來發(fā)揮其抗炎及脂質(zhì)調(diào)節(jié)的作用，進(jìn)而抑制AS的進(jìn)展。

有氧運(yùn)動(dòng)可以提高小鼠主動(dòng)脈管壁生物鐘基因Cry1的表達(dá)水平，降低血脂及相關(guān)炎性因子的濃度，并抑制AS斑塊的形成，提示有氧運(yùn)動(dòng)的抗AS作用可能與其上調(diào)小鼠主動(dòng)脈血管壁生物鐘基因Cry1的表達(dá)有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明程金鳳：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析；孫大康：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)；王倩倩、李洋、甄萌萌：行政、技術(shù)或材料支持；程艷麗：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)