柴圓圓 嚴(yán) 翹 董正邦 王飛

1蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院皮膚科,江蘇蘇州,215000;2東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院皮膚科,江蘇南京,210000

乳房外Paget病(extramammary Paget’s disease, EMPD)是一種少見(jiàn)的特殊類型皮膚惡性腫瘤,占外陰腫瘤的1%～2%,好發(fā)于頂泌汗腺豐富的部位,外陰與陰囊是最常見(jiàn)的好發(fā)部位［1］。腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移決定了腫瘤的預(yù)后,是惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特性之一。雖然EMPD惡性程度較低,但是作為一種腫瘤組織,同樣具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力［2］。免疫組化在腫瘤的治療及預(yù)后中起著重要的指導(dǎo)作用,因此尋找腫瘤的特異性免疫標(biāo)志物一直是臨床熱點(diǎn)問(wèn)題。

上皮細(xì)胞間質(zhì)化(EMT)是一種從有極性的不能移動(dòng)的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的改變,導(dǎo)致細(xì)胞移動(dòng)能力的增加,在腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用［3,4］, E-鈣黏蛋白與β-連環(huán)蛋白都是EMT機(jī)制中重要的分子,介導(dǎo)著細(xì)胞間黏附作用［3］。目前在多個(gè)研究中,E-鈣黏蛋白與β-連環(huán)蛋白被發(fā)現(xiàn)其表達(dá)高低與甲狀腺癌、食管癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌及膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)［5,6］,但是關(guān)于兩者在乳房外Paget病中的表達(dá)情況及預(yù)后的關(guān)系鮮有報(bào)道。

本研究收集33例原發(fā)性EMPD患者及25例正常包皮組織,旨在檢測(cè)E-鈣黏蛋白及β-連環(huán)蛋白在乳房外Paget病中的表達(dá)情況,分析其在EMPD腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)組資料來(lái)自2010年1月至2018年10月期間在東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院、南京市鼓樓醫(yī)院和無(wú)錫錫山人民醫(yī)院經(jīng)病理組織檢查確診的原發(fā)性EMPD患者,并電話隨訪至2019年3月。共33例,男26例,女7例,男女比例為26∶7。發(fā)病年齡51～83歲,平均發(fā)病年齡(70.46±8.79)歲。

對(duì)照組資料來(lái)自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)的健康男性的正常包皮皮膚。25例男性患者,年齡40～53歲,平均年齡(45.26±3.46)歲。

1.2 主要試劑 福建邁新生物技術(shù)有限公司的Anti-E Cadherin antibody(ab40772)、Anti-beta Catenin antibody(ab32572)、液體DAB酶底物顯色試劑盒、非生物素二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒、抗原修復(fù)液;自行配制的磷酸鹽(PBS)緩沖液、其他如中性樹(shù)膠、無(wú)水乙醇、二甲苯、丙酮、雙氧水、雙蒸水、伊紅等試劑。

1.3 免疫組化 石蠟切片經(jīng)過(guò)取材、甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、4 μm連續(xù)均勻切片,在72℃下烤片1 h制成;然后常規(guī)脫蠟、蘇木紫染色、鹽酸乙醇分化、蒸餾水浸漬、伊紅液浸泡、常規(guī)脫水、透明、封片、抗原修復(fù)、免疫組化二步法染色,最后顯微鏡下觀察。

1.4 染色結(jié)果判定 目前,在對(duì)病理組織中免疫組化指標(biāo)的定量尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用半定量積分法界定,E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白為細(xì)胞膜著色。(1)染色強(qiáng)度評(píng)分:棕褐色著色為3分,棕黃色著色為2分,淺黃色著色為1分,基本不著色為0分;(2)染色百分率評(píng)分:高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞平均百分比:陽(yáng)性細(xì)胞百分比<5%為0分, 5%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,≥76%為4分;(3)以染色強(qiáng)度和染色百分率的評(píng)分之積進(jìn)行結(jié)果判定:0分為陰性(-),1～3分為弱陽(yáng)性(+),4～6分為陽(yáng)性(++),≥7分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。其中,將強(qiáng)陽(yáng)性及陽(yáng)性定義為高表達(dá),弱陽(yáng)性定義為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用卡方檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,檢驗(yàn)水準(zhǔn)均采用α=0.05,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;并且用spearman相關(guān)性分析E-鈣黏蛋白及β-連環(huán)蛋白之間的關(guān)系,采用P<0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 E-鈣黏蛋白在EMPD中的表達(dá) E-鈣黏蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜上。33例EMPD患者病理組織中E-鈣黏蛋白的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為0,陽(yáng)性表達(dá)率為36.4%(12/33),弱陽(yáng)性表達(dá)率為51.5%(17/33),陰性表達(dá)率為12.1%(4/33),見(jiàn)圖1、2;E-鈣黏蛋白在25例正常組織中全部為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),見(jiàn)圖4a。E-鈣黏蛋白在EMPD和正常皮膚組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

圖1 EMPD組織病理(HE,×40) 1a:原位性EMPD見(jiàn)表皮內(nèi)成巢分布的Paget細(xì)胞;1b:侵襲性EMPD見(jiàn)Paget細(xì)胞侵襲至真皮層及毛囊;1c:轉(zhuǎn)移性EMPD見(jiàn)Paget細(xì)胞累及真皮層 圖2 E-鈣黏蛋白在EMPD中的表達(dá)(免疫組化,×100) 2a:E-鈣黏蛋白在原位性EMPD中的陽(yáng)性表達(dá);2b:E-鈣黏蛋白在侵襲性EMPD中的弱陽(yáng)性表達(dá);2c:E-鈣黏蛋白在轉(zhuǎn)移EMPD中的弱陽(yáng)性表達(dá) 圖3 β-連環(huán)蛋白在EMPD中的表達(dá)(免疫組化,×100) 3a:β-連環(huán)蛋白在原位性EMPD中的陽(yáng)性表達(dá);3b:β-連環(huán)蛋白在侵襲性EMPD中的陽(yáng)性表達(dá);3c:β-連環(huán)蛋白在轉(zhuǎn)移EMPD中的弱陽(yáng)性表達(dá)

圖4 4a:E-鈣黏蛋白在正常組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化,×100);4b:β-連環(huán)蛋白在正常組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(免疫組化,×200)

表1 E-鈣黏蛋白在EMPD與正常皮膚組織中的表達(dá)

2.2 E-鈣黏蛋白與EMPD患者臨床和病理特征的關(guān)系 E-鈣黏蛋白的表達(dá)與EMPD患者的年齡、性別、發(fā)病部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05),與發(fā)生真皮浸潤(rùn)有顯著相關(guān)性(P<0.05),E-鈣黏蛋白的表達(dá)與EMPD臨床及病理特征的關(guān)系,見(jiàn)表2。

表2 E-鈣黏蛋白的表達(dá)與EMPD臨床及病理特征的關(guān)系

2.3 β-連環(huán)蛋白在EMPD的表達(dá) β-連環(huán)蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞膜上,少數(shù)胞漿也有黃色顆粒狀表達(dá)。33例EMPD患者病理組織中β-連環(huán)蛋白的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率為3.0%(1/33),陽(yáng)性表達(dá)率為54.5%(18/33),弱陽(yáng)性表達(dá)率為24.2%(8/33),陰性表達(dá)率為18.2%(6/33),見(jiàn)圖3;β-連環(huán)蛋白在25例正常組織中全部為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),見(jiàn)圖4b。β-連環(huán)蛋白在EMPD和正常皮膚組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 β-連環(huán)蛋白在EMPD與正常皮膚組織中的表達(dá)

2.4 β-連環(huán)蛋白與EMPD患者臨床和病理特征的關(guān)系 β-連環(huán)蛋白的表達(dá)與EMPD患者的年齡、性別、發(fā)病部位、真皮浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 β-連環(huán)蛋白的表達(dá)與EMPD臨床及病理特征的關(guān)系

2.5 E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白在EMPD中表達(dá)的相互關(guān)系 33例EMPD患者中,12例E-鈣黏蛋白高表達(dá)的患者中β-連環(huán)蛋白高表達(dá)9例,低表達(dá)3例,陰性表達(dá)0例;17例E-鈣黏蛋白低表達(dá)的患者中β-連環(huán)蛋白高表達(dá)10例,低表達(dá)4例,陰性表達(dá)3例;4例E-鈣黏蛋白低表達(dá)的患者中β-連環(huán)蛋白高表達(dá)0例,低表達(dá)1例,陰性表達(dá)3例;Spearman相關(guān)分析數(shù)據(jù)結(jié)果顯示:E-鈣黏蛋白與β-連環(huán)蛋白在EMPD患者病理組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.490,P<0.01),見(jiàn)表5。

表5 EMPD中E-鈣黏蛋白與β-連環(huán)蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移在分子水平上我們將其分為這3個(gè)過(guò)程:細(xì)胞黏附、細(xì)胞表面基質(zhì)降解、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)。這一過(guò)程的前提是腫瘤細(xì)胞之間的細(xì)胞黏附力下降,而細(xì)胞黏附能力異常是上皮細(xì)胞間質(zhì)化(EMT)的一個(gè)重要特征［7］。E-鈣黏蛋白是Ca2+依賴性細(xì)胞黏附因子,主要介導(dǎo)細(xì)胞間黏附及維持細(xì)胞骨架的作用［4］。β-連環(huán)蛋白是一種具有多功能的蛋白質(zhì),既可以作為細(xì)胞黏附分子與E-鈣黏蛋白結(jié)合形成黏附復(fù)合體,介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用［8］,同時(shí)也可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,是wnt信號(hào)通路的重要元件,可以反向抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)［9］。

E-鈣黏蛋白作為介導(dǎo)細(xì)胞間黏附作用的主要分子,其表達(dá)的下降被認(rèn)為是EMT的結(jié)果。EMT機(jī)制中的轉(zhuǎn)錄因子如ZEB家族、Slug、Snail及Twist家族均可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合E-鈣黏蛋白基因的啟動(dòng)子［5］,抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá),導(dǎo)致E-鈣黏蛋白減少,細(xì)胞間黏附連接力喪失,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從細(xì)胞團(tuán)塊上脫落,從而發(fā)生腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。目前,在多個(gè)腫瘤中,E-鈣黏蛋白表達(dá)的減少被認(rèn)為與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān),包括肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌等［5］。本實(shí)驗(yàn)中,EMPD患者的腫瘤組織E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯低于正常組織,且原位組與侵襲組之間E-鈣黏蛋白的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是E-鈣黏蛋白在未轉(zhuǎn)移組與轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此我們可以推斷,E-鈣黏蛋白表達(dá)的降低與EMPD腫瘤發(fā)生侵襲具有相關(guān)性,但不能作為EMPD腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

一方面,在正常組織中β-連環(huán)蛋白與E-鈣黏蛋白發(fā)揮同質(zhì)黏附作用,抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移;但是另一方面在腫瘤細(xì)胞中,β-連環(huán)蛋白通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活EMT機(jī)制,促使腫瘤的增生、侵襲及轉(zhuǎn)移［6］。目前,已有研究發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白在軟組織肉瘤、甲狀腺癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌中異常表達(dá),并且其表達(dá)的增強(qiáng)與上述腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)［6,7］。但是,關(guān)于β-連環(huán)蛋白在EMPD中表達(dá)情況及與腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)系研究的文獻(xiàn)國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道,國(guó)外Ellis等［10］的研究中包含了63例EMPD患者,其中有8例侵襲性EMPD,結(jié)果顯示β-連環(huán)蛋白在原位組與侵襲組中分別有9%和12%的患者中呈高表達(dá),結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中,β-連環(huán)蛋白在EMPD組中的表達(dá)明顯低于正常組織,但是其表達(dá)與侵襲及轉(zhuǎn)移無(wú)顯著相關(guān)性,這一點(diǎn)與β-連環(huán)蛋白在其他腫瘤中的表達(dá)結(jié)果不同,但是與Patricia等結(jié)果相似。

在其他惡性腫瘤中,如甲狀腺癌、乳腺癌等,由于EMT機(jī)制中的多條信號(hào)通路被激活,β-連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并且積累,E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào),使腫瘤細(xì)胞間黏附作用喪失,促進(jìn)了腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。但是在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)E-鈣黏蛋白及β-連環(huán)蛋白在EMPD中的表達(dá)都在細(xì)胞膜上,明顯低于正常組織,且兩者表達(dá)呈正相關(guān)性。因此,筆者認(rèn)為一方面E-鈣黏蛋白及β-連環(huán)蛋白在EMPD中的表達(dá)是協(xié)同作用,共同維持細(xì)胞黏附作用;另一方面,推測(cè)β-連環(huán)蛋白在EMPD中并沒(méi)有通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。但是我們實(shí)驗(yàn)的樣本量較小,侵襲及轉(zhuǎn)移性EMPD所占比例較低,日后需要更多更大的樣本量進(jìn)行探究?jī)烧咧g具體的發(fā)生機(jī)制。

綜上所述,在EMPD中,E-鈣黏蛋白表達(dá)的減少可以使EMPD腫瘤細(xì)胞間的黏附力降低,促使腫瘤的侵襲。我們需要更多研究去探索E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)的機(jī)制,研發(fā)出促使腫瘤患者E-鈣黏蛋白重新表達(dá)的新型靶向藥物,為EMPD提供新的治療方向。