谷偉 馮英慧 楊繼雷

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,河北 張家口 075000)

帕金森病(PD)發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的一種,其發(fā)病機(jī)制與黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元退行性病變有關(guān),還與神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有關(guān),氧化應(yīng)激可通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡而使神經(jīng)細(xì)胞損傷〔1〕。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)屬于一種神經(jīng)毒素,其可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激,并可用于PD細(xì)胞模型的構(gòu)建〔2〕。環(huán)狀(circ)RNA屬于非編碼RNA分子,其廣泛存在于真核細(xì)胞中,且具有高度保守性與組織特異性,并可充當(dāng)微小RNA(miRNA)的海綿分子或與蛋白質(zhì)結(jié)合從而參與蛋白翻譯過(guò)程,進(jìn)而參與PD等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔3,4〕。circTLK1在心肌缺血再灌注損傷中上調(diào)表達(dá),下調(diào)其表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-214/RIPK1表達(dá)而抑制心肌細(xì)胞凋亡〔5〕。靶基因預(yù)測(cè)軟件顯示miR-16-5p可能是circTLK1的下游靶點(diǎn),miR-16-5p可減輕β淀粉樣蛋白(Aβ)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷〔6〕。但circTLK1/miR-16-5p在PD致病機(jī)制中的作用尚未可知。本研究探討circTLK1對(duì)MPP+誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH建立PD模型細(xì)胞損傷的影響及其與miR-16-5p的作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞中心;MPP+購(gòu)自上海麥克林生化;丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher;Trizol試劑、circTLK1過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-circTLK1)及其對(duì)照載體(pcDNA)、Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;circTLK1小分子干擾RNA(si-circTLK1)及其陰性對(duì)照(si-NC)、miR-16-5p特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-16-5p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、miR-16-5p寡核苷酸模擬物(miR-16-5p mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)購(gòu)自廣州銳博生物;逆轉(zhuǎn)錄試劑、實(shí)時(shí)熒光定量(qRT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連Takara;凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶;凝膠電泳試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)劑與RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;兔抗人切割型(cleaved)-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase3)、cleaved-caspase9抗體與二抗購(gòu)自美國(guó)CST。StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI;FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特。

1.2PD細(xì)胞損傷模型建立〔7〕SK-N-SH細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清)培養(yǎng),用含有用100 μmol/L的MPP+處理SK-N-SH細(xì)胞24 h,構(gòu)建PD細(xì)胞模型。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 用不含血清的培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染物,并用不含血清的培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine2000,二者充分混合,靜置20 min后加入SK-N-SH細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組:Con組:取上述培養(yǎng)的SK-N-SH細(xì)胞,不做任何處理;PD組:按照“1.2”處理細(xì)胞;PD+si-NC組:用上述轉(zhuǎn)染方法將si-NC轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后按照PD組操作處理細(xì)胞;PD+si-circTLK1組:將si-circTLK1轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后按照PD組操作處理細(xì)胞;PD+miR-NC組:將miR-NC轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后按照PD組操作處理細(xì)胞;PD+miR-16-5p組:將miR-16-5p mimics轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后按照PD組操作處理細(xì)胞;PD+si-circTLK1+anti-miR-NC組:將si-circTLK1與anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后按照PD組操作處理細(xì)胞;PD+si-circTLK1+anti-miR-16-5p組:將si-circTLK1與anti-miR-16-5p共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后按照PD組操作處理細(xì)胞。

1.4qRT-PCR測(cè)定circTLK1、miR-16-5p表達(dá) 使用Trizol分離各組SK-N-SH細(xì)胞的總RNA,然后使用SMA 400紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)評(píng)估其質(zhì)量和濃度。隨后根據(jù)制造商的說(shuō)明,使用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR Green PCR試劑盒在CFX96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為circTLK1的內(nèi)參,以U6為miR-16-5p的內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算circTLK1、miR-16-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.5檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA與GSH的水平 收集各組SK-N-SH細(xì)胞,取100 μl上清液與200 μl MDA或GSH工作試劑混合,最后用酶標(biāo)儀在532 nm或412 nm處測(cè)量吸光度。

1.6流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡 收集不同處理下的SK-N-SH細(xì)胞,加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,細(xì)胞沉淀在500 μl結(jié)合緩沖液中重懸。然后用5 μl Annexin膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(V-FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)在黑暗中雙染10 min。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)circTLK1和miR-16-5p的靶向關(guān)系 StarBase預(yù)測(cè)circTLK1和miR-16-5p的結(jié)合位點(diǎn),將含有miR-16-5p結(jié)合位點(diǎn)野生型(WT)或突變型(MUT)的circTLK1片段擴(kuò)增并插入pmirGLO熒光素酶載體中,構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO-WT-circTLK1與pmirGLO-MUT-circTLK1。將SK-N-SH細(xì)胞與100 ng構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告載體和50 nmol/L的miR-16-5p mimics或miR-NC在37 ℃共轉(zhuǎn)染24 h后收獲SK-N-SH細(xì)胞,使用熒光素酶測(cè)定試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將pcDNA-circTLK1、pcDNA、si-circTLK1、si-NC轉(zhuǎn)染至SK-N-SH細(xì)胞,采用qRT-PCR檢測(cè)miR-16-5p表達(dá)。

1.8Western印跡測(cè)量蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9表達(dá) 使用放射免疫沉淀(RIPA)裂解液分離SK-N-SH細(xì)胞總蛋白,采用定量試劑盒檢測(cè)其濃度。將30 μg蛋白裝入十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)并分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下在5%脫脂乳中封閉2 h,與cleaved-caspase3(1∶1 000)、cleaved-caspase9(1∶1 000)與GAPDH抗體(1∶3 000)一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜,然后用相應(yīng)的二抗(1∶5 000)在室溫下放置1 h。最后,用ECL試劑盒對(duì)條帶進(jìn)行可視化。采用GAPDH作為內(nèi)參。用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件,兩組間比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PD細(xì)胞中circTLK1和miR-16-5p的表達(dá) 與Con組比較,PD組circTLK1表達(dá)顯著增高,miR-16-5p表達(dá)顯著下降(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組circTLK1和miR-16-5p在PD細(xì)胞中的表達(dá)

2.2干擾circTLK1表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較,PD組MDA水平增加,GSH水平下降;與PD+si-NC組比較,PD+si-circTLK1組MDA水平下降,GSH水平增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 各組干擾circTLK1表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的影響

2.3干擾circTLK1表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較,PD組凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平增加;與PD+si-NC組比較,PD+si-circTLK1組凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表2、圖1。

圖1 各組干擾circTLK1表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞凋亡的影響

2.4circTLK1靶向并負(fù)調(diào)控miR-16-5p StarBase軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示circTLK1與miR-16-5p存在結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)圖2。與miR-NC組比較,miR-16-5p組WT-circTLK1細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),MUT-circTLK1細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。與PcDNA組(1.00±0.00)比較,PCDNA-circTLK1組miR-16-5p(0.48±0.04)顯著降低;與si-NC組(0.98±0.06)比較,si-circTLK1組miR-16-5p(3.12±0.25)顯著升高(F=134.021,P<0.05)。

圖2 StarBase分析顯示circTLK1中miR-16-5p的假定識(shí)別序列

表3 各組雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5miR-16-5p過(guò)表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響 與PD+miR-NC組比較,PD+miR-16-5p組MDA水平下降,GSH水平增加,凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)圖3、表4、圖4。

1～4:PD+miR-NC組、PD+miR-16-5p組、PD+si-circTLK1+anti-miR-NC組、PD+si-circTLK1+anti-miR-16-5p組;圖4同

圖4 各組PD細(xì)胞凋亡

表4 miR-16-5p過(guò)表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響

2.6下調(diào)miR-16-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circTLK1表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的作用 與PD+si-circTLK1+anti-miR-NC組比較,PD+si-circTLK1+anti-miR-16-5p組MDA水平增加,GSH水平下降,凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)圖3、圖4、表5。

表5 各組下調(diào)miR-16-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾circTLK1表達(dá)對(duì)PD細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的作用

3 討 論

非編碼RNA在神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,其可能為PD藥物治療的潛在靶點(diǎn)〔8,9〕。circRNA是由一種反向剪接方式形成的一種環(huán)狀結(jié)構(gòu),是由上游的剪接受體與下游的剪接供體以共價(jià)鍵結(jié)合而形成的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),circRNA可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA而發(fā)揮自身功能作用,并可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程而參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔10〕。有研究表明circDLGAP4通過(guò)調(diào)節(jié)miR-134-5p/CREB的表達(dá)而減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷從而抑制PD發(fā)生發(fā)展〔11〕。但circRNA對(duì)PD模型細(xì)胞損傷的影響及其可能作用機(jī)制尚未完全闡明。

circTLK1在腦缺血在灌注損傷中高表達(dá),敲低其表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-335-3p/TIPARP表達(dá)而減輕腦缺血在灌注損傷〔12〕。circTLK1在腎細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào),并可促進(jìn)細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移〔13〕。但circTLK1在PD模型細(xì)胞損傷中的作用仍不清楚。本研究與既往研究相似〔14〕,提示PD細(xì)胞損傷模型成功建立。本研究提示干擾circTLK1表達(dá)可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力抑制MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究結(jié)果與既往研究報(bào)道結(jié)果相似〔15〕,提示干擾circTLK1表達(dá)可減輕MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡進(jìn)而改善PD模型細(xì)胞損傷。

miRNA屬于非編碼小RNA分子,可調(diào)控細(xì)胞凋亡、自噬等生物學(xué)過(guò)程從而在PD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,circRNA或LncRNA可充當(dāng)miRNA的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA分子而發(fā)揮作用,研究表明miR-16-5p在脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷中下調(diào)表達(dá),上調(diào)其表達(dá)可減輕肺上皮細(xì)胞損傷〔16〕。上調(diào)miR-16-5p表達(dá)可促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖并阻滯細(xì)胞凋亡〔17〕。miR-16-5p可通過(guò)調(diào)控人牙齦上皮細(xì)胞增殖及凋亡而參與牙周炎進(jìn)展〔18〕。本研究提示miR-16-5p過(guò)表達(dá)可減輕PD模型細(xì)胞損傷,可能是通過(guò)增強(qiáng)MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞抗氧化能力而抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。本研究推測(cè)circTLK1可能通過(guò)充當(dāng)miR-16-5p的海綿分子而促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。本研究提示下調(diào)miR-16-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾circTLK1表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的作用。