馬琨 張川

1河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）病理科，鄭州 450002；2河南省洛陽正骨醫(yī)院（河南省骨科醫(yī)院）肩肘二科，鄭州 450002

骨肉瘤是最常見的骨原發(fā)惡性腫瘤，好發(fā)于青少年的股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和肱骨近端等長骨干骺端［1］。雖然“術(shù)前新輔助化療”治療模式已經(jīng)把骨肉瘤患者的5年生存率提高到了60%～70%，但近數(shù)十年來，骨肉瘤治療效果停滯不前［2-3］。近年來研究證實(shí)腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）在腫瘤復(fù)發(fā)和化療耐藥中發(fā)揮重要作用［4-5］。既往研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）可參與調(diào)控成骨細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)干細(xì)胞、心肌細(xì)胞纖維化，且異常增高的TGF-β1水平與多種腫瘤的臨床分期和不良預(yù)后呈正相關(guān)［6-10］。雖目前已有報(bào)道認(rèn)為TGF-β1參與抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲［11］。然而，關(guān)于TGF-β1與骨肉瘤惡性增殖和腫瘤干細(xì)胞特征之間的關(guān)系尚無人探討。本研究旨在了解TGF-β1與骨肉瘤細(xì)胞惡性增殖和腫瘤干細(xì)胞特征的關(guān)系，為骨肉瘤治療靶點(diǎn)提供新選擇。

材料與方法

1.細(xì)胞與試劑

人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、MG-63、SaoS2、HOS和人正常成骨細(xì)胞hFOB1.19均購自美國ATCC細(xì)胞庫，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。TGF-β1抗體購自英國Biorbyt公司；基因敲減和過表達(dá)TGF-β1的重組慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒均購自上海吉瑪生物科技有限責(zé)任公司；一抗［抗TGF-β1、抗E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、抗波形蛋白（vimentin）、抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、抗細(xì)胞表面粘附分子 （CD133）、抗八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（OCT）4、抗Nanog、抗p-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、抗p-蛋白激酶B（AKT）、抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）、抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體（α-SMA）、抗性別決定相關(guān)基因簇-2抗體（Sox-2）］、二抗均購自美國Santa Cruz公司。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞放置在含有10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM/F12，在37 ℃、5% CO2飽和度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至70%左右時(shí)，采用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

3.細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

用四甲基偶氮唑鹽（MTT）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力，將經(jīng)過不同因素處理后的MG-63細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，以密度為1×104ml-1接種于96孔板，然后在37 ℃、5% CO2濃度培養(yǎng)箱孵育，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)量。

4.腺病毒與小干擾RNA轉(zhuǎn)染設(shè)計(jì)

常規(guī)種植MG-63細(xì)胞到6孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書，將相應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后更換新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，嘌呤霉素篩選。以穩(wěn)定感染過表達(dá)TGF-β1重組慢病毒的MG-63細(xì)胞為Lv-TGF-β1組，以穩(wěn)定感染陰性對(duì)照慢病毒的MG-63細(xì)胞為Lv-con組。TGF-β1 siRNA序列：#1正向引物5'-CCCACAACGAAAUCUAUGATT-3'，反向引物5'-UCAUAGAUUUCGUUGUGGGTT-3'；#2正向引物5'-GACACCAACUAUUGCUUCATT-3'，反向引物5'-UGAAGCAAUAGUUGGUGUCTT-3'；#3正向引物5'-GUCAACUGUGGAGCAACACDT-3'，反向引物5'-GUGUUGCUCCACAGUUGACDTDT-3'。干擾陰性對(duì)照組：正向引物5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反向引物5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用Trizol試劑提取細(xì)胞RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR反應(yīng)體系及條件參照試劑盒說明書進(jìn)行操作，2-△△CT法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。TGF-β1正向引物：5'-TCTCCAGGCATTTCCACTATTC-3'，反向引物：5'-CTCAGGCATTCGTCA ACATCTA-3'；GAPDH正向引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反向引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。

6.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡

采用FITC-annexinⅤ/PI雙染法，分別收集各處理組細(xì)胞到離心管中，1 000 r/min離心5 min（離心半徑8 cm）。室溫下避光孵育15 min，沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入FITC-annexinⅤ/PI溶液5 μl 4 ℃下孵育20 min，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

7.懸浮成球?qū)嶒?yàn)

將細(xì)胞分散接種于超低吸附六孔板中，使用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，其中添加20 μg/L人表皮生長因子（EGF）、20 μg/L人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、5 μg/L胰島素、2% B-27。培養(yǎng)1～2周后，顯微鏡下觀察并計(jì)算腫瘤球數(shù)目。

8.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物

待各處理組細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整為1×104ml-1的單細(xì)胞懸液。按照說明書每組分別加入1∶1 500的CD133抗體1 ml，充分混勻后常溫孵育，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

9.蛋白免疫印跡（Western blotting）

收集各組細(xì)胞，添加RIPA細(xì)胞裂解液，4 ℃，3000 r/min（離心半徑15 cm）離心30 min；經(jīng)BCA法定量以后，取適量的總蛋白煮沸變性。以100 g/L的分離膠和50 g/L的濃縮膠進(jìn)行電泳，每孔上樣30 μg蛋白樣品。把凝膠放在緩沖液中室溫檢測(cè)顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。浸泡25 min，以100 V的電壓轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放在脫脂奶粉中室溫封閉，加入特異性一抗TGF-β、E-cadherin、Vimentin、GAPDH、CD133、OCT-4、Nanog、p-PI3K、p-AKT、caspase-3、α-SMA、Sox-2室溫反應(yīng)1.5 h，4 ℃孵育過夜；加二抗（1∶3 000稀釋）室溫孵育1 h，用ECL發(fā)光檢測(cè)顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

10.移植瘤實(shí)驗(yàn)（體內(nèi)研究）：動(dòng)物模型建立、分組和給藥

BALB/c裸鼠20只，日齡28～35 d，體質(zhì)量18～22 g，常規(guī)裸鼠飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為4組：Lv-con、Lv-TGF-β1、si-con、si-TGF-β1組；調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105ml-1。每組取0.1 ml分別接種于裸鼠左或右側(cè)腋窩皮下，每天觀察小鼠一般情況，隔日測(cè)量1次移植瘤體積。在骨肉瘤細(xì)胞種植后5 d，將動(dòng)物隨機(jī)分4組，每組5只，對(duì)照組只給予生理鹽水；實(shí)驗(yàn)組采用預(yù)先實(shí)驗(yàn)方案給予處理，隔天腹腔內(nèi)注射。飼養(yǎng)至27 d，處死動(dòng)物，完整取出移植瘤稱重，立即行超低溫儲(chǔ)藏。

11.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（）表示，各組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.TGF-β1在骨肉瘤細(xì)胞系中高表達(dá)（圖1）

圖1 TGF-β1在骨肉瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。A：qRT-PCR檢測(cè)骨肉瘤各細(xì)胞系的TGF-β1 mRNA水平；B、C：Western blotting檢測(cè)骨肉瘤各細(xì)胞系的TGF-β1蛋白水平

與正常人成骨hFOB1.19細(xì)胞比較，骨肉瘤U2OS、MG-63、HOS及SaoS2細(xì)胞系中的TGF-β1 mRNA和蛋白印跡水平表達(dá)均有不同程度的上調(diào)；在U2OS細(xì)胞系中上調(diào)最顯著（t=8.76，P＜0.05），在MG-63細(xì)胞系中增長程度最低（t=4.33，P＜0.05）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中U2OS細(xì)胞用于TGF-β1沉默和MG-63細(xì)胞用于TGF-β1過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

2.TGF-β1 siRNA轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞的效率（圖2）

圖2 qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)si-TGF-β1沉默效率。A：qRT-PCR檢測(cè)各組mRNA水平；B、C：Western blotting檢測(cè)TGF-β1沉默后各組蛋白水平

本研究中，3組siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染U2OS細(xì)胞后，qRT-PCR和Western blotting用于檢測(cè)TGF-β1基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，3組si-TGF-β1均不同程度降低了TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，其中siRNA#1干擾效果最明顯（t=10.88，P＜0.05）。因此，選用siRNA#1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.調(diào)控TGF-β1影響骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡（圖3）

圖3 調(diào)控TGF-β1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖和凋亡情況的影響。A：克隆平板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)si-TGF-β1轉(zhuǎn)染后U2OS/MG-63細(xì)胞的增殖能力；B、C：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)si-TGF-β1轉(zhuǎn)染后U2OS/MG-63細(xì)胞的凋亡率；D、E：Western blotting檢測(cè)cleaved PARP、caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白水平

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示，si-TGF-β1能抑制MG-63細(xì)胞的平板克隆數(shù)；過表達(dá)TGF-β1能上調(diào)MG-63細(xì)胞的增殖能力（t=3.28，P＜0.05）。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)被用于檢測(cè)U2OS/MG-63細(xì)胞凋亡情況。數(shù)據(jù)表明，si-con組與Lv-con組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；相對(duì)于si-con組，si-TGF-β1的細(xì)胞凋亡率顯著升高，而與Lv-con相比，Lv-TGF-β1的細(xì)胞凋亡率有所下降（t=5.11，P＜0.05）。并且我們從Western blotting實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，與si-con比較，si-TGF-β1組的cleaved PARP、caspase-3、Bax表達(dá)明顯上調(diào)，而Bcl-2水平下降；反之與Lv-con相比，Lv-TGF-β1組的cleaved PARP、caspase-3以及Bax水平有所下降，而Bcl-2表達(dá)上調(diào)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，si-TGF-β1可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。

4.TGF-β1調(diào)控骨肉瘤干細(xì)胞樣特性表達(dá)（圖4）

圖4 TGF-β1調(diào)控骨肉瘤干細(xì)胞表型特征變化。A、B：調(diào)控TGF-β1對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞球形成的影響；C、D：調(diào)控TGF-β1對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞球CD133陽性細(xì)胞比例的影響；E、F：調(diào)控TGF-β1對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞球表面標(biāo)志物表達(dá)水平的影響

腫瘤成球?qū)嶒?yàn)顯示，相較于對(duì)照組，si-TGF-β1組腫瘤球的長徑明顯縮小（t=6.88，P＜0.05）；且si-TGF-β1組腫瘤球克隆數(shù)量明顯減少（t=3.07，P＜0.05）。CD133陽性細(xì)胞比例是腫瘤干細(xì)胞的特征；圖中顯示，與干細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果趨勢(shì)相同，基因沉默TGF-β1使CD133陽性細(xì)胞比例下降，即為降低骨肉瘤干細(xì)胞的干性特征表達(dá)；過表達(dá)TGF-β1使CD133陽性細(xì)胞比例上升，即為增高骨肉瘤干細(xì)胞的干性特征表達(dá)。Westen blotting檢測(cè)結(jié)果表明，與si-con組比較，si-TGF-β1組的干細(xì)胞表面特征標(biāo)志物Sox-2、Oct3/4、Nanog的蛋白表達(dá)顯著降低；與Lv-con組比較，TGF-β1過表達(dá)上調(diào)Sox-2、Oct3/4、Nanog的蛋白水平。進(jìn)而證實(shí)了影響TGF-β1水平可調(diào)控骨肉瘤的干細(xì)胞樣特性。

5.TGF-β1通過PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的惡性增殖和干性表達(dá)（圖5）

圖5 Western blotting檢測(cè)調(diào)控TGF-β1后p-P13K和p-AKT蛋白表達(dá)的變化

Western blotting結(jié)果顯示，si-con組與Lv-con之間無明顯差異；與si-con組相比，抑制TGF-β1的表達(dá)可抑制p-PI3K、p-AKT表達(dá)；而與Lv-con組相比，過表達(dá)TGF-β1的骨肉瘤細(xì)胞中p-PI3K、p-AKT表達(dá)水平升高（t=4.12，P＜0.05）。

6.TGF-β1對(duì)裸鼠皮下移植瘤增殖能力的影響（圖6）

圖6 裸鼠體內(nèi)成瘤試驗(yàn)。A：TGF-β1調(diào)控形成的異種移植瘤圖像；B、C：異種移植瘤的體積和質(zhì)量

構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤，在體內(nèi)水平檢測(cè)TGF-β1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果表明，si-con組與Lv-con組的腫瘤相比，體積和質(zhì)量的差別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。si-TGF-β1組的腫瘤體積和質(zhì)量明顯低于si-con組（t=3.79，P＜0.05）；同理，Lv-TGF-β1的腫瘤體積和質(zhì)量顯著高于Lv-con組（t=5.01，P＜0.05）。提示TGF-β1可促進(jìn)裸鼠體內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

討論

骨肉瘤是青少年高發(fā)的骨原發(fā)性惡性腫瘤之一。雖然骨肉瘤手術(shù)、放療、生物治療等方式日趨完善，但部分患者由于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，預(yù)后較差。因此，探討復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制、探尋相應(yīng)干預(yù)措施對(duì)于改善骨肉瘤預(yù)后具有重要意義。

在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)TGF-β1在骨肉瘤細(xì)胞系中均有不同程度的高表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β1相關(guān)通路參與結(jié)腸癌/肝癌細(xì)胞凋亡［12-13］。Fig2A顯示與si-con組相比，si-TGF-β1組平板克隆數(shù)明顯減少，U2OS細(xì)胞凋亡百分比增加到9.91%。反之，Lv-TGF-β1組明顯增加克隆平板數(shù)，MG-63細(xì)胞的凋亡數(shù)減少到0.85%（P＜0.05）。這提示我們過表達(dá)TGF-β1水平有助于骨肉瘤增殖，抑制其凋亡。

TGF-β1是超家族多肽類細(xì)胞因子成員［14］。Hariyanto等［15］發(fā)現(xiàn)，外源性TGF-β1可增強(qiáng)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的OCT4和ALDH1A1 mRNA的表達(dá)。Leng等［16］也發(fā)現(xiàn)TGF-β1相關(guān)通路參與KLF4增強(qiáng)結(jié)腸癌Lgr5 CD44 EpCAM陽性細(xì)胞比例。與既往研究結(jié)果類似，我們亦證實(shí)TGF-β1有助于增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的干性表達(dá)：與si-con組相比，si-TGF-β1可縮小MG-63細(xì)胞球的直徑和數(shù)量（P＜0.05），下調(diào)CD133陽性細(xì)胞百分比，Oct-4、Sox-2、Nanog、CD133的蛋白表達(dá)水平。經(jīng)腺病毒TGF-β1過表達(dá)后，MG-63球囊的直徑和細(xì)胞個(gè)數(shù)增加（P＜0.05），上調(diào)CD133陽性細(xì)胞百分比，上調(diào)干性標(biāo)志物的表達(dá)水平。

PI3K/AKT通路是介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的“明星通路”之一［17-18］。有報(bào)道研究證實(shí)，TGF-β1通過調(diào)控PI3K/AKT通路參與乳腺癌、肝癌、胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［19-20］。但至今未有文獻(xiàn)報(bào)道TGF-β1可通過PI3K/AKT通路調(diào)控腫瘤干細(xì)胞的干性特征。在本實(shí)驗(yàn)中，與si-con相比，下調(diào)TGF-β1水平的p-AKT和p-PI3K蛋白表達(dá)水平隨之下調(diào)；反之，過表達(dá)TGF-β1組的p-AKT和p-PI3K表達(dá)量上調(diào)；與申力和趙立志［21］報(bào)道TGF-β1組的PI3K/p-AKT/mTOR蛋白表達(dá)量高于NC組一致。因此，本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路可能參與TGF-β1介導(dǎo)的骨肉瘤惡性生物學(xué)行為。且我們從裸鼠移植瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，與體外試驗(yàn)結(jié)論相同，下調(diào)TGF-β1的表達(dá)可減少腫瘤的體積和質(zhì)量（P＜0.05）；相反過表達(dá)TGF-β1的表達(dá)可增高腫瘤的體積和質(zhì)量。

綜上所述，調(diào)控TGF-β1的表達(dá)可影響骨肉瘤細(xì)胞的惡性增殖和干性特征；這一切是通過激活PI3K/AKT通路進(jìn)而實(shí)現(xiàn)的。本研究發(fā)現(xiàn)了TGF-β1具有作為骨肉瘤治療潛在靶點(diǎn)的價(jià)值，但需要進(jìn)一步的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證其作用及促癌機(jī)制，為骨肉瘤的復(fù)發(fā)、耐藥及靶向治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明馬琨：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，實(shí)施研究，采集、分析/解釋數(shù)據(jù)，文章撰寫，統(tǒng)計(jì)分析，獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持；張川：指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)