原平利,劉 剛,馬蘭香,任 鋒,胡建庫(kù),黃 輝,寇 進(jìn)*

(1武警陜西總隊(duì)醫(yī)院心胸科,西安 710054;2西安市長(zhǎng)安醫(yī)院急診科;3武警陜西總隊(duì)醫(yī)院心內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:koujin0423@126.com)

急性心肌梗死是由動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈閉塞和血流中斷,引發(fā)心肌缺血和局部壞死的心血管疾病,也是心源性死亡的主要原因之一[1,2]。溶栓治療或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療可減小急性心肌梗死引起的心臟損傷,但缺血再灌注過(guò)程可進(jìn)一步加重心肌損傷,即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI),減輕MIRI是提高急性心肌梗死患者存活率的關(guān)鍵[3,4]。目前,細(xì)胞焦亡在MIRI發(fā)病機(jī)制中的作用引起了廣大學(xué)者的關(guān)注。細(xì)胞焦亡是一種以細(xì)胞腫脹破裂并釋放炎性細(xì)胞因子為特征的新型細(xì)胞死亡形式[5]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3(NLR family pyrin domain containing 3,NLRP3)是一個(gè)先天免疫系統(tǒng)的重要組分,NLRP3通過(guò)與Caspase-1和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)組成NLRP3炎癥體并介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[6,7]。作為先天免疫系統(tǒng)的一個(gè)組分,NLRP3充當(dāng)識(shí)別損傷相關(guān)分子模式(damage-related mole-cular patterns,DAMP)的模式識(shí)別受體[8]。MIRI發(fā)生后,局部釋放的DAMP導(dǎo)致NLRP3炎癥體的啟動(dòng)和觸發(fā),并通過(guò)激活Caspase-1放大炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[9]。多項(xiàng)文獻(xiàn)證實(shí)抑制NLRP3炎癥體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是減輕MIRI的重要手段之一[10-12]。

石斛是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴中草藥,在治療心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病方面具有藥用價(jià)值[13-15]。毛蘭素(erianin,ERI)是石斛中發(fā)現(xiàn)的主要聯(lián)芐類(lèi)化合物,分子式:C18H22O5。毛蘭素具有明顯的抗癌、抗炎、抗氧化、減輕糖尿病性視網(wǎng)膜病變等活性[16,17]。最新研究表明,毛蘭素是一種具有顯著抗炎活性的NLRP3抑制劑[18]。然而,目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道毛蘭素在治療心血管疾病中的潛在價(jià)值。因此,本研究旨在探討毛蘭素對(duì)MIRI大鼠的治療作用,并分析其對(duì)NLRP3炎癥體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 毛蘭素(PHL83499,純度:≥95.0% HPLC)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,D2650)均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。TTC染液(D025-1-3)、蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染液(D006-1-4)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)試劑盒(E019-1-1),均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。TRIzol試劑(15596-018),購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Science公司。FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(KR118),購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司。SYBR Green Master Kit(QPK-201),購(gòu)于日本TOYOBO公司。NLRP3一抗(AF2155),購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。ASC一抗(ab151700)、GAPDH一抗(ab8245)、HRP標(biāo)記的二抗(ab6721),均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。cleaved Caspase-1一抗(89332)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β一抗(12703)、IL-18一抗(67775),均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

ALC-V8S-622雙通道自動(dòng)小動(dòng)物呼吸機(jī),購(gòu)于上海奧爾科特生物科技有限公司。VEVO 3100小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng),購(gòu)于加拿大VisualSonics公司。IX73倒置顯微鏡,購(gòu)于日本奧林巴斯公司。BS-600型全自動(dòng)生化分析儀,購(gòu)于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。NanoDrop2000分光光度計(jì),購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher Science公司。CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng),購(gòu)于美國(guó)BIO-RAD公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～7周齡無(wú)特定病原體級(jí)SD雄性大鼠(220～260 g)購(gòu)自陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)生物制品有限公司【生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(陜)2018-001】。大鼠在12 h光暗交替照明的屏障環(huán)境中飼養(yǎng),溫度為(23±2)℃,濕度為(55±5)%。所有大鼠均預(yù)適應(yīng)飼養(yǎng)1周,然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組處理及MIRI建模 100只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、5 mg ERI組、10 mg ERI組和20 mg ERI組,每組20只。假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃1% DMSO,5 mg ERI組、10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠分別灌胃5,10,20 mg/(kg·d)的毛蘭素(DMSO溶解,然后用生理鹽水稀釋至1% DMSO),共灌胃7 d。本研究應(yīng)用的毛蘭素劑量參考其他文獻(xiàn)報(bào)道,這3個(gè)劑量對(duì)大鼠無(wú)明顯毒性[17,18]。灌胃毛蘭素7 d后,參考文獻(xiàn)方法建立MIRI大鼠模型[19]。然后腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉,仰臥固定,氣管插管并連接呼吸機(jī)。在第3～4肋間隙開(kāi)胸暴露心臟,使用6-0結(jié)扎線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支30 min,當(dāng)觀察到心肌顏色發(fā)紺和心電圖ST段抬高時(shí)說(shuō)明缺血成功。然后剪開(kāi)結(jié)扎線再灌注120 min,當(dāng)觀察到缺血心肌顏色恢復(fù)和抬高的ST段降低50%以上時(shí)說(shuō)明再灌注成功。假手術(shù)組大鼠手術(shù)操作相同但不結(jié)扎左前降支。再灌注48 h后,剔除建模失敗和死亡的大鼠。最終,各組納入研究的大鼠數(shù)量分別是:假手術(shù)組18只,模型組18只,5 mg ERI組17只,10 mg ERI組16只,20 mg ERI組17只。

1.2.2 大鼠心功能參數(shù)測(cè)定 再灌注48 h后,超聲檢測(cè)各組大鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic inner diameter,LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic inner diameter,LVIDs)和左室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.3 大鼠心肌損傷標(biāo)志物測(cè)定 再灌注48 h后,對(duì)各組大鼠腹主動(dòng)脈采血,低溫離心(4 ℃,3 000 r/min,15 min,離心半徑6 cm)取上層血清。采用生化分析儀檢測(cè)肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB,CK-MB)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平;采用ELISA法檢測(cè)cTnI水平。

1.2.4 大鼠心肌梗死面積測(cè)定 再灌注48 h后,對(duì)各組大鼠實(shí)施安樂(lè)死,無(wú)菌屏障環(huán)境下分離大鼠心臟,-20 ℃冷凍30 min。然后切成1 mm厚的心肌切片,將心肌切片在1%的TTC中37 ℃孵育15 min,然后4%多聚甲醛固定24 h,數(shù)碼相機(jī)拍攝照片,Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算大鼠心肌梗死面積百分比。

1.2.5 大鼠心肌組織HE染色 4%多聚甲醛固定大鼠心臟組織48 h,石蠟包埋并制作5 μm厚切片。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色,并在顯微鏡下觀察圖像。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞焦亡相關(guān)基因(NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18)轉(zhuǎn)錄水平 采用TRIzol試劑提取各組大鼠心肌組織的總RNA,并用NanoDrop2000分光光度計(jì)進(jìn)行定量。使用FastKing一步法基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用SYBR Green Master Kit在CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:95 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參基因,并對(duì)目的基因的表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白(NLRP3、cleaved Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18)表達(dá)水平 使用RIPA裂解液提取各組大鼠心肌組織總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,12% SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,然后室溫下用5%胎牛血清封閉1 h。將膜與NLRP3(1∶5 000稀釋)、cleaved Caspase-1(1∶5 000稀釋)、ASC(1∶5 000稀釋)、IL-1β(1∶3 000稀釋)、IL-18(1∶3 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)一抗4 ℃孵育過(guò)夜。GAPDH作為內(nèi)參蛋白。第2天將膜與HRP標(biāo)記的IgG二抗(1∶5 000稀釋)在37 ℃下孵育1 h。ECL顯色發(fā)光,Image Lab軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)組間差異采用單因素方差分析和LSD事后檢驗(yàn)進(jìn)行分析。顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 毛蘭素對(duì)MIRI大鼠心功能的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠的LVEF和LVFS降低,LVIDd和LVIDs升高(均P<0.05)。與模型組比較,5 mg ERI組、10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠的LVEF和LVFS升高,LVIDd和LVIDs降低(均P<0.05)。與5 mg ERI組比較,20 mg ERI組大鼠的LVEF和LVFS升高,LVIDd和LVIDs降低(均P<0.05,見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠的LVEF、LVIDd、LVIDs和LVFS比較

2.2 毛蘭素對(duì)MIRI大鼠心肌損傷標(biāo)志物的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠的血清中CK-MB、LDH和cTnI水平均升高(P<0.05)。與模型組比較,5 mg ERI組、10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠的血清中CK-MB、LDH和cTnI水平均降低(P<0.05)。與5 mg ERI組比較,10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠的血清中CK-MB、LDH和cTnI水平均降低(P<0.05,見(jiàn)表3)。

表3 各組大鼠的血清CK-MB、LDH和cTnI水平比較

2.3 毛蘭素對(duì)MIRI大鼠心肌梗死面積和心肌形態(tài)的影響

各組大鼠的心肌梗死面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=782.797,P<0.001,見(jiàn)圖1)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠的心肌梗死(白色區(qū)域)面積升高(P<0.05);與模型組比較,5 mg ERI組、10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠的心肌梗死面積降低(P<0.05);與5 mg ERI組比較,10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠的心肌梗死面積降低(P<0.05,見(jiàn)圖1)。HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組心肌形態(tài)正常;模型組大鼠心肌排列不規(guī)整,心肌纖維斷裂,胞漿空泡化,出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與模型組比較,5 mg ERI組、10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠的心肌形態(tài)明顯改善(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠心肌組織TTC染色和HE染色結(jié)果

2.4 毛蘭素對(duì)MIRI大鼠心肌組織NLRP3炎癥體通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18的mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,5 mg ERI組、10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18的mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05);與5 mg ERI組比較,10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18的mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05,見(jiàn)圖2)。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與5 mg ERI組比較,&P<0.05;與10 mg ERI組比較,△P<0.05

2.5 毛蘭素對(duì)MIRI大鼠心肌組織NLRP3炎癥體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織中NLRP3、cleaved Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與模型組比較,5 mg ERI組、10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠心肌組織中NLRP3、cleaved Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05);與5 mg ERI組比較,10 mg ERI組和20 mg ERI組大鼠心肌組織中NLRP3、cleaved Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05,見(jiàn)圖3)。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與5 mg ERI組比較,&P<0.05;與10 mg ERI組比較,△P<0.05

3 討論

目前,石斛類(lèi)中藥治療心肌梗死等心血管疾病方面已取得良好的療效[13-15]。毛蘭素是石斛中的主要化學(xué)成分之一,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗感染、抗病毒等多種活性,并且對(duì)人體無(wú)明顯的毒副作用[20]。本研究考察了不同劑量的毛蘭素(5,10,20 mg/(kg·d))預(yù)先給藥1周對(duì)MIRI大鼠的保護(hù)作用,結(jié)果顯示,毛蘭素劑量依賴(lài)性地升高了MIRI大鼠的LVEF和LVFS,降低了LVIDd、LVIDs、心肌梗死面積、血清心肌損傷標(biāo)志物(CK-MB、LDH和cTnI)水平。提示毛蘭素可改善MIRI大鼠的心功能,減輕心肌損傷。

NLRP3炎癥體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在MIRI發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[6,7]。細(xì)胞焦亡是一種炎性程序性細(xì)胞死亡形式,依賴(lài)于NLRP3炎癥體的激活[5]。MIRI發(fā)生后,DAMP被釋放并激活NLRP3,然后,NLRP3與Caspase-1和ASC形成NLRP3炎癥體[21]。NLRP3炎癥體的組裝導(dǎo)致Caspase-1的激活,激活的Caspase-1促進(jìn)pro-IL-1β和pro-IL-18的切割并產(chǎn)生成熟的、有功能的IL-1β和IL-18[22],進(jìn)一步加重MIRI中的細(xì)胞溶解和非細(xì)菌性炎癥[23]。抑制NLRP3炎癥體是減輕MIRI并改善心功能的有效途徑[7]。本研究結(jié)果表明,毛蘭素劑量依賴(lài)性地抑制了MIRI大鼠心肌組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18的轉(zhuǎn)錄以及NLRP3、cleaved Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá),有效抑制了NLRP3炎癥體的激活和細(xì)胞焦亡。Zhang等[18]報(bào)道,毛蘭素以劑量依賴(lài)的方式抑制骨髓巨噬細(xì)胞中Caspase-1的裂解、IL-1β和IL-18的分泌,并且對(duì)微晶型尿酸鈉誘導(dǎo)的小鼠IL-1β、IL-18的產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞的遷移具有抑制作用,毛蘭素介導(dǎo)的抑制IL-1β和IL-18分泌的作用可被NLRP3、ASC和Caspase-1的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)。本研究推測(cè)毛蘭素抑制NLRP3炎癥體的激活可能是其防治MIRI的機(jī)制之一。因?yàn)?毛蘭素與NLRP3具有特異地直接相互作用,毛蘭素通過(guò)與NLRP3的Nacht結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而抑制NLRP3的寡聚和ATPase功能,進(jìn)而防止NLRP3炎癥體的形成和激活[18]。

近年來(lái),多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)毛蘭素能夠誘導(dǎo)不同的細(xì)胞程序性死亡途徑。例如,毛蘭素通過(guò)鈣/鈣調(diào)素依賴(lài)性鐵死亡途徑抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[16]。毛蘭素通過(guò)失活核因子E2相關(guān)因子2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)誘導(dǎo)鐵死亡并抑制膀胱癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)[24]。毛蘭素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在多種癌癥中發(fā)揮抗癌作用[25,26]。上述這些研究主要集中在毛蘭素的抗癌作用方面,由于腫瘤微環(huán)境與正常細(xì)胞微環(huán)境完全不同,毛蘭素對(duì)這些細(xì)胞程序性死亡途徑的誘導(dǎo)作用可能與疾病類(lèi)型和微環(huán)境有關(guān),提示毛蘭素可能具有一定的腫瘤靶向性。在本研究中,毛蘭素抑制了MIRI大鼠心肌細(xì)胞焦亡,細(xì)胞焦亡是一種炎癥依賴(lài)性細(xì)胞程序性死亡途徑,因此,毛蘭素對(duì)細(xì)胞焦亡的抑制作用與其抗炎作用密切相關(guān)。毛蘭素具有包括抗炎和抗氧化等多種藥理活性[17,27,28],然而,毛蘭素的功效研究主要集中在抗癌方面,在其他疾病中的研究較少,仍然需要進(jìn)一步揭示其潛在的藥理活性。

綜上所述,本研究表明毛蘭素預(yù)處理可改善MIRI大鼠的心功能并減輕心肌損傷,毛蘭素可能通過(guò)抑制NLRP3炎癥體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡防治MIRI。總之,本研究首次發(fā)現(xiàn)毛蘭素在防治MIRI方面的潛力,毛蘭素可能是石斛治療心血管疾病的主要功能成分之一。