王碧瑤,肖含先之,牛依琳,孫念慈,汪子鈴,王亞平,王 璐

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.干細(xì)胞與組織工程研究室、2.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,重慶 400016)

化療后貧血是臨床上常見(jiàn)的癥狀,尤其在癌癥患者中,貧血會(huì)導(dǎo)致幾乎每個(gè)器官的廣泛癥狀,其嚴(yán)重程度取決于貧血程度、發(fā)病速度和伴有的合并癥[1]。常用治療手段如輸血和注射重組促紅細(xì)胞生成素可導(dǎo)致鐵過(guò)載、高血壓、血液黏稠度升高、靜脈血栓等副作用[2-3]。因此,探尋化療后貧血的相關(guān)機(jī)制及科學(xué)有效的治療方案是亟待解決的問(wèn)題。

當(dāng)歸多糖(angelica sinensis polysaccharides,ASP)作為當(dāng)歸的有效成分,可促進(jìn)正常紅系發(fā)生,課題組既往研究表明ASP也可促進(jìn)化療藥物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)致傷小鼠的骨髓造血[4]。文獻(xiàn)報(bào)道,小鼠應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生與幼紅細(xì)胞島的形成以及島中央巨噬細(xì)胞的造血調(diào)控功能密切相關(guān),應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生的部位主要在髓外器官脾臟[5]。本研究采用5-FU建立小鼠化療后貧血模型,著重探討ASP對(duì)5-FU致?lián)p傷小鼠貧血的恢復(fù)作用,以及在應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中ASP調(diào)控幼紅細(xì)胞島中央巨噬細(xì)胞的機(jī)制,旨在為尋找治療化療后貧血的天然藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)6-8周齡C57BL/6J小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(20～22) g,由重慶市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)為SCXK (渝) 2012-0001,實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要藥品與試劑ASP購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司(批號(hào)為CYC81105,甘肅岷縣當(dāng)歸提取,純度≥98%,溶于生理鹽水);5-FU購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)為F6627-1G,純度≥98%,溶于生理鹽水);胎牛血清購(gòu)自中國(guó)依科賽生物公司;RPMI 1640培養(yǎng)基(11875-093)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;含EPO的BFU-E無(wú)血清甲基纖維素半固體培養(yǎng)基(M3436)購(gòu)自加拿大Stem Cell Technologies公司;SYBR green I(RR420L)和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A)均購(gòu)自日本TaKaRa生物技術(shù)有限公司;合成引物來(lái)自于上海生工生物股份有限公司;流式F4/80抗體(123107)購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。

1.3 儀器與設(shè)備超凈工作臺(tái)購(gòu)自中國(guó)蘇凈公司,病理切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司,光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司,全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自中國(guó)邁瑞公司,qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司,流式分析儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.4 方法

1.4.1小鼠模型建立與分組處理 SPF級(jí)6-8周齡C57BL/6J小鼠20只,隨機(jī)分為對(duì)照組、ASP組、5-FU組、ASP+5-FU組。參考文獻(xiàn)[6-7],按照課題組常規(guī)方式給藥[8]。對(duì)照組:小鼠連續(xù)腹腔注射生理鹽水(10 mL·kg-1) 10 d;ASP組:小鼠連續(xù)腹腔注射ASP(100 mg·kg-1) 10 d;5-FU組:小鼠腹腔注射5-FU (150 mg·kg-1),6 h后連續(xù)腹腔注射生理鹽水 (10 mL·kg-1) 10 d;ASP+5-FU組:小鼠腹腔注射5-FU(150 mg· kg-1),6 h后連續(xù)腹腔注射ASP (100 mg· kg-1) 10 d。每天記錄各組小鼠狀態(tài)和體質(zhì)量變化。

1.4.2小鼠外周血常規(guī)檢測(cè) 取小鼠眼眶血500 μL于EDTA抗凝管中,上下顛倒混勻后使用全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行外周血血液學(xué)檢測(cè)。

1.4.3骨髓單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù) 以頸椎脫臼法處死各組小鼠,浸泡于75%酒精中,持續(xù)5 min。無(wú)菌條件下取出股骨和脛骨,剔除多余脂肪及肌肉組織;預(yù)冷RPMI 1640培養(yǎng)基沖出全骨髓,1 500 r·min-1離心5 min。棄上清,紅細(xì)胞裂解液4 ℃孵育5 min,裂解紅細(xì)胞。1 500 r·min-1離心5 min,棄上清液,RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,緩慢加入細(xì)胞懸液至裝有6 mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管上層,2 000 r·min-1離心20 min,吸取中間白膜層細(xì)胞懸液,與同體積RPMI 1640培養(yǎng)基混勻后1 500 r·min-1離心5 min,棄上清液,得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。

1.4.4脾指數(shù)計(jì)算和脾細(xì)胞計(jì)數(shù) 以“1.4.3”方法處理小鼠。無(wú)菌條件下取出脾臟,小心去除附著在表面的肌肉和結(jié)締組織。稱脾臟質(zhì)量,脾指數(shù)以脾臟質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)代表。相機(jī)拍照記錄脾臟大小及形態(tài)。加入RPMI 1640培養(yǎng)基,注射器活塞研磨脾臟組織,200目篩網(wǎng)過(guò)濾。過(guò)濾液1 500 r·min-1離心5 min,棄上清液,收集脾細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。

1.4.5脾臟組織切片病理學(xué)觀察 4%多聚甲醛固定脾臟48 h,清水沖洗6 h。全自動(dòng)脫水儀過(guò)夜脫水,石蠟包埋機(jī)包埋,制備5 μm脾組織石蠟切片,65 ℃恒溫烤箱烘烤2 h后冷卻至室溫備用。將脾臟石蠟切片置于二甲苯中,60 ℃恒溫烤箱脫蠟2 h;將切片依次放入梯度乙醇溶液各2 min,PBS溶液水化2 min;蘇木精染色5 min,流水沖洗,1%鹽酸乙醇中分色1～3 s,蒸餾水洗凈;伊紅染液中染色5 min,蒸餾水清洗,依次放入梯度乙醇溶液,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫水透明2 min,中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照,ImageJ軟件計(jì)算脾紅髓面積百分比。

1.4.6爆氏紅系集落形成單位培養(yǎng)觀察及計(jì)數(shù) 分離獲取脾臟單個(gè)核細(xì)胞:5 mL紅細(xì)胞裂解液,4 ℃裂解“1.4.4”獲取的脾細(xì)胞,時(shí)間5 min,1 500 r·min-1離心5 min,棄上清;3 mL RPMI-1640培養(yǎng)基溶解細(xì)胞,緩慢置于6 mL淋巴細(xì)胞分離液上層,2 000 r·min-1離心20 min;轉(zhuǎn)動(dòng)吸取中間的白膜層,在白膜層中加入相同體積的RPMI-1640培養(yǎng)基,充分混勻,1 500 r·min-1離心5 min,調(diào)整細(xì)胞濃度為(1.5～5)×106L-1;每組吸取0.1 mL細(xì)胞懸液與1 mL BFU-E培養(yǎng)基混勻,接種于35 mm培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)10～14 d后于顯微鏡下觀察,BFU-E為50個(gè)細(xì)胞以上的集落,計(jì)數(shù)BFU-E數(shù)量。

1.4.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)F4/80+脾巨噬細(xì)胞數(shù)量 紅細(xì)胞裂解液裂解1.4.4獲取的脾細(xì)胞后,調(diào)整細(xì)胞濃度為106L-1。5% BSA 4 ℃封閉細(xì)胞30 min,1 500 r·min-1離心5 min,棄封閉液,按抗體說(shuō)明書標(biāo)注使用量加入抗體F4/80(FITC),4 ℃避光孵育30 min。PBS緩沖液洗滌3次后200 μL PBS重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾臟F4/80+細(xì)胞。

1.4.8qRT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞黏附、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、核吞功能 用TRIzol試劑(1 mL·100 g-1)提取脾臟總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明制備cDNA,SYBR II染料法進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。采用2-ΔΔCT方法定量計(jì)算巨噬細(xì)胞內(nèi)巨噬細(xì)胞-紅系祖細(xì)胞間黏附分子基因Emp;鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因Hmox-1、Trf、Fpn、TrfR;巨噬細(xì)胞核吞基因Tim4、MerTK相對(duì)表達(dá)量。β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)化基因。合成引物來(lái)自于上海生工股份有限公司,引物序列見(jiàn)Tab 1。

2 結(jié)果

2.1 ASP改善5-FU致傷小鼠貧血建模小鼠d 10外周血紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,5-FU組和ASP+5-FU組紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積均明顯性降低,但ASP+5-FU組紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量和紅細(xì)胞壓積的降幅低于5-FU組(Fig 1A-C)。結(jié)果提示:一次性大劑量注射5-FU可致小鼠貧血,ASP可明顯提升5-FU作用后外周血紅細(xì)胞數(shù)量及血紅蛋白含量,減輕貧血。

2.2 ASP促進(jìn)5-FU致傷小鼠脾臟應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生觀察各組小鼠全身情況,稱體質(zhì)量,結(jié)果顯示:與對(duì)照組和ASP組相比,5-FU組和ASP+5-FU組小鼠體質(zhì)量明顯下降,其中ASP 對(duì)5-FU導(dǎo)致的體質(zhì)量下降有部分改善作用,8 d后兩組小鼠體質(zhì)量逐漸回升,但10 d仍低于對(duì)照組(Fig 2A)。小鼠股骨骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)計(jì)數(shù),結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,5-FU組BMMNCs數(shù)量明顯下降;與5-FU組相比,ASP+5-FU組BMMNCs明顯回升,但仍低于對(duì)照組(Fig 2B)。小鼠脾臟稱質(zhì)量及組織學(xué)形態(tài)結(jié)果顯示,對(duì)照組與ASP組脾臟為長(zhǎng)橢圓形,呈紅褐色,外表光滑,紅髓和白髓分界清晰,結(jié)構(gòu)完整;5-FU組脾臟體積較大,脾指數(shù)明顯性升高,紅髓區(qū)域面積增大;ASP+5-FU組脾臟體積較5-FU組更大,且外表顏色加深,表面有突起結(jié)節(jié),脾指數(shù)進(jìn)一步升高,紅髓面積進(jìn)一步增大(Fig 2C-G)。綜合以上結(jié)果提示,5-FU抑制骨髓造血導(dǎo)致小鼠貧血,在5-FU作用后10 d,脾臟可代償性進(jìn)行髓外應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生,而ASP可明顯促進(jìn)應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生。爆氏紅系形成單位(burst forming unit-erythroid, BFU-E)是正常的早期紅系祖細(xì)胞,也是應(yīng)激性紅系祖細(xì)胞,可反映貧血等應(yīng)激條件下紅細(xì)胞代償能力。脾臟單個(gè)核細(xì)胞BFU-E集落計(jì)數(shù)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,5-FU組BFU-E數(shù)量明顯降低,與5-FU組相比,ASP+5-FU組的集落數(shù)量明顯回升(Fig 2H, I)。結(jié)果提示,5-FU可損傷早期紅系祖細(xì)胞,而ASP可保護(hù)早期紅系祖細(xì)胞,進(jìn)而增強(qiáng)應(yīng)激性紅系祖細(xì)胞的增殖分化能力。

Fig 1 Anemia in 5-FU-induced mice improved

2.3 ASP拮抗5-FU對(duì)F4/80+脾臟巨噬細(xì)胞的損傷F4/80是脾臟幼紅細(xì)胞島中央巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明:與對(duì)照組比較,5-FU組F4/80+脾巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少;與5-FU組比較,ASP+5-FU組F4/80+脾巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯回升(Fig 3A,B)。結(jié)果提示,ASP可通過(guò)保護(hù)F4/80+脾巨噬細(xì)胞,促進(jìn)應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生。

2.4 ASP拮抗5-FU促進(jìn)脾巨噬細(xì)胞與幼紅細(xì)胞間黏附巨噬細(xì)胞和幼紅細(xì)胞之間的黏附分子有利于幼紅細(xì)胞島形成和紅細(xì)胞發(fā)育。qRT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,5-FU組Emp基因表達(dá)下降;與5-FU組相比,ASP+5-FU組的Emp基因表達(dá)量明顯上升(Fig 4)。結(jié)果提示,ASP可明顯增強(qiáng)5-FU致貧血小鼠脾巨噬細(xì)胞與幼紅細(xì)胞之間的黏附,進(jìn)而促進(jìn)應(yīng)激性紅細(xì)胞島形成,促進(jìn)幼紅細(xì)胞發(fā)育成熟。

Fig 2 Extramedullary hematopoiesis in spleen of mice

Fig 3 F4/80+ macrophages in spleen detected by flow cytometry n=5)

Fig 4 Analysis of adhesion molecules Emp gene expressionin mouse spleen macrophages and n=9)

2.5 ASP拮抗5-FU促進(jìn)巨噬細(xì)胞向紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)鐵紅細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中,幼紅細(xì)胞島中央巨噬細(xì)胞將分解衰老紅細(xì)胞血紅素產(chǎn)生的鐵,通過(guò)周圍幼紅細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor, TrfR)轉(zhuǎn)運(yùn)至幼紅細(xì)胞,參與其胞內(nèi)血紅蛋白的合成。TrfR也即CD71,是從紅細(xì)胞集落形成單位(colony forming unit-erythrocyte,CFU-E)到網(wǎng)織紅細(xì)胞的紅系表面標(biāo)志物。qRT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,5-FU組和ASP+5-FU組Hmox-1、Trf、Fpn基因表達(dá)均明顯性升高,其中5-FU組升高更明顯(Fig 5A-C),結(jié)果可能與5-FU急性損傷紅細(xì)胞,導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬紅細(xì)胞,降解血紅素產(chǎn)生鐵增多,胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)相對(duì)增強(qiáng)有關(guān);但值得注意的是,ASP+5-FU組TrfR的表達(dá)量較對(duì)照組和5-FU組明顯大幅度升高(Fig 5D)。結(jié)果提示,ASP可有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞向紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)鐵,促進(jìn)應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生。

2.6 ASP拮抗5-FU促進(jìn)脾巨噬細(xì)胞內(nèi)吞紅細(xì)胞核紅細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中,幼紅細(xì)胞島中央巨噬細(xì)胞吞噬降解晚幼紅細(xì)胞排出的細(xì)胞核,去核紅細(xì)胞發(fā)育為網(wǎng)織紅細(xì)胞。qRT-PCR結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,5-FU組Tim4和MerTK基因表達(dá)量升高;而ASP+5-FU組Tim4和MerTK基因表達(dá)量較5-FU組都明顯性增高,且高于對(duì)照組(Fig 6A,B)。結(jié)果提示,ASP在小鼠貧血后可明顯增強(qiáng)脾巨噬細(xì)胞吞噬并降解紅細(xì)胞核的功能,促進(jìn)晚幼紅細(xì)胞去核向網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟分化。

3 討論

貧血是化療的副反應(yīng)之一,輸血和注射重組促紅細(xì)胞生成素是化療后貧血常見(jiàn)的治療手段[1],但長(zhǎng)期輸血會(huì)引起機(jī)體鐵過(guò)載而影響臟器功能[2];長(zhǎng)期注射促紅細(xì)胞生成素會(huì)造成高血壓、血液粘稠度升高,易引起靜脈血栓[3]。因此,尋找一種毒副作用小的天然藥物并探討其作用機(jī)制將為臨床化療后貧血的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

“氣血學(xué)說(shuō)”是祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的理論基礎(chǔ)?！侗静菥V目》中形容當(dāng)歸味甘而重,故專能補(bǔ)血,其氣輕而辛,故又能行血,補(bǔ)中有動(dòng),行中有補(bǔ),為血中之要藥。ASP作為當(dāng)歸的有效成分,對(duì)機(jī)體的造血系統(tǒng)有明顯的促進(jìn)作用[4]。文獻(xiàn)報(bào)道,ASP能增加小鼠骨髓爆氏紅系集落形成單位(burst forming unit-erythroctye, BFU-E)及紅細(xì)胞集落形成單位(colony forming unit-erythrocyte, CFU-E)數(shù)量,提升外周血紅細(xì)胞數(shù)量及血紅蛋白含量,促進(jìn)骨髓移植小鼠功能重建[10];ASP可促進(jìn)腎臟和肝臟產(chǎn)生 EPO[11],還可促進(jìn)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞分泌EPO樣活性物質(zhì)[12]。5-FU作為化療藥物,廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌等腫瘤治療[13]。實(shí)驗(yàn)證明,5-FU可以抑制骨髓造血,導(dǎo)致紅系、粒系、血小板全面下降。課題組既往研究表明,ASP可以拮抗5-FU,促進(jìn)骨髓造血及外周血象的恢復(fù)。應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生是指通過(guò)不同于正常紅細(xì)胞發(fā)生的應(yīng)激紅系祖細(xì)胞的快速增殖分化,迅速恢復(fù)貧血的過(guò)程[14]。幼紅細(xì)胞島(eythroblastic island, EBI)對(duì)于這個(gè)過(guò)程的調(diào)控起著不可或缺的關(guān)鍵作用,小鼠應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生的主要部位是脾臟[5]。而ASP能否通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞促進(jìn)應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生目前尚不清楚。本研究以5-FU建立小鼠化療后貧血模型,初步探討ASP對(duì)小鼠脾臟應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生的影響,以及ASP對(duì)幼紅細(xì)胞島巨噬細(xì)胞的功能影響。

Fig 5 Iron transport gene of mouse spleen macrophages detected by n=9)

Fig 6 Nuclear endocytosis gene of mouse spleen macrophages detected by n=9)

小鼠一次性大劑量腹腔注射5-FU,成功建立化療后小鼠貧血模型。5-FU組小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積均明顯性降低,骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)減少,而連續(xù)注射ASP 10 d后,ASP+5-FU組紅細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞壓積和骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)均回升,提示ASP可以改善5-FU所致的化療后貧血。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與5-FU組相比,ASP+5-FU組的小鼠脾臟腫大,紅髓占比明顯增多,提示ASP可促進(jìn)脾臟代償性髓外造血。應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生(stress erythropoiesis)起始于應(yīng)激性紅系祖細(xì)胞,經(jīng)歷BFU-E、CFU-E階段,在EBI中央巨噬細(xì)胞作用下依次發(fā)育為前成紅細(xì)胞(proerythroblasts)、早幼紅細(xì)胞(basophilic normoblast)、中幼紅細(xì)胞(polychromatophilic normoblast)、晚幼紅細(xì)胞(orthochromatic normoblast)。晚幼紅細(xì)胞去核后形成網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocytes),網(wǎng)織紅細(xì)胞除去核糖體后形成成熟紅細(xì)胞[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明,ASP可以減輕5-FU對(duì)小鼠脾臟BFU-E的損傷,促進(jìn)化療后BFU-E增殖分化。

在紅細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中,EBI中央巨噬細(xì)胞通過(guò)黏附分子與幼紅細(xì)胞接觸,將血紅蛋白合成需要的鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至紅細(xì)胞,吞噬晚幼紅細(xì)胞排出的細(xì)胞核,促進(jìn)晚幼紅細(xì)胞成熟分化為網(wǎng)織紅細(xì)胞,對(duì)紅細(xì)胞分化和成熟起著重要調(diào)控作用[5, 16]。本實(shí)驗(yàn)首先證實(shí),ASP可以拮抗5-FU對(duì)脾臟巨噬細(xì)胞的損傷,增加脾臟巨噬細(xì)胞的數(shù)量。既往研究表明,發(fā)育中的幼紅細(xì)胞和EBI中央巨噬細(xì)胞上均高表達(dá)黏附分子紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞蛋白(EMP),EMP對(duì)于紅細(xì)胞分化起著重要調(diào)控作用,EMP的缺失會(huì)破壞幼紅細(xì)胞島結(jié)構(gòu),導(dǎo)致紅系細(xì)胞分化延滯[16-17]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí),ASP可促進(jìn)Emp基因表達(dá)。鐵代謝在應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生中尤為重要,血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HMOX-1)分解損傷紅細(xì)胞血紅素產(chǎn)生的鐵,是鐵重復(fù)利用最重要的來(lái)源[18]。除此之外,巨噬細(xì)胞還可通過(guò)多種受體攝入不同來(lái)源的鐵。巨噬細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor, TRFR)吸收轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin, TRF)結(jié)合的Fe3+;非轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵可直接通過(guò)二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(DMT-1)獲得;CD91 (LRP1)受體清除血凝素結(jié)合血紅素(Hpx -Heme)的鐵;觸珠蛋白-血紅蛋白(Hp-Hgb)復(fù)合體通過(guò)CD163受體被吸收。鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin, FPN)是巨噬細(xì)胞將Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)出胞外的唯一蛋白,在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)氧化Fe2+成Fe3+。TRF是巨噬細(xì)胞胞外Fe3+的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,與幼紅細(xì)胞膜上高表達(dá)的TRFR結(jié)合,這是紅細(xì)胞血紅蛋白血紅素的主要鐵來(lái)源[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明,5-FU組Hmox-1、Trf、Fpn基因表達(dá)均明顯升高,這可能與5-FU急性損傷紅細(xì)胞導(dǎo)致血紅素降解產(chǎn)生鐵增多,鐵轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)增強(qiáng)有關(guān);但值得注意的是,ASP+5-FU組TrfR基因表達(dá)明顯增強(qiáng),提示ASP可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)Fe3+,促進(jìn)應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生。有報(bào)道稱,幼紅細(xì)胞擠出的細(xì)胞核由巨噬細(xì)胞膜上的T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白4(Tim4)和原癌基因酪氨酸激酶(MerTK)識(shí)別磷脂酰絲氨酸位點(diǎn)進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)降解[16]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,ASP+5-FU組Tim4和MerTK基因表達(dá)較5-FU組明顯性增高,提示ASP可促進(jìn)脾臟EBI中央巨噬細(xì)胞吞噬并降解紅細(xì)胞核,促進(jìn)晚幼紅細(xì)胞去核向網(wǎng)織紅細(xì)胞分化。

綜上所述,本研究證實(shí)5-FU可減少EBI中央巨噬細(xì)胞數(shù)量并引起巨噬細(xì)胞功能受損;而ASP可以促進(jìn)小鼠脾臟應(yīng)激性紅細(xì)胞發(fā)生,更快恢復(fù)化療導(dǎo)致的貧血,其機(jī)制與增加EBI中央巨噬細(xì)胞數(shù)量,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞與幼紅細(xì)胞間的黏附,改善巨噬細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和核內(nèi)吞功能有關(guān)。但ASP調(diào)控EBI中央巨噬細(xì)胞的靶點(diǎn)以及與應(yīng)激性紅系祖細(xì)胞增殖分化調(diào)控機(jī)制的關(guān)聯(lián)尚不清楚,本課題組將在后續(xù)工作中進(jìn)一步深入研究。