吳 蕭,李 娜,趙 亮,張興桃,董 增,王維維

宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽宿州,234000

根癌農(nóng)桿菌是一種棲生于土壤中的革蘭氏陰性植物病原菌[1],在自然條件下,它具有趨化性,能感受創(chuàng)傷植物產(chǎn)生的酚類物質(zhì),使植物受傷部位產(chǎn)生冠癭瘤疾病[2]。其Ti(Tumor inducing)質(zhì)粒上的一段DNA序列(T-DNA)以單鏈DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物(簡稱T-復(fù)合物)的形式轉(zhuǎn)移并整合在宿主植物細(xì)胞的染色體中[3],隨著宿主的基因組進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[4]。因此,農(nóng)桿菌通常作為許多生物學(xué)過程的模式菌[5],該模式菌轉(zhuǎn)化過程穩(wěn)定,轉(zhuǎn)化周期短[6]。另外,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有廣泛的現(xiàn)實(shí)意義,具體體現(xiàn)在下列幾方面:

第一,在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中,農(nóng)桿菌的T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)技術(shù)占有重要的比例,而且也是分子生物學(xué)過程中的模式菌,該模式菌可以推動(dòng)很多重要的生物學(xué)過程的實(shí)現(xiàn),比如,農(nóng)桿菌作為生物學(xué)過程的模式菌可以為致病菌與感受態(tài)宿主細(xì)胞之間的自我識(shí)別機(jī)制研究、生物化學(xué)與分子生物學(xué)中大分子物質(zhì)之間轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究和根癌農(nóng)桿菌T4SS分泌系統(tǒng)機(jī)制的研究等奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)[7]。農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制中,VBP蛋白可以將植物轉(zhuǎn)基因過程中將要轉(zhuǎn)運(yùn)的目標(biāo)分子連接到其四型分泌系統(tǒng)上,所以,農(nóng)桿菌VBP蛋白介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究會(huì)引起各個(gè)領(lǐng)域研究學(xué)者(例如遺傳學(xué)、植物生理學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等)高度重視[8]。雖然農(nóng)桿菌是重要的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的模式菌之一,而且其DNA序列早已被檢測出,但是,與生物學(xué)過程中的蠟樣芽胞桿菌、大腸桿菌等其他模式菌比較,對農(nóng)桿菌在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的研究比較緩慢[9]。目前,根據(jù)生物信息學(xué)分析,農(nóng)桿菌啟動(dòng)子及其相關(guān)調(diào)控序列的操縱子檢測出三個(gè),可以看出農(nóng)桿菌在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究處于初級(jí)起步階段[10],所以我們致力于研究農(nóng)桿菌Atu5117基因相關(guān)的分子表達(dá)調(diào)控機(jī)理在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中有重要意義,也可以使我們在植物轉(zhuǎn)基因方面的研究走向國際科研領(lǐng)域的前沿[11]。

第二,農(nóng)桿菌招募蛋白在許多微生物中都含有高度保守的vbp同源基因序列,其編碼的VBP蛋白也是高度保守蛋白[12]。該保守蛋白在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中還參與接合質(zhì)粒,在許多微生物獲得耐受氨芐青霉素等抗性基因和微生物橫向交換遺傳信息等方面都是靠質(zhì)粒接合途徑實(shí)現(xiàn)的。因此,對農(nóng)桿菌Atu5117基因相關(guān)分子表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究不僅對農(nóng)桿菌本身介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)有參考價(jià)值,而且對其他眾多微生物的質(zhì)粒接合和同源基因的表達(dá)調(diào)控研究都具有重要的指導(dǎo)意義[13]。

第三,有三個(gè)親源基因同時(shí)編碼農(nóng)桿菌招募蛋白(VBP蛋白),而且這三個(gè)同源基因在將生物大分子招募到四型分泌系統(tǒng)方面是可以相互替代的,當(dāng)這三個(gè)同源基因被同時(shí)刪除時(shí),農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因效率非常低,甚至喪失了植物轉(zhuǎn)基因能力[14]。所以,農(nóng)桿菌平行同源基因介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究,不是某一個(gè)基因的調(diào)控機(jī)制研究,而是三個(gè)平行同源基因彼此之間相互作用的分子調(diào)控的研究[15]。這種研究方法是功能基因在后基因組時(shí)代的一個(gè)研究趨勢,在國際上,該研究相關(guān)研究數(shù)據(jù)比較少,但是生物信息學(xué)和生物遺傳學(xué)對于同源基因的數(shù)據(jù)分析和預(yù)測數(shù)據(jù)論文比較多。在微生物介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中,同源基因之間的相互調(diào)控機(jī)理的研究在分子生物學(xué)中普遍存在,通過生物信息學(xué)分析VBP蛋白平行同源基因分子表達(dá)調(diào)控機(jī)理,為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究提供了理論數(shù)據(jù)指導(dǎo)[16]。因此,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),為比較基因組學(xué)和其他微生物平行同源基因的研究提供重要的實(shí)驗(yàn)證據(jù),而這些植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)研究都必須先構(gòu)建原核表達(dá)載體,它可以將我們需要的優(yōu)良外源基因通過宿主菌感受態(tài)細(xì)胞傳遞下去,因此,構(gòu)建原核表達(dá)載體是農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最關(guān)鍵的技術(shù)之一。

為提高植物轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)需求,還需要進(jìn)一步提高這種模式菌的轉(zhuǎn)化效率。構(gòu)建一個(gè)原核基因表達(dá)載體,為農(nóng)桿菌T-復(fù)合物招募蛋白VBP1的編碼基因Atu5117的表達(dá)調(diào)控機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 所用菌株、質(zhì)粒

野生型農(nóng)桿菌C58、大腸桿菌DH5α、PRSET-A質(zhì)粒(具有T7啟動(dòng)子)和PGFP-N1(含有熒光基因(gfp)的質(zhì)粒)均來自宿州學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 所用引物

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增帶有熒光標(biāo)記基因的Atu5117啟動(dòng)子

step(1)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得Atu5117啟動(dòng)子基因。選取表1中相對應(yīng)引物,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),按照表1中所列出各組分的比例,在PCR管中分別加入各組分,混勻,將PCR管按要求放置在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀器上,并進(jìn)行變性(95 ℃;5 min)、退火(55 ℃;30 s)、延伸(73 ℃;2 min)的順序32個(gè)循環(huán),最后73 ℃維持10 min,將產(chǎn)物擴(kuò)增完全。再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,在95 V電壓條件下電泳40 min,核酸染料(溴化乙錠)染色并在紫外光下觀察,用切膠刀取下目的基因凝膠條帶,用DNA試劑盒回收產(chǎn)物并保存,該基因啟動(dòng)子序列大小約493 bp。

step(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得標(biāo)記基因。選取表1中對應(yīng)引物,依據(jù)表2中的反應(yīng)體系將各組分按要求加入PCR管中,渦旋振蕩器振蕩將反應(yīng)組分混合均勻,在PCR儀上設(shè)置參數(shù):變性(95 ℃;5 min)、退火(55 ℃;30 s)、延伸(73 ℃;2 min)的順序30個(gè)循環(huán)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),并將反應(yīng)產(chǎn)物在90 V電壓下進(jìn)行核酸瓊脂糖凝膠電泳40 min,用核酸染料(溴化乙錠)進(jìn)行凝膠染色并在紫外光下觀察,用切膠刀取下目的基因凝膠條帶,用核酸試劑盒回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物,保存于冰箱,該熒光標(biāo)記基因大小約750 bp。

step(3)重疊延伸PCR擴(kuò)增含有熒光基因的Atu5117啟動(dòng)子序列。將(1)(2)兩步聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物混合當(dāng)做聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板。選取表1中對應(yīng)引物并且依照圖1和表2中反應(yīng)體系進(jìn)行重疊延伸PCR[9],PCR儀上參數(shù)設(shè)置:變性(95 ℃;5 min)、退火(55 ℃;30 s)、延伸(73 ℃;2 min)的順序28個(gè)循環(huán),將反應(yīng)產(chǎn)物在90 V電壓條件下進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,反應(yīng)時(shí)間35～40 min,將反應(yīng)產(chǎn)物凝膠進(jìn)行溴化乙錠(EB)染色,熒光下觀察目的基因條帶,并將切下目的基因?qū)?yīng)的條帶,核酸試劑盒回收產(chǎn)物并保存于冰箱。

圖1 重疊延伸PCR的過程圖

1.2.2 提取大腸桿菌PRSET-A質(zhì)粒

研究選用圖2大腸桿菌中質(zhì)粒作為構(gòu)建原核表達(dá)載體的基本單元。質(zhì)粒提取步驟如下:

圖2 原核表達(dá)載體基本質(zhì)粒

(1)活化單菌落:選取含基礎(chǔ)質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中(含有氨芐青霉素),37 ℃搖床培養(yǎng)24 h;

(2)離心:將菌液于無菌的1.5 mL離心管中12 000 r/min,離心2 min,棄上清;

(3)懸浮菌體:用槍頭吸取250 μL溶液I(含有RNase A)不斷吸打溶液,懸浮菌體;

(4)裂解菌體:加入250 L的溶液II使菌體充分裂解,形成透明溶液,時(shí)間控制在5 min之內(nèi)。

(5)離心:加入4 ℃溶液 III(350 μL),混勻,冰浴靜置2 min,12 000 r/min,離心10 min;

(6)將500 μL的BL緩沖液加入核酸純化柱中,12 000 r/min,離心1 min,棄濾液;

(7)將步驟(5)中的上清液轉(zhuǎn)移至純化柱中,其他步驟同(6);

(8)將500 μL的WA緩沖液加入純化柱中,12 000 r/min離心30 s,棄濾液;

(9)將700 μL的WB緩沖液加入純化柱中,12 000 r/min離心30 s,棄濾液;重復(fù)操作1次;

(10)將純化柱安置于新的1.5 mL離心管中,向純化柱膜的中央處加入50 L無菌蒸餾水,室溫靜置1 min;

(11)12 000 r/min離心1 min,將DNA洗脫。

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得無T7啟動(dòng)子基本質(zhì)粒

為了將基礎(chǔ)單元質(zhì)粒(PRSET-A)中的T7啟動(dòng)子去除而插入帶有熒光標(biāo)記基因的Atu5117啟動(dòng)子,首先設(shè)計(jì)一對引物,該對引物序列設(shè)計(jì)在基礎(chǔ)單元質(zhì)粒的T7啟動(dòng)子序列兩端,并且引物上帶有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn),按照表2反應(yīng)體系將各組分別加入PCR管中,以基本質(zhì)粒為模板,渦旋振蕩器振蕩混勻,在PCR儀進(jìn)行參數(shù)設(shè)置:預(yù)變性(94 ℃;4 min)、變性(95 ℃;5 min)、退火(55 ℃;30 s)、延伸(73 ℃;2 min)的順序28個(gè)循環(huán),進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),將產(chǎn)物在電壓90 V的條件下瓊脂糖凝膠電泳35～40 min,用核酸染料(溴化乙錠)進(jìn)行凝膠染色并在紫外光下觀察目的基因,并切下目的基因?qū)?yīng)的凝膠條帶,用核酸試劑盒回收,將并回收產(chǎn)物凍存于-18 ℃冰箱。

1.2.4 篩選重組子質(zhì)粒

首先,限制性內(nèi)切酶酶切目的基因。用限制性內(nèi)切酶酶切無T7啟動(dòng)子的基礎(chǔ)單元質(zhì)粒(PRSET-A)和含熒光基因的Atu5117啟動(dòng)子序列,限制性內(nèi)切酶均選取BAMH Ⅰ,酶切過程按照酶供應(yīng)商提供的說明步驟進(jìn)行酶切消化。酶切體系:去離子水: 9 mL;10倍磷酸緩沖液:2 mL;DNA:8 mL;限制性內(nèi)切酶(BAMH Ⅰ):1 mL。并且按照37 ℃水浴3 h的消化說明體系進(jìn)行消化,并回收產(chǎn)物[8]。

其次,酶切產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化、篩選重組子。將1.2.4(1)中的兩部分酶切產(chǎn)物進(jìn)行基因連接,連接體系:DNA:6 mL;10倍T4連接酶緩沖液:1 mL;T4基因連接酶:1 mL;載體:2 mL。根據(jù)連接體系將限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物與載體相連接,并且進(jìn)行宿主菌感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌DH5α)的轉(zhuǎn)化,具體轉(zhuǎn)化過程如下:

1)在冰浴條件下,將10 mL基因連接產(chǎn)物加入50 mL宿主細(xì)胞中,搖勻;

2)半小時(shí)后,在42 ℃條件下熱激活90 s;

3)在冰浴條件下,將800 mL滅菌的無抗生素的LB培養(yǎng)基加入離心管中,在搖床中培養(yǎng)1 h(培養(yǎng)溫度:37 ℃,轉(zhuǎn)速210 r/min)使細(xì)菌活化;

4)離心活化后的菌液(離心條件:轉(zhuǎn)速5 500 r/min,時(shí)間10 min),取下層菌體并用緩沖液懸浮,將菌液涂平板,過夜37 ℃培養(yǎng)。

將轉(zhuǎn)化成功的單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),取對數(shù)生長期的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取,限制性內(nèi)切酶酶切,瓊脂糖凝膠電泳并在紫外光下觀察目的基因,鑒定目的基因序列大小,并將該原核重組表達(dá)載體命名為PRSET-Agfp1。

再次,原核重組探針載體的綠色熒光觀察結(jié)果。將轉(zhuǎn)化成功的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng),取對數(shù)生長期菌液制作熒光顯微鏡載玻片觀察是否有綠色熒光出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Atu5117啟動(dòng)子嵌合基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增圖

選取模板PGFP-N1質(zhì)粒,如圖3所示,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到綠色熒光基因。如圖4所示,通過重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得嵌合基因。

圖3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增熒光基因電泳圖

圖4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Atu5117啟動(dòng)子嵌合基因電泳圖

2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得無T7啟動(dòng)子基本質(zhì)粒

選取表1中對應(yīng)引物,以基本質(zhì)粒PRSET-A為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)模板,依據(jù)表2的反應(yīng)體系進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),獲得大小約2.75 kb的無T7啟動(dòng)子的質(zhì)粒PRSET-A,如圖5所示,用于構(gòu)建原核表達(dá)載體。

圖5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增無啟動(dòng)子的基礎(chǔ)質(zhì)粒PRSET-A電泳圖

2.3 原核表達(dá)載體限制性內(nèi)切酶酶切鑒定結(jié)果

相同的限制性內(nèi)切酶酶切條件下,在無T7啟動(dòng)子的基礎(chǔ)質(zhì)粒PRSET-A上插入帶有標(biāo)記的Atu5117啟動(dòng)子嵌合基因,轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(大腸桿菌DH5α)并培養(yǎng)。如圖6所示,經(jīng)過DNA質(zhì)粒的提取,限制性內(nèi)切酶酶切等步驟,圖6電泳結(jié)果與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果統(tǒng)一一致,說明新的重組原核表達(dá)載體已經(jīng)成功構(gòu)建。

圖6 PRSET-Agfp1質(zhì)粒酶切鑒定圖

2.4 驗(yàn)證Atu5117啟動(dòng)子在重組表達(dá)載體PRSET-Agfp1中的活性

選取兩種宿主細(xì)胞菌液進(jìn)行熒光顯微鏡觀察,如圖7所示,左邊是只有基礎(chǔ)載體(PRSET-A)的大腸桿菌菌液沒有綠色熒光;而右圖帶有標(biāo)記基因的Atu5117啟動(dòng)子重組表達(dá)載體(PRSET-Agfp1)有綠色熒光,說明帶有綠色熒光標(biāo)記基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖7 重組表達(dá)載體綠色熒光結(jié)果

3 結(jié) 論

通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),以綠色熒光基因?yàn)閳?bào)告基因,獲得了VBP1蛋白的編碼基因Atu5117基因的全長啟動(dòng)子序列。并且成功取代無T7啟動(dòng)子的PRSET-A質(zhì)粒,成功構(gòu)建了PRSET-Agfp1原核表達(dá)載體,接下來將通過綠色熒光的強(qiáng)弱來進(jìn)一步研究在重組表達(dá)載體中Atu5117啟動(dòng)子的活性強(qiáng)弱,為進(jìn)一步探索農(nóng)桿菌的分子表達(dá)調(diào)控機(jī)理及其在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用方面奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。