吳憶春，苗立中

（1.濱州職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東 濱州 256603；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum, Apg）是雞傳染性鼻炎的病原菌，可引起雞上呼吸道感染，導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋率下降和育成雞死淘率增加，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。Page 采用玻片凝集法將副雞禽桿菌分為A、B、C 三種血清型[2]。Blackall 等采用血凝抑制方法（HI）把A 型和C型分為4 個(gè)亞型（A1~A4，C1~C4）[3]。該病在全世界廣泛流行。我國首例雞傳染性鼻炎報(bào)道于1987 年，分離于北京某養(yǎng)殖場，鑒定為A 型副雞禽桿菌[4]；林毅等在1995 年分離到C 型副雞禽桿菌[5]；2002 年以后陸續(xù)有分離到B 型副雞禽桿菌的報(bào)道[6-7]。

2022 年11 月份山東某蛋雞養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的蛋雞接連出現(xiàn)疑似感染傳染性鼻炎的癥狀，如顏面腫脹、鼻腔和鼻竇有漿液性分泌物等。經(jīng)問診了解，該批次蛋雞發(fā)病前1 個(gè)月剛接種雞傳染性鼻炎A 型滅活疫苗。為了查找免疫失敗原因，通過對(duì)病雞剖檢、細(xì)菌分離、PCR 鑒定、血清分型，對(duì)分離菌株進(jìn)行了初步鑒定。此外，選擇了編碼免疫保護(hù)相關(guān)血凝蛋白基因的HMTp210 基因高變異Region 2 進(jìn)行了測序分析，確診該蛋雞場雞群發(fā)病為C 型副雞禽桿菌感染引起。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

副雞禽桿菌培養(yǎng)基購買自北京海天生物科技有限公司，雞血清購買自天津康源生物，輔酶購買自上海源葉生物，引物合成自上海生工，副雞禽桿菌A、B、C 陽性血清和副雞禽桿菌A、B、C 標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所?；蚪M提取試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司。Genstar 2×Taq mix 購自康潤生物。

1.2 細(xì)菌分離

無菌剪開發(fā)病雞的眶下竇，用接種環(huán)蘸取眶下竇內(nèi)容物，在含有NAD 的血清瓊脂平板上劃線，于蠟燭罐中厭氧培養(yǎng)24~48 h。挑取單個(gè)可疑菌落接種到含有NAD 的血清瓊脂平板上，進(jìn)行純培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3 PCR 鑒定

取純化的菌株液體培養(yǎng)物，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組，作為PCR 模板。參照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)》（NY/T538-2015 ）設(shè)計(jì)、合成引物，引物序列如下：

反應(yīng)體系：2×Taq mix 12.5 μL，A-F（10 μmol/L）1 μL，A-R（10 μmol/L）1 μL，模板1 μL，無菌去離子水10.5 μL，總體積為25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)熱5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠檢測，在凝膠成像系統(tǒng)觀察是否有500 bp 大小的目的條帶出現(xiàn)。

1.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

用60 日齡SPF 雞6 只，置于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)，其中4 只在眶下竇內(nèi)注射分離菌株液體培養(yǎng)物，0.2 mL/只，含菌量為1.5×105CFU/0.2 mL，剪翅作為標(biāo)記；其余2 只雞在眶下竇注射液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，置另一隔離器飼養(yǎng)。觀察14 日，記錄發(fā)病情況，并再次取鼻竇分泌物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.5 血清型鑒定

具體方法參照NY/T538-2015 的血凝抑制試驗(yàn)（鑒定副雞禽桿菌血清型）部分。如被檢抗原與某型陽性血清的HI 效價(jià)最高，則判定該抗原為該血清型。

1.6 HMTp210 基因Region 2 序列測序

采用Ryuichi 等[8]設(shè)計(jì)的一對(duì)擴(kuò)增HMTp210基因高變異2 區(qū)的引物，引物序列如下：

反應(yīng)體系：2× ExTaq mix 25 μL, H-F（10 μmol/L）1 μL，H-R（10 μmol/L）1 μL，模板1 μL，無菌去離子水22 μL，總體積為50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 預(yù)熱1 min，98 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，回收產(chǎn)物送上海生工測序。Blast 搜索GenBank 中的同源序列，采用分析軟件MegAlign中的Clustal W 方法進(jìn)行序列比較分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

在含有NAD 的血清瓊脂平板上，生長出無色細(xì)小菌落，菌落濕潤、光滑、邊緣整齊。革蘭氏染色觀察呈陰性小桿菌，細(xì)菌均勻分散排列；分離菌株命名為SD-2022。

2.2 PCR 結(jié)果

PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，分離的菌株與陽性對(duì)照均在500 bp 左右有特異性目的條帶（圖1），與預(yù)期大小一致，推測分離到的菌株為副雞禽桿菌。

圖1 副雞嗜血桿菌PCR鑒定結(jié)果（詳見附錄彩圖）

2.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)眶下竇注射分離菌株SD-2022 菌液的4 只SPF 雞在24~72 h 內(nèi)均出現(xiàn)眶下竇及面部水腫、食欲減退、呼吸困難等典型的雞傳染性鼻炎臨床癥狀；對(duì)照組未有明顯的臨床癥狀。取發(fā)病雞鼻竇分泌物進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)培養(yǎng)形態(tài)觀察、革蘭氏染色鏡檢結(jié)果、PCR 檢測結(jié)果綜合判斷該分離菌為副雞禽桿菌。

2.4 血清型鑒定結(jié)果

血清型鑒定結(jié)果如表1 所示。根據(jù)血凝抑制試驗(yàn)，分離株SD-2022 抗原與C 型陽性血清具有最高的血凝抑制效價(jià)，可判定分離株的血清型為C 型。值得注意的是，分離菌株SD-2022 的抗原與A 型血清也具有血凝效價(jià)，說明分離菌株SD-2022 抗原與A 型菌株血清具有交叉反應(yīng)。

表1 分離株SD-2022 的抗原鑒定結(jié)果

2.5 HMTp210 基因Region 2 測序結(jié)果分析

副雞禽桿菌HMTp210 基因Region 2 測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增SD-2022 菌株的HMTp210 基因Region 2 序列長為1 689 bp。所得序列在GenBank中BLAST CBI 數(shù)據(jù)庫與已發(fā)表的副雞禽桿菌HMTp210 基因2 區(qū)序列進(jìn)行同源性比較，在所得的83 個(gè)檢索結(jié)果中，選取已知血清型的副雞禽桿菌菌株，從GenBank 上下載其HMTp210 基因2區(qū)序列，用MegAlign軟件中的Clustal W方法分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）和同源率圖譜（圖3）。結(jié)果可知，分離菌株SD-2022 與CP113955.1-CChina C 型副雞禽桿菌HMTp210 基因Region 2 序列同源性最高，為99.8%；與TW07、TW94C 型分離株H18 株同源性較低，為87%左右。分離菌株SD-2022 與國內(nèi)A 型和B 型副雞禽桿菌分離株HMTp210 基因Region 2 序列同源率為90.4%。

圖3 SD-2022菌株與Genbank中其他27種副雞禽桿菌的同源率圖譜

3 討論

近幾年來，隨著國家對(duì)飼料禁抗、蛋雞產(chǎn)蛋期禁抗政策實(shí)施以來，雞傳染性鼻炎的發(fā)生和流行呈上升趨勢，養(yǎng)殖場雖然加強(qiáng)了雞傳染性鼻炎疫苗的免疫預(yù)防，但國內(nèi)很多蛋雞場仍發(fā)生雞傳染性鼻炎免疫失敗的事件，給養(yǎng)殖戶造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。

HMTp210 基因是編碼副雞禽桿菌外膜蛋白的一段基因序列，被認(rèn)為是A 型和C 型Apg 主要的保護(hù)性抗原基因和致病性基因[10]。其中Region 1和Region3 基因序列在Apg 血清A 型和C 型之間高度保守，高變區(qū)Region 2 的基因序列在Apg 血清A 型和C 型之間差異較大，具有一定的血清型特異性[11]。為了分析該蛋雞養(yǎng)殖場致病菌株與常見流行株保護(hù)性抗原差異，本文對(duì)HMTp210 基因Region 2 序列進(jìn)行了擴(kuò)增測序、Blast 比對(duì)。結(jié)果分析顯示，分離株SD-2022 與CP113955.1-C-China C 型流行株主要保護(hù)性抗原同源率高達(dá)99.8%，與TW07、TW94 等C 型流行株同源性為87%左右，與國內(nèi)A 型、B 型流行株的同源率也較低。有文獻(xiàn)報(bào)道，副雞禽桿菌4 種A 型血清型（A1~A4）之間具有很好的交叉免疫保護(hù)，但4種C 型血清亞型（C1~C4）之間免疫交叉保護(hù)效果有限，同時(shí)A 型、B 型和C 型不同血清型之間交叉免疫保護(hù)效果不盡人意[12]。限于條件限制，本次試驗(yàn)未能對(duì)SD-2022 分離株進(jìn)一步進(jìn)行C 型（C1-C4）亞型分型。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該蛋雞場只免疫了雞傳染性鼻炎A 型滅活疫苗，不能對(duì)C 型副雞禽桿菌產(chǎn)生很好保護(hù)，這可能是該蛋雞場免疫失敗的主要原因。

雞傳染性鼻炎發(fā)生的原因是雞群未免疫或疫苗所含菌株與流行菌株血清型不對(duì)型造成的。因此，加強(qiáng)流行病學(xué)調(diào)查，篩選免疫原性好的疫苗菌株，研制含A 型、B 型、C 型的多價(jià)滅活疫苗或基因工程疫苗[13-14]是減少雞傳染性鼻炎發(fā)病的有效方法。下一步，將對(duì)SD-2022 菌株的毒力和免疫保護(hù)性試驗(yàn)開展工作。