王維玉，陳文嬌，盧澄生，覃思思，朱 敏，韋建華，陳明偉

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化、抗氧化平衡狀態(tài)被打破，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)自由基大量積累、炎細(xì)胞浸潤、蛋白酶分泌及氧化中間產(chǎn)物產(chǎn)生過量，引起細(xì)胞損傷及凋亡的一種不良反應(yīng)，并可進(jìn)一步誘發(fā)機(jī)體衰老以及癌癥、老年癡呆癥、帕金森病、糖尿病等各種疾病的產(chǎn)生［1-2］。抗氧化物質(zhì)能夠清除過量自由基從而發(fā)生抗氧化作用，但由于合成抗氧化劑具有一定毒副作用，在食品、醫(yī)療保健和化妝品生產(chǎn)使用上有一定的限制，因此，從天然產(chǎn)物中尋找安全、有效、無副作用的天然抗氧化劑成為近年來研究熱點［3-5］。黃酮類化合物是一類存在于自然界的具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，研究表明，黃酮類化合物可通過清除自由基、抑制與活性氧（reactive oxygen species，ROS）相關(guān)酶的產(chǎn)生以及促進(jìn)細(xì)胞分泌抗氧化劑介質(zhì)（如谷胱甘肽和維生素E）來減少氧化應(yīng)激，延緩組織和器官衰老［6］。

多裂黃檀（Dalbergia rimosaRoxb.）來源于豆科黃檀屬植物多裂黃檀的干燥根，廣西各地均有分布，壯藥名為Gengpeng（更彭）、Meikouwai（美扣外），具有調(diào)龍路、除濕毒、消腫痛的作用，可用于治療頭痛、癰瘡、疔瘡等［7-8］。目前，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多裂黃檀與降香黃檀具有相當(dāng)高的親緣關(guān)系，并且二者揮發(fā)性成分相似度極高［9-10］。黃檀屬作為一個重要的藥用資源，在我國具有悠久的藥用歷史，化學(xué)成分研究表明該屬植物含有大量黃酮、二氫黃酮、異黃酮、異黃烷、新黃酮等黃酮類成分［11-12］。本文采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定多裂黃檀不同極性部位總黃酮的含量，采用DPPH、ABTS 自由基清除法和FRAP 法測定其自由基清除能力和總抗氧化能力，對多裂黃檀抗氧化活性部位進(jìn)行篩選，以期為該植物中抗氧化活性化學(xué)成分的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑 多裂黃檀藥材于2020年11月采自廣西南寧市大明山，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)廖月葵高級實驗師鑒定為豆科黃檀屬植物多裂黃檀Dalbergia rimosaRoxb.的干燥根莖，樣品標(biāo)本（No.20201112）存放于廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)實驗室。蘆丁對照品（純度≥98%，中國藥品生物制品檢定所）；L-抗壞血酸（VC，純度＞99%，上海麥克林生化科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH，純度＞98%，美國Sigma-Aldrich 公司）；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，純度＞99%，美國Sigma-Aldrich 公司）；2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ，純度＞99%，上海麥克林生化科技有限公司）；無水乙酸鈉（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；硝酸鋁（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；冰乙酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水三氯化鐵、七水合物硫酸亞鐵（上海麥克林生化科技有限公司）；其他試劑均為分析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器 TECAN Infinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）；UV-1800C 型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；LABCONCO 冷凍干燥機(jī)（美國Labconco 公司）；BSA224S-CW 電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；HWS-24電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；pHB-1 筆型酸度計（上海世諾物理光學(xué)儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 樣品提取與制備 稱取1.0 kg 多裂黃檀粗粉，用10倍量80%乙醇回流提取2 h，過濾，濾渣再分別提取1.5 h、1 h，合并3 次濾液，減壓濃縮，得多裂黃檀醇提物浸膏53.2 g。取10.0 g 多裂黃檀醇提物浸膏進(jìn)行冷凍干燥，得到醇提物干樣品。余下的43.2 g 醇提物浸膏加入一定量蒸餾水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取至顏色較淺或近無色，收集萃取液，分別減壓濃縮得到石油醚部位浸膏0.8 g、乙酸乙酯部位浸膏3.9 g、正丁醇部位浸膏10.9 g 及水部位浸膏16.7 g，將浸膏進(jìn)行冷凍干燥，得到各極性部位干樣品。

2.2 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法［13］測定多裂黃檀不同極性部位的總黃酮含量。精確吸取0.5 mg/ml 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml，置于10 ml容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 ml，搖勻，靜置6 min；加入10%的硝酸鋁溶液0.3 ml，搖勻，靜置6 min；加入4%的氫氧化鈉溶液4 ml，最后用無水甲醇定容至刻度，搖勻，靜置10 min，以無水甲醇為空白對照，在400～800 nm波長范圍掃描，確定其最大吸收波長為502 nm。在波長502 nm 處測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液吸光度，得到蘆丁質(zhì)量濃度（X）與吸光度值（Y）的回歸方程：Y=1.113 7X+0.000 9（R2=0.999 8），表明蘆丁質(zhì)量濃度在0.025～0.5 mg/ml 間線性關(guān)系良好。取各樣品溶液（質(zhì)量濃度為1.0 mg/ml）1 ml，以不加樣品的相同溶劑為空白對照，相同條件下測定各樣品溶液的吸光度，根據(jù)回歸方程計算各樣品中的總黃酮濃度（C1），并根據(jù)樣品初始濃度（C2）計算出樣品中總黃酮的含量?？傸S酮含量（%）=（C1/C2）×100%。

2.3 抗氧化活性的測定

2.3.1 清除DPPH自由基能力的測定 參考文獻(xiàn)［14］的測定方法稍作調(diào)整，分別精密吸取20 μl 多裂黃檀不同極性部位樣品溶液，置于96 孔板中，分別加入0.10 mmol/L DPPH 工作液200 μl，混勻，避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm 處測定其吸光度（A1）。以不加樣品的相同溶劑為空白對照（A0），抗壞血酸（VC）作為陽性對照，每個濃度平行測定3 次后取平均值，計算樣品對DPPH 自由基的清除率。自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100%。

2.3.2 清除ABTS 自由基能力的測定 參考文獻(xiàn)［15］的測定方法稍作調(diào)整，將2.45 mmol/L 過硫酸鉀與7.4 mmol/L ABTS 溶液按體積比1∶1 混合均勻后，室溫下避光過夜放置24 h，用無水乙醇稀釋至其吸光度在734 nm 下測得為（0.70±0.02），即得到ABTS 工作液。分別精密吸取20 μl 多裂黃檀不同極性部位樣品溶液，置于96 孔板中，分別加入ABTS 工作液200 μl，混勻，避光反應(yīng)30 min，在波長734 nm 處測定其吸光度（A1）。以不加樣品的相同溶劑為空白對照（A0），VC作為陽性對照，每個濃度平行測定3次后取平均值，根據(jù)公式計算樣品對ABTS 自由基的清除率。自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100%。

2.3.3 總抗氧化能力的測定 參考文獻(xiàn)［16-17］的測定方法，將0.3 mmol/L 醋酸緩沖溶液（pH3.6）、20 mmol/L FeCl3溶液、10 mmol/L TPTZ溶液按照10∶1∶1配制成FRAP 工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。精密吸取20 μl不同濃度FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于96 孔板中，加入37 ℃預(yù)熱的FRAP 工作液200 μl，混勻，37 ℃水浴避光反應(yīng)10 min，以蒸餾水作空白對照，于593 nm 處測定吸光度，得FeSO4濃度（X）與吸光度值（Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=1.055 9X-0.001 2（R2=0.999 9），表明FeSO4在質(zhì)量濃度為0.1～1.6 mmol/L 內(nèi)線性關(guān)系良好。以各樣品溶液代替FeSO4溶液，相同條件下測定各樣品溶液的吸光度，以VC 作為陽性對照，不加樣品的相同溶劑為空白對照，每個濃度平行測定3 次后取平均值。根據(jù)各樣品反應(yīng)后的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)FeSO4的濃度與其相應(yīng)濃度的比值（mmol/g）來表示樣品的總抗氧化能力。

2.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為有顯著性差異。采用Excel 2016、GraphPad Prism 9 以及Origin 2017 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖、計算半數(shù)清除濃度（IC50），并使用Pearson 軟件對多裂黃檀不同極性部位總黃酮含量與抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析。

3 結(jié) 果

3.1 多裂黃檀不同極性部位總黃酮含量比較 見表1。

表1 多裂黃檀不同極性部位總黃酮含量比較

由表1 可知，多裂黃檀各極性部位總黃酮含量為4.28%～36.44%，其中乙酸乙酯部位總黃酮含量最高［（36.44±0.26）%］，不同極性部位總黃酮含量由高到低依次為乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞醇提物＞水部位＞石油醚部位。結(jié)果表明，多裂黃檀中黃酮類物質(zhì)多集中在乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

3.2 抗氧化活性的測定

3.2.1 多裂黃檀不同極性部位對DPPH 和ABTS 自由基的清除能力 見圖1、圖2、表2。

圖1 多裂黃檀不同極性部位不同濃度對DPPH自由基的清除能力

圖2 多裂黃檀不同極性部位不同濃度對ABTS自由基的清除能力

表2 多裂黃檀不同極性部位對DPPH和ABTS自由基的半數(shù)清除濃度比較（mg/ml，）

表2 多裂黃檀不同極性部位對DPPH和ABTS自由基的半數(shù)清除濃度比較（mg/ml，）

樣 品醇提物石油醚部位乙酸乙酯部位正丁醇部位水部位VC n3 3 3 3 3 3清除DPPH自由基的IC50 0.492 5±0.009 3 2.848 7±0.140 9 0.377 7±0.007 2 0.431 3±0.124 0 0.732 2±0.009 9 0.078 6±0.000 2清除ABTS自由基的IC50 0.071 7±0.001 0 0.797 7±0.033 2 0.066 9±0.000 7 0.092 5±0.000 9 0.089 1±0.000 5 0.057 9±0.001 0

由圖1、圖2 和表2 可知，多裂黃檀不同極性部位對DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率隨著各樣品濃度的增加而增大，具有一定的量效關(guān)系。對DPPH自由基的清除作用，以乙酸乙酯部位的清除能力最強(qiáng)，IC50為（0.377 7±0.007 2）mg/ml，余依次為正丁醇部位、醇提物、水部位、石油醚部位，與總黃酮含量趨勢變化一致。對ABTS自由基的清除作用，以乙酸乙酯部位的清除能力最強(qiáng)，IC50為（0.066 9±0.000 7）mg/ml，余依次為醇提物、水部位、正丁醇部位、石油醚部位，且乙酸乙酯部位、醇提物、水部位和正丁醇部位的清除能力接近于陽性對照藥VC。

3.2.2 總抗氧化能力的測定 見表3。

表3 多裂黃檀不同極性部位的總抗氧化能力 （mmol/g，）

表3 多裂黃檀不同極性部位的總抗氧化能力 （mmol/g，）

樣 品醇提物石油醚部位乙酸乙酯部位正丁醇部位水部位VC n3 3 3 3 3 3總抗氧化能力（FPAP）1.042 5±0.018 0 0.241 0±0.002 0 1.594 5±0.012 0 1.254 5±0.004 0 0.889 5±0.001 0 8.010 0±0.170 0

表3 結(jié)果顯示，多裂黃檀乙酸乙酯部位總抗氧化能力最強(qiáng)，F(xiàn)RAP 值為（1.594 5±0.012 0）mmol/g；各極性部位總抗氧化能力由高到低依次為：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞醇提物＞水部位＞石油醚部位，與總黃酮含量趨勢一致。

3.2.3 抗氧化活性與總黃酮含量的相關(guān)性分析 見表4。

表4 多裂黃檀不同極性部位總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

由表4 可知，多裂黃檀不同極性部位總黃酮含量與DPPH、ABTS 自由基清除能力呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性，即總黃酮含量越高，其對應(yīng)IC50越低，抗氧化效果越好，相關(guān)系數(shù)均＞0.72，但均無顯著性差異（P＞0.05）。不同極性部位部位總黃酮含量與總抗氧化能力（FRAP 值）相關(guān)系數(shù)為0.944 0，并且存在顯著性差異（P＜0.05）。

4 討 論

大量研究表明，黃酮類化合物具有較好的抗氧化作用，近年來，尋找安全又天然的生物抗氧化劑是研究熱點，總黃酮是公認(rèn)的與抗氧化活性密切相關(guān)的天然化學(xué)成分［18］。本實驗研究結(jié)果顯示，多裂黃檀中黃酮類物質(zhì)多集中于乙酸乙酯部位和正丁醇部位，使用不同極性溶劑可以實現(xiàn)對多裂黃檀黃酮類成分的有效富集。同時，采用DPPH 法、ABTS 法、FRAP 法對多裂黃檀不同極性部位的體外抗氧化能力進(jìn)行評價，其中乙酸乙酯部位、正丁醇部位表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。相關(guān)性分析顯示，多裂黃檀不同極性部位的總抗氧化能力和黃酮含量存在正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.9440，黃酮含量越高，抗氧化能力也越強(qiáng)，由此推測黃酮類物質(zhì)可能是多裂黃檀抗氧化的主要成分之一，乙酸乙酯部位和正丁醇部位為多裂黃檀的主要活性部位。此外，多裂黃檀不同極性部位在三個抗氧化性試驗結(jié)果并不完全一致，原因可能與抗氧化反應(yīng)的檢測方法、作用機(jī)制不同有關(guān)［19］。

目前，國內(nèi)外關(guān)于多裂黃檀化學(xué)成分及藥理作用的研究較少，本實驗表明乙酸乙酯部位和正丁醇部位為多裂黃檀抗氧化的主要活性部位，可為多裂黃檀進(jìn)一步篩選具體的活性單體成分，明確抗氧化活性成分提供參考。