胡巨偉，鄭娟，孟珂，周黎明，李潔

(寧波市婦女兒童醫(yī)院,寧波 315000)

輔助生殖技術(shù)為越來越多的不孕不育家庭帶來了生育的希望,已經(jīng)成為了最主要的助孕手段之一,但仍有約10%的患者在輔助生殖助孕過程中會(huì)發(fā)生反復(fù)種植失敗(RIF)。根據(jù)中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)的專家共識(shí)[1],RIF定義為:40歲以下成年女性在3個(gè)新鮮或冷凍周期內(nèi)移植至少3枚優(yōu)質(zhì)胚胎后仍未能實(shí)現(xiàn)臨床妊娠,其中優(yōu)質(zhì)胚胎包括第3天優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎(細(xì)胞數(shù)≥8個(gè)、卵裂球大小均勻、碎片率<10%)和優(yōu)質(zhì)囊胚(≥3BB)。RIF病因復(fù)雜多樣,已成為影響輔助生殖助孕成功率的瓶頸之一。影響胚胎種植的因素繁多,涉及輔助生殖的整個(gè)流程,主要包括母胎界面免疫因素、生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常、控制性促排卵方案的影響、胚胎因素以及黃體支持方案等。近年來,越來越多的研究將目光專注于這一領(lǐng)域。但是,大多數(shù)研究聚焦于解剖學(xué)結(jié)構(gòu)異常、母胎界面的免疫紊亂以及基因異常等方面[2-3],而患者自身因素、體外受精-胚胎移植(IVF-ET) 過程及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)RIF的影響的研究鮮有報(bào)道。本研究通過回顧性分析522個(gè)RIF周期和935個(gè)正常妊娠周期患者自身因素及胚胎實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),探索輔助生殖過程中發(fā)生RIF的危險(xiǎn)因素,為RIF的病因篩查和臨床治療提供理論依據(jù)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2019年1月至2022年12月在寧波市婦女兒童醫(yī)院生殖中心行IVF-ET助孕治療的不孕不育患者的臨床資料。根據(jù)移植次數(shù)和妊娠結(jié)局分為RIF周期組(RIF組)和正常妊娠周期組(對(duì)照組)。

RIF組納入標(biāo)準(zhǔn):女方年齡<40歲,在3個(gè)新鮮或凍融胚胎移植周期內(nèi)移植至少3枚優(yōu)質(zhì)胚胎后仍未能實(shí)現(xiàn)臨床妊娠,其中優(yōu)質(zhì)胚胎包括第3天優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎(細(xì)胞數(shù)≥8個(gè)、卵裂球大小均勻、碎片率<10%)和優(yōu)質(zhì)囊胚(≥3BB)。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):女方年齡<40歲,一次新鮮胚胎移植周期即獲得臨床妊娠。

排除標(biāo)準(zhǔn):有染色體異常患者;有嚴(yán)重的生殖道或?qū)m腔畸形患者;行植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)患者。

共納入522個(gè)RIF周期和935個(gè)正常妊娠周期。本研究獲得寧波市婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過。

二、助孕過程回顧

根據(jù)患者的年齡、基礎(chǔ)卵泡刺激素(FSH)水平、抗苗勒管激素(AMH)水平、竇卵泡數(shù)(AFC)和既往促排卵周期的反應(yīng)等綜合考慮選擇促排卵方案,個(gè)體化制定促性腺激素(Gn)啟動(dòng)劑量。Gn刺激4 d后開始卵泡監(jiān)測(cè),根據(jù)超聲和血清性激素水平及時(shí)調(diào)整Gn劑量,當(dāng)60%的主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)16～18 mm時(shí),肌肉注射4 000～10 000 U人絨毛膜促性腺激素(HCG),36～37 h后在陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。取卵4 h后行體外受精(IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI),授精18～20 h后觀察受精情況并記錄。

取卵3 d或5 d后觀察胚胎的生長(zhǎng)情況并進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)分。根據(jù)患者情況選擇1～2枚優(yōu)質(zhì)胚胎移植,移植后給予黃體支持,HCG陽性者持續(xù)黃體支持至移植后60 d。胚胎移植14 d后檢查血清HCG水平,血HCG >10 U/L診斷為HCG陽性,HCG陽性者于2周后B超檢查是否宮內(nèi)妊娠,見孕囊及胚芽者診斷為臨床妊娠。

三、觀察指標(biāo)

患者一般資料,包括女方年齡、不孕年限、不孕類型、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)AMH水平、HCG日子宮內(nèi)膜厚度;促排卵相關(guān)資料,包括Gn天數(shù)、Gn總量、HCG日黃體生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)水平以及HCG日卵泡數(shù);胚胎實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù),包括獲卵數(shù)、受精數(shù)、兩原核(2PN)受精數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者臨床資料比較

本研究共納入522個(gè)RIF周期(RIF組)和935個(gè)正常妊娠周期(對(duì)照組)。

1.一般臨床資料比較:RIF組女方年齡、不孕年限和繼發(fā)不孕比例均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),而基礎(chǔ)AMH水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般臨床資料比較[(-±s),M(P25,P75),n(%)］

2.促排卵及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)資料比較:RIF組Gn天數(shù)、Gn總量、HCG日卵泡數(shù)、內(nèi)膜厚度,以及獲卵數(shù)、受精數(shù)、2PN數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05),而HCG日LH、P水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

表2 患者促排卵及實(shí)驗(yàn)室資料比較[(-±s),M(P25,P75)］

二、RIF風(fēng)險(xiǎn)因素二元Logistic回歸分析

將上述組間比較中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入Logistic回歸分析模型,去除中介變量后,分析顯示:女方年齡、不孕年限、HCG日內(nèi)膜厚度、HCG日P水平和Gn使用天數(shù)為RIF的獨(dú)立影響因素(表3)。HCG日內(nèi)膜厚度和HCG日P水平對(duì)RIF影響較大:內(nèi)膜厚度每增加1 mm,發(fā)生RIF的風(fēng)險(xiǎn)下降約40%;HCG注射日P值每增加1 nmol/L,發(fā)生RIF的風(fēng)險(xiǎn)增加約46.2%。

表3 二元Logistic回歸分析RIF風(fēng)險(xiǎn)因素

三、ROC曲線評(píng)價(jià)Logistic預(yù)測(cè)模型

Logistic回歸模型的模型系數(shù)綜合檢驗(yàn)顯示模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=370.614,P<0.001)。用ROC曲線評(píng)價(jià)二元Logistic回歸預(yù)測(cè)模型[AUC=0.808,95%CI(0.783,0.833),P<0.001],提示我們所建立的預(yù)測(cè)模型效果較好(圖1)。

圖1 Logistic 回歸預(yù)測(cè)模型的ROC曲線

討 論

影響胚胎種植成功的關(guān)鍵因素有母體因素和胚胎因素,母體因素又包括一般危險(xiǎn)因素、子宮內(nèi)膜因素、宮腔因素、免疫因素以及內(nèi)分泌因素等[4]。我們的研究通過比較RIF組和正常妊娠組患者在一般臨床資料、促排卵過程及胚胎實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)資料方面的差異,尋找引發(fā)RIF的可能危險(xiǎn)因素,而后又通過二元Logistic回歸分析進(jìn)行多因素分析,進(jìn)一步控制混雜因素,探索RIF的獨(dú)立影響因素。我們的研究顯示,女方年齡、不孕年限、HCG日內(nèi)膜厚度、HCG日P水平和Gn使用天數(shù)為RIF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。較全面地探索了輔助生殖助孕過程中個(gè)體因素、促排卵過程和胚胎實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)中可能導(dǎo)致RIF的危險(xiǎn)因素,有助于及時(shí)有針對(duì)性地調(diào)整助孕策略,提高胚胎的種植率,得到良好的妊娠結(jié)局。

目前的研究多集中于宮腔環(huán)境對(duì)胚胎種植的影響,宮腔環(huán)境正常是胚胎種植的基本條件。多項(xiàng)研究表明,宮腔異常如子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜息肉、子宮粘膜下肌瘤、宮腔粘連等會(huì)影響胚胎種植[5-7]。但是,并非所有宮腔異常均會(huì)影響胚胎種植,明顯占位或者位置不佳的肌瘤及息肉、深部浸潤(rùn)進(jìn)而破壞生殖系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的子宮內(nèi)膜異位癥、直接損害子宮內(nèi)膜功能的子宮腺肌病以及嚴(yán)重輸卵管積水倒灌宮腔才會(huì)對(duì)胚胎種植造成較為嚴(yán)重的不良影[8]。目前,宮腔鏡檢查被認(rèn)為是宮腔內(nèi)病變?cè)u(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn),在RIF的診斷和治療中被廣泛應(yīng)用。多項(xiàng)研究表明,RIF患者在胚胎移植前行宮腔鏡檢查可顯著提高新鮮和凍融胚胎移植周期的胚胎種植率[9-10]。

胚胎植入過程還涉及母胎界面的免疫調(diào)節(jié),其中涉及多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的調(diào)控作用,是目前胚胎種植方面的研究熱點(diǎn)。子宮內(nèi)膜的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲并抑制局部母體免疫反應(yīng),對(duì)胚胎植入至關(guān)重要[1]。外周血或子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的異常也可能導(dǎo)致胚胎植入的失敗,因此免疫調(diào)節(jié)紊亂也是導(dǎo)致RIF的重要因素。

年齡和不孕年限對(duì)胚胎的種植影響是多方面的,女性隨著年齡的增長(zhǎng),體內(nèi)激素水平下降,卵巢功能也隨之下降,進(jìn)而影響卵子的質(zhì)量和胚胎的質(zhì)量。石禮紅等[11]的多因素回歸模型分析發(fā)現(xiàn)女性年齡是不孕女性行IVF-ET治療臨床妊娠結(jié)局的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,不同年齡組之間的臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,≥40歲的高齡婦女獲卵數(shù)、卵裂數(shù)、2PN數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)明顯減少。同時(shí),女性年齡還影響子宮內(nèi)膜厚度,王瑜等[12]的研究顯示隨著女性年齡增加,子宮內(nèi)膜厚度降低,臨床妊娠率也顯著降低。郭玲等[10]的研究也顯示,RIF組患者的不孕年限顯著高于對(duì)照組,回歸分析顯示,不孕年限是RIF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,我們的研究結(jié)論與其一致。

在合適的種植窗植入胚胎也是成功妊娠的關(guān)鍵[13]。種植窗期間子宮內(nèi)膜容受性最高,子宮內(nèi)膜由增值期轉(zhuǎn)化為分泌期,表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜分子和組織學(xué)產(chǎn)生變化,如上皮細(xì)胞增殖抑制、上皮細(xì)胞重塑以及基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化等[14]。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞在胚胎植入過程中參與母-胚通訊,基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化轉(zhuǎn)變?yōu)榉置诩?xì)胞后,具有促進(jìn)生長(zhǎng)和發(fā)育的重要作用。發(fā)生這些變化的原因可能與子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄組基因的差異表達(dá)有關(guān)[15-16],孕酮(P)和雌二醇(E2)是上述功能的主要調(diào)節(jié)因素,通過多種旁分泌、近分泌和自分泌因子在時(shí)空上協(xié)調(diào)子宮功能。但是,如果發(fā)生激素紊亂,P水平過早升高,子宮內(nèi)膜組織中各類型細(xì)胞的發(fā)育不同步,也會(huì)影響胚胎的種植。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,卵巢刺激后子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)錄組異常,在P水平過早升高的周期中,有45%以上的周期會(huì)發(fā)生子宮內(nèi)膜組織學(xué)進(jìn)展提前2 d,這可能是胚胎種植失敗的潛在機(jī)制[17]。這一現(xiàn)象在另一項(xiàng)凍融胚胎移植周期研究中被驗(yàn)證,當(dāng)在P水平過早升高的周期中產(chǎn)生的胚胎被玻璃化冷凍后,在隨后的復(fù)蘇移植周期中,正常妊娠率得以恢復(fù)[18]。另一項(xiàng)研究也表明,有四分之一的RIF患者表現(xiàn)為種植窗移位,對(duì)種植窗移位的RIF患者,使用子宮內(nèi)膜容受性芯片檢測(cè),采用個(gè)體化移植,可獲得正常的妊娠率和種植率[19]。

子宮內(nèi)膜厚度是子宮內(nèi)膜容受性的最直觀的指標(biāo),內(nèi)膜厚度達(dá)9～14 mm時(shí),有利于胚胎植入[20]。Peel等[21]研究結(jié)果顯示,與未妊娠組相比,妊娠組HCG日子宮內(nèi)膜厚度明顯較高,不同子宮內(nèi)膜厚度組妊娠率比較也顯示在一定范圍內(nèi)妊娠率與子宮內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)。另一項(xiàng)研究顯示,隨著子宮內(nèi)膜厚度從9 mm增長(zhǎng)到16 mm,妊娠率則從53%增加到77%,這表明不同內(nèi)膜厚度者的胚胎植入率確實(shí)存在顯著差異[22]。我們的研究結(jié)果也表明子宮內(nèi)膜厚度是RIF的獨(dú)立影響因素,為上述研究發(fā)現(xiàn)提供了新的佐證。子宮內(nèi)膜厚度對(duì)胚胎種植的影響可能和雌激素受體(ER)有關(guān),ER通常處于較低水平,ER-ɑ是雌激素作用的主要受體。有研究證明,ER-ɑ缺失的小鼠子宮發(fā)育不良且不孕[23]。另一項(xiàng)前瞻性研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜厚度欠佳的女性表現(xiàn)出異常的ER-ɑ表達(dá)模式,與ER-ɑ相關(guān)連的基因也存在差異表達(dá),這些基因可能通過影響增殖和血管生成從而在種植過程中發(fā)揮作用,可能是子宮內(nèi)膜厚度影響胚胎種植的潛在機(jī)制[24]。

Gn使用天數(shù)對(duì)RIF的影響研究較少。我們的回歸分析顯示Gn使用天數(shù)是RIF的獨(dú)立影響因素,Gn使用時(shí)間越短,發(fā)生RIF的風(fēng)險(xiǎn)越高。劉闖等[25]的研究顯示,在凍融胚胎移植周期,Gn促排卵時(shí)間與胚胎植入率和臨床妊娠率無顯著相關(guān)性,進(jìn)一步分析各組Gn用量和促排卵時(shí)間對(duì)結(jié)局交互作用影響,結(jié)果顯示Gn促排時(shí)間≥15 d,且Gn累積用量≥40支時(shí),凍融胚胎移植周期的胚胎植入率和臨床妊娠率顯著下降。關(guān)于Gn使用時(shí)間對(duì)RIF的影響還需要更深入的研究來評(píng)價(jià)。

RIF的另一個(gè)影響因素則是胚胎自身因素。許多研究發(fā)現(xiàn)胚胎遺傳物質(zhì)異常主要體現(xiàn)在染色體數(shù)目異常及結(jié)構(gòu)異常。已證實(shí)不同年齡患者形態(tài)學(xué)正常的優(yōu)質(zhì)胚胎其染色體非整倍體的發(fā)生率存在顯著差異,隨著患者年齡的增長(zhǎng),胚胎染色體非整倍體的發(fā)生率也隨之增高,RIF患者胚胎染色體非整倍體的發(fā)生率顯著高于非RIF的對(duì)照組[26]。另外,染色體結(jié)構(gòu)異常如易位、倒位、缺失及嵌合體也會(huì)影響胚胎的種植和發(fā)育[27]。

綜上所述,本研究提示女方年齡、不孕年限、HCG日內(nèi)膜厚度、HCG日P水平和Gn使用天數(shù)為RIF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,在臨床診療過程中要特別注意上述因素的變化,及時(shí)進(jìn)行治療和干預(yù)。但由于本研究屬于回顧性研究,且影響RIF的混雜因素較多,還需在今后的工作中進(jìn)行多中心的前瞻性研究以進(jìn)一步驗(yàn)證。