張永濤，琚保軍，李霄，姚均超，李魯豫，馬苗苗

(河南中醫(yī)藥大學 1.第一臨床醫(yī)學院;2.第一附屬醫(yī)院男科,鄭州 450000)

WHO定義男性不育癥為夫婦同居1年以上,有正常性生活且未采取任何避孕措施,由于男方因素導致女法無法受孕[1]。男性不育癥的病因復雜,往往是多種病因引起。精液質量檢測因其便捷的特點成為評估男性生育能力的基礎檢查[2],然而僅僅依靠精液常規(guī)檢測參數并不能全面評估男性生育功能,約15%的男性不育癥患者精液質量檢測結果正常[3]?？紤]到精液質量檢測指標只能觀察到精子形態(tài)的完整性,并不能揭示精子所攜帶遺傳物質的完整性,因此需要借助另一種實驗室檢查進一步評估精子中遺傳物質的完整性。精子DNA碎片率(DFI)是反應男性生育能力的一個更有效的指標,它能從微觀層面上揭示精子上的形態(tài)和功能的改變[2]。因為DNA的完整性對男性生殖有重要作用,精子DNA損傷不僅會影響精液質量,還能影響精子功能。本研究通過觀察153例男性不育癥患者DFI與年齡、精液量、前向運動(PR)精子、精子總活力[PR精子+非前向運動(NP)精子]、精子濃度、精子總數之間的相關性,分析DFI是否能反映男性的生殖能力。

一、研究資料與方法

1.研究對象:回顧性分析2021年11月至2022年6月至河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院男科門診就診的153例男性不育癥患者的臨床資料。

納入標準:符合男性不育癥診斷標準,年齡為21～51歲;無遺傳病史及家族史,有正常的性生活,無不良生活習慣;體格檢查(陰莖、陰囊、睪丸、附睪、精索靜脈)未見異常。

排除標準:梗阻性無精子癥;因女方因素(輸卵管梗阻、排卵功能障礙、炎癥等)導致的不孕;有陰莖發(fā)育異常、睪丸缺如、精索靜脈曲張等發(fā)育異常的情況;伴有家族遺傳病或染色體核型異常者。

本研究共納入153例患者。根據患者精液常規(guī)檢測結果分為兩組:PR精子率為0.98%～32.00%或精子濃度<40×106個/ml,其余精液參數指標正常的為少弱精子癥組(n=74);精液各項參數指標均正常的為精液參數正常組(n=79)。

2.儀器與試劑:賽司(SAS)精子分析系統(tǒng)(北京賽司醫(yī)療科技);CYTEK流式細胞儀及基于流式細胞技術的精子染色質結構分析系統(tǒng)(SCSA;無錫廈泰生物科技);離心機(安徽中科中佳)、恒溫水浴箱、電子秤、量杯、pH試紙、移液槍;SAS精子檢測板(無錫廈泰生物科技);吖啶橙染色液(國為生物科技)。

3.標本收集及常規(guī)質量檢測:禁欲2～7 d,以手淫的方式將精液收集到無菌量杯內,之后將標本置于37℃恒溫水浴箱,并記錄液化時間[4]。液化后使用SAS精子分析系統(tǒng)檢測精子總活力、PR、精子濃度、精子總數等精液質量指標[5]。

4.DFI檢測:取精液標本用吖啶橙染色液聯合流式細胞儀(無錫廈泰生物科技)檢測精子DFI及精子成熟染色質含量。將液化后的精液5 μl移入樣本管中,加吖啶橙染色液試劑盒中的A液稀釋至50 μl,終濃度為1～2×106/ml的精子細胞;再加B液100 μl,準確計時30 s后加入C液300 μl,制備完成后混勻,上機檢測。精子核經過酸處理液處理后,再經吖啶橙染色,異常精子核染色質成單鏈與染料吖啶橙結合成橙黃色或紅色熒光;正常精子核染色質為雙鏈與吖啶橙結合成綠色熒光。

二、結果

1.不同精液參數組精液檢測指標比較:本研究共納入符合男性不育癥診斷標準的153例患者,年齡為21～51歲,平均年齡為(31.24±4.59)歲。按照精子活力/濃度分為少弱精子癥組(n=74)和精液參數正常組(n=79)兩組。

兩組間年齡比較無顯著差異(P>0.05);少弱精子癥組精子濃度、精子總數、精子總活力和PR精子率均顯著低于精液參數正常組(P<0.05),而 DFI顯著高于精液參數正常組(P<0.05);其中,少弱精子癥組DFI≤15%比例更低、DFI≥30%比例更高(P<0.05)(表1)。

表1 不同精液參數組間精液檢測指標比較[(-±s),%］

2.不同DFI組間精液檢測指標比較:將153例患者根據不同DFI值分成3個亞組:DFI≤15%組(n=76)、15%

DFI≤15%組的精子總活力和PR精子顯著高于15%

表2 不同DFI組間精液檢測指標比較(-±s)

3.精子DFI與年齡、精液檢測指標的相關性分析:Spearman相關性分析結果顯示,精子DFI與年齡(r=0.244,P=0.002)、精液量(r=0.164,P=0.042)呈正相關;精子DFI與精子濃度(r=-0.254,P=0.002)、精子總數(r=-0.169,P=0.037)、PR精子率(r=-0.564,P<0.001)、精子總活力(r=-0.585,P<0.001)均呈成負相關(圖1)。

圖1 DFI與年齡、精液檢測指標相關性分析圖

三、討論

近幾年的研究發(fā)現,男性精液質量呈現逐年下降的趨勢,而且男性不育的發(fā)生率逐年上升[6]。男性不育癥是男科中一種較為常見的疾病,其致病原因復雜、影響因素較多,且臨床上大多數患者以精液質量異常為主,其他癥狀不顯。因此,通過了解精液中精子的濃度、活力等指標的精液常規(guī)檢查,可以初步判斷男性的生殖能力。但男性精液質量會受到多種因素的影響,僅僅依靠精液常規(guī)檢查可能會影響到男性不育癥的診斷。焦瑞寶等[7]研究發(fā)現,選取81例不育癥患者的精液分析,發(fā)現有36例患者精液濃度與活力結果均正常,約占44.4%。王陽等[8]研究發(fā)現,548例男性不育癥患者精液檢測結果正常的占4.93%。

目前研究發(fā)現,精子DNA鏈的完整程度對于評價精子質量、提高受精成功率和選取輔助生殖技術等都具有非常重要的作用。精子DFI是用來評價精子DNA完整性的主要指標之一。DNA損傷主要有單鏈斷裂(SSB)和雙鏈斷裂(DSB)兩種形式,但精子DNA損傷的機制尚未完全明確,現認為男性精子DNA損傷的機制主要分成內源性因素與外源性因素。外源性因素包括環(huán)境污染和不健康的生活方式,如長期吸煙、喝酒、熬夜和生殖系統(tǒng)病變(感染、精索靜脈曲張、睪丸扭轉等)[9]。內源性因素可分成:(1)在生精過程中發(fā)生細胞凋亡[10];(2)在包裝過程中染色質發(fā)生異常[11];(3)在運輸過程中受到氧自由基的影響[12]。

本研究結果顯示,少弱精子癥組精子濃度、精子總數、精子總活力、PR均顯著低于精液參數正常組(P<0.05),而DFI顯著高于精液參數正常組(P<0.05)。這說明DFI升高在一定程度上表現為精子質量下降,具體表現為精子濃度、精子總數、精子總活力、PR等精液指標下降。因此,可以從宏觀精液指標(精子濃度、精子總數、精子總活力、PR精子率等指標)上初步評估男性生育能力,還能從DFI上揭示精子DNA的完整性,評估后期胚胎發(fā)育及是否出現反復性流產等情況。本研究發(fā)現,精液參數正常組精子DFI≤15%所占比例顯著高于少弱精子癥組(P<0.05),而DFI≥30%所占比例顯著低于少弱精子癥組(P<0.05),說明精子質量下降可能與DFI升高有關。既往研究發(fā)現,不管是外源性因素還是內源性因素均可導致DFI升高[9-12],因此要注意生活方式的改變,如避免吸煙、喝酒、長期熬夜、久坐等不良生活習慣等。

本研究根據不同DFI值將納入患者分成3個亞組,比較各亞組間精液檢測指標發(fā)現:與DFI≤15%組比較,15%0.05)。此結果與部分研究[13-14]結果不一致,這可能與其研究對象和方法不同有關。本研究發(fā)現,不育癥患者精子DFI與患者年齡呈正相關,這與以往部分研究[14]結果相似。這應當與精子DFI隨著年齡的增長而升高有關,DNA損傷修復機制并不能完全修復所有損傷,而且人體自我修復機制的能力會隨著年齡的增長而不斷下降[15],未能修復的DNA損傷一旦存留下來還會影響胚胎質量。本研究發(fā)現,精子DFI與精子濃度、精子總數、PR精子率、總活力等精液檢測指標均呈負相關,此結果與曾蘭等[16]的研究結果相類似,提示精子DFI具有較好的重復性,可作為診斷男性不育癥的指標[17]。精子細胞凋亡異常、氧化應激反應、染色質異常均會導致精子DNA損傷,這些因素也會影響精子濃度、精子總數、精子形態(tài),因此在診斷男性不育癥患者時有必要關注患者的精子DFI。不育癥患者的精子DFI變化趨勢與精液常規(guī)檢測指標的變化相符,說明精子DFI與精子形態(tài)直接相關,也表明精子DFI與精液常規(guī)檢測指標(精子總數、精子濃度、精子總活力、PR精子率)存在著密切聯系。本研究中精子DFI與精液檢測指標中PR精子率、精子總活力呈負相關,說明精子DNA損傷可能是少弱精子癥的主要因素之一,也可能是男性不育癥的主要因素之一。

在測定方法上,本研究選擇了吖啶橙染色聯合流式細胞儀的方法,避免了技術人員在顏色的判斷上受到主觀因素的影響。但精子DFI測定目前尚未制定統(tǒng)一規(guī)范,Evenson等[18]以生育率為指標將精子DFI閾值設定在25%～30%。本研究按照DFI值分成3個亞組,分組依據與既往研究[19]相一致。

為了進一步探究“精子DFI與精液常規(guī)指標的趨勢相近”這一推測,本研究將少弱精子癥組和精液參數正常組中的DFI值分別計算比例,發(fā)現少弱精子癥組中DFI≤15%占比為32.43%(24/74),顯著低于精液參數正常組中DFI≤15%的占比[65.82%(52/79)]。但是在精液參數正常組中有約34.17%的精子DFI值是異常的,說明即使精液常規(guī)檢測指標正常時,仍會有一定比例的患者精子DFI結果不理想。因此,相比與精液常規(guī)檢測,精子DFI能從DNA結構完整性上揭示男性不育癥患者的微觀發(fā)病因素。此外,羅英等[20]研究發(fā)現,高DFI對于使用輔助生殖妊娠結局有不好的影響,甚至部分患者出現反復流產、妊娠失敗的情況。王金寶等[21]研究發(fā)現,DFI>25%時會導致臨床妊娠率顯著降低(P<0.05)。因此,對于不育癥患者檢查精子DFI不僅可以在DNA結構完整性上揭示男性不育癥的微觀因素,還可以對妊娠結局做出預測。

綜上所述,精子DFI與精子濃度、精子總數、PR精子率、精子總活力等精液檢測指標直接相關;此外,即使精液指標表現為正常的不育癥患者,精子DFI也會出現變化,因此在微觀層面上更好地解釋了精液常規(guī)檢測指標正常者中不育癥的影響因素;精子DFI也能為妊娠結局做出預測。結合精液常規(guī)檢測和其他精子檢測指標,根據患者情況采取精子DFI檢測可更客觀、更全面地反映男性的生殖能力。但本研究樣本量不足,時間跨度過短,數據分析方法不足,還需加大樣本量、拉長時間跨度、深入分析數據,并進行不同地域之間的比較。