楊 帆,張亞京,張曉云,劉利飛,黃家安,王月華

(1. 河北中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院;2. 河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.河北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;4.河北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床技能中心,河北 石家莊 050091)

糖尿病腎臟疾病(Diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥,也是導(dǎo)致患者進(jìn)展至終末期腎病,最終應(yīng)用腎臟替代治療的主要原因之一[1]。鑒于DKD的嚴(yán)重不良預(yù)后,因此DKD的防治已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的一項(xiàng)艱巨任務(wù)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),在DKD中腎組織固有細(xì)胞自噬通路受阻,溶酶體酸化缺陷,無法去除異常和錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器及代謝廢物,從而導(dǎo)致腎臟組織學(xué)病變[2]。

鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(sodium-dependent glucose transporters 2,SGLT2)抑制劑恩格列凈作為一種新型的口服降糖藥,除了具有降低血糖、血脂,減輕體重的作用外,還可通過改善腎缺氧、降低腎臟高濾過、抑制氧化應(yīng)激和炎癥等延緩糖尿病并發(fā)癥出現(xiàn)及DKD的進(jìn)展[3]。EMPA-REG OUTCOME試驗(yàn)證實(shí),恩格列凈不僅顯著降低2型糖尿病合并心血管疾病患者死亡和心衰住院風(fēng)險(xiǎn),并可延緩腎臟疾病的進(jìn)展和降低臨床相關(guān)腎臟事件的發(fā)生率[4]。此外,恩格列凈還可誘導(dǎo)AMP激活的蛋白激酶和沉默信息調(diào)節(jié)因子1活化,正向調(diào)節(jié)自噬,維持腎臟細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),降低腎臟損傷[5-6],但其對(duì)自噬的調(diào)控是否通過保護(hù)溶酶體途徑實(shí)現(xiàn)的尚未可知。因此,本研究上述研究基礎(chǔ)上,通過建立DKD小鼠模型,觀察恩格列凈是否通過調(diào)節(jié)自噬-溶酶體通路發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑恩格列凈片(批號(hào)J20171073)購自上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司;微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B抗體(LC3B,批號(hào)ab48394)、p62/SQSTM1抗體(批號(hào)ab91526)、Beclin 1抗體(批號(hào)ab62557)、Agt7抗體(批號(hào)ab133528)、溶酶體相關(guān)膜蛋白1抗體(LAMP 1,批號(hào)ab25245)、Bcl-2抗體(批號(hào)ab32124)、caspase-3抗體(批號(hào)ab184787)、Bax抗體(批號(hào)ab32503)購自美國Abcam公司;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,批號(hào)SXR063)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β,批號(hào)SXR026)、單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemokine-1,MCP-1,批號(hào)SXR043)試劑盒均購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司;β-actin 抗體(批號(hào)GB11001)、HRP標(biāo)記羊抗兔抗體(批號(hào)GB23303)、磷酸化酶抑制劑和蛋白酶抑制劑批號(hào)(批號(hào)G2007)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)G2014)購自武漢賽維爾生物科技有限公司;BCA 蛋白定量試劑盒(批號(hào)A53225)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器ImagQuant LAS4000型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國通用GE公司);7600-020全自動(dòng)大型生化分析儀(日本Hitachi公司);BX63+DP72型正置研究級(jí)顯微鏡(日本Olympus公司);DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);Centrifuge5417R型低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司),RM2050石蠟切片機(jī)(德國Leica 公司),全自動(dòng)模塊化石蠟包埋機(jī)(德國SLEE公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性db/db和db/m小鼠(11～12周齡,SPF級(jí)),遺傳背景為C57BLKS/J,購自江蘇常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào)SCXK(蘇)2021-0013。其中db/db小鼠16只,體質(zhì)量(45±5)g;db/m小鼠8只,體質(zhì)量(25±5)g,于濕度50%～70%,溫度(24±1) ℃條件下喂養(yǎng)。小鼠可自由進(jìn)食進(jìn)水,并維持12 h光照/黑暗循環(huán)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在所在機(jī)構(gòu)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可的前提下進(jìn)行,并遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理準(zhǔn)則。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組將適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后的db/db小鼠監(jiān)測(cè)尿蛋白均陽性后隨機(jī)分為模型組(Model)、恩格列凈組(Empagliflozin),每組8只,db/m組小鼠8只作為正常組(Control)。各組繼續(xù)飼喂小鼠維持飼料直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,維持飼料主要含蛋白質(zhì)21.1%,脂肪4.5%,碳水化合物60.6%等;由北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司提供。

2.2 實(shí)驗(yàn)藥物及干預(yù)恩格列凈片溶于蒸餾水中,給藥劑量為10 mg·kg-1·d-1[4],根據(jù)給藥劑量配置藥液質(zhì)量濃度為1 g·L-1(0.1%),每天灌胃1次,連續(xù)灌胃8周。正常組和模型組每日用等體積的蒸餾水灌胃。

2.3 標(biāo)本收集各組小鼠于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)置于代謝籠中收集24 h尿液,測(cè)尿量,EP管分裝后置-80 ℃冰箱保存;并于禁食不禁水12 h后,3%異氟烷吸入麻醉,股動(dòng)脈取血,脫頸椎處死后,剖開腹腔,完整剪下腎臟,剝離腎包膜,并將腎組織一部分放入4%多聚甲醛中固定,用于光鏡檢測(cè),另一部分腎臟放入 -80 ℃冰箱凍存,用于Western blot檢測(cè)。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1各組小鼠24 h尿蛋白定量(24 h urine protein,24h-UTP)檢測(cè) 將收集的小鼠尿標(biāo)本在4 ℃離心機(jī)中以3 000 r·min-1離心15 min后取上清,按照尿蛋白定量試劑盒的操作說明書測(cè)定各組小鼠尿蛋白濃度,然后根據(jù)各組小鼠尿量計(jì)算24 h-UTP。

2.4.2各組小鼠生化指標(biāo)檢測(cè) 將收集的各組小鼠血液置于全自動(dòng)血生化分析儀上測(cè)定其血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,HBA1c)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三脂(triglyceride,TG)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(creatinine,Scr)水平。

2.4.3各組小鼠血清炎癥因子檢測(cè) 將收集的各組小鼠血液,置于離心機(jī)中3 000 r·min-1,4 ℃離心10 min分離血清,按照試劑盒說明書測(cè)定血清TNF-α、IL-1β、MCP-1水平。

2.4.4各組小鼠腎組織病理變化 將固定24 h后的各組小鼠腎臟組織取出,梯度酒精脫水,石蠟常規(guī)包埋并切片(厚度4 μm),然后分別用蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)和Masson染色。光學(xué)顯微鏡觀察腎組織病理形態(tài)學(xué),Image Pro Plus 6.0軟件被用于對(duì)Masson染色的腎病理切片膠原沉積量進(jìn)行半定量分析。

2.4.5Western blot檢測(cè)自噬-溶酶體及凋亡相關(guān)蛋白 取小鼠腎組織約50 mg充分研磨后,加入RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑后冰上裂解30 min。然后以10 000 r·min-1,4 ℃離心10 min,吸取上清。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)量濃度。將吸取的蛋白樣品用上樣緩沖液稀釋后在100 ℃沸水中變性5 min。將適量蛋白樣品電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,封閉洗滌后,分別加入p62(1 ∶750)、LC3B(1 ∶600)、Beclin 1(1 ∶600)、Agt7(1 ∶500)、LAMP1(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶750)、caspase-3(1 ∶750)、Bax(1 ∶750)、β-actin(1 ∶1 000)抗體,4 ℃孵育過夜,洗膜,HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗孵育1 h,洗膜后置于ECL發(fā)光液中顯色,使用ImageQuant LAS4000 成像系統(tǒng)拍攝,ImageJ軟件分析條帶灰度值。

Tab 2 Effect of empagliflozin on 24 h-UTP and renal function in DKD

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠一般情況正常組小鼠活動(dòng)靈敏,反應(yīng)迅速,毛色光亮;模型組小鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食,精神萎靡,活動(dòng)緩慢,反應(yīng)遲鈍,毛色枯槁;恩格列凈干預(yù)后上述情況有明顯改善,反應(yīng)靈敏,活動(dòng)量增加,毛色有光澤。

3.2 各組小鼠血糖血脂情況比較如Tab 1所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠FBG、HBA1c、TG、TC均明顯升高(P<0.01);與模型組小鼠相比,經(jīng)恩格列凈干預(yù)后,小鼠FBG、HBA1c、TG、TC均顯著降低(P<0.05,P<0.01)。

3.3 各組小鼠24 h-UTP及腎功能情況比較如Tab 2所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠24 h-UTP、BUN、Scr及KIM-1均明顯升高(P<0.01);與模型組小鼠相比,經(jīng)恩格列凈干預(yù)后,小鼠24-UTP、BUN、Scr及KIM-1均明顯降低(P<0.01)。

3.4 各組小鼠血清炎癥因子水平比較如Tab 3所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠血清IL-1β、TNF-α及MCP-1水平均明顯升高(P<0.01);與模型組小鼠相比,經(jīng)恩格列凈干預(yù)后,小鼠血清IL-1β、TNF-α及MCP-1均明顯降低(P<0.01)。

Tab 3 Effect of empagliflozin on serum inflammatory

3.5 各組小鼠腎組織病理變化情況如Fig 1所示,正常組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常,未見異常的組織病理學(xué)改變;模型組小鼠腎小球基底膜彌漫性增厚,系膜基質(zhì)及細(xì)胞增多,腎小囊腔變窄,部分可見球囊黏連,腎小管空泡變性,間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤,部分間質(zhì)纖維化。恩格列凈干預(yù)后,小鼠腎組織病理改變均有一定程度減輕。Masson染色顯示正常組小鼠腎組織膠原纖維沉積較少,而模型組小鼠腎組織膠原纖維沉積明顯增加(P<0.01),經(jīng)恩格列凈干預(yù)后,DKD小鼠腎組織膠原纖維明顯減少(P<0.01)。

Fig 1 Effects of empagliflozin on renal histopathology in DKD mice(×400)

Fig 2 Effect of empagliflozin on autophagy lysosomal pathway-related proteins in renal tissue of DKD

Fig 3 Effect of empagliflozin on apoptosis-related proteins in renal tissue of DKD

3.6 各組小鼠腎組織自噬-溶酶體途徑相關(guān)蛋白表達(dá)情況如Fig 2所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠腎組織p62升高,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin 1、Agt7、LAMP1降低(P<0.01);經(jīng)恩格列凈干預(yù)后,DKD小鼠腎組織p62降低,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、Beclin 1、Agt7、LAMP1升高(P<0.01)。

3.7 各組小鼠腎組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況如Fig 3所示,與正常組小鼠相比,模型組小鼠腎組織caspase-3、Bax升高,Bcl-2降低(P<0.01);經(jīng)恩格列凈干預(yù)后,DKD小鼠腎組織caspase-3、Bax降低,Bcl-2升高(P<0.01)。

4 討論

糖尿病在全球呈快速增長趨勢(shì),據(jù)2019年國際糖尿病聯(lián)盟報(bào)告全球約有4.63億糖尿病患者,預(yù)計(jì)到2045年將增長至7億,其中有30%～40%的患者會(huì)進(jìn)展為DKD[7]。我國一項(xiàng)2016年的調(diào)查研究顯示,在住院患者中糖尿病所引起的慢性腎臟病已經(jīng)超過原發(fā)性腎小球腎炎相關(guān)的慢性腎臟病,預(yù)估目前的患病人數(shù)已達(dá)2 400萬以上,并且已成為我國中老年人終末期腎病的首因[8]。目前,DKD的防治主要包括控制血糖、血壓、調(diào)脂、抗血小板聚集以及調(diào)整生活方式等。雖然血管緊張素受體阻滯劑及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑是最常用的可有效延緩DKD進(jìn)展的藥物,但因其存在升高血鉀、加重腎缺血等不良反應(yīng)而限制了臨床應(yīng)用。因此,具有腎臟保護(hù)作用的新型降糖藥物的研發(fā)越來越受到廣大學(xué)者關(guān)注。

SGLT2抑制劑恩格列凈是近年來新興的一類口服降糖藥物。其能夠直接作用于腎臟,通過抑制腎臟近曲小管SGLT2蛋白表達(dá),減少腎小管對(duì)葡萄糖的重吸收,增加葡萄糖的排泄,在不增加胰島素分泌的情況下降低血糖水平?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),恩格列凈還可通過抑制管球反饋,減輕腎臟高濾過,降低腎小球內(nèi)壓;同時(shí)減輕近端腎小管的負(fù)擔(dān),抗氧化應(yīng)激,抑制炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)自噬,增加促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生,改善內(nèi)皮功能以及輕度生酮等方面減少尿蛋白,延緩DKD的進(jìn)展[3,5-6]。本研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用恩格列凈干預(yù)后的DKD小鼠血糖、血脂均下降,腎功能改善,尿蛋白排泄降低,同時(shí)炎癥因子的表達(dá)也降低,這與目前研究發(fā)現(xiàn)的恩格列凈的藥理作用相一致。

研究表明,溶酶體功能障礙在多種腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9]。溶酶體功能受損導(dǎo)致自噬抑制,從而使細(xì)胞的各種代謝產(chǎn)物,如受損的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)聚集體不能在溶酶體降解、清除和循環(huán),引起各種病理性產(chǎn)物堆積,進(jìn)而激活炎癥因子的表達(dá)活化,從而導(dǎo)致腎臟組織學(xué)病變,加速腎小球硬化[10]。Liu等[11]發(fā)現(xiàn),在DKD患者和晚期糖基化終產(chǎn)物刺激的足細(xì)胞中自噬活性被抑制,同時(shí)糖基化終產(chǎn)物觸發(fā)了足細(xì)胞溶酶體膜透化,導(dǎo)致酶活性降低、溶酶體酸化缺陷,溶酶體降解自噬體的能力下降。LAMP1可作為溶酶體標(biāo)記蛋白之一,主要分布在溶酶體膜和內(nèi)吞體膜。研究顯示LAMP1不僅具有維持溶酶體結(jié)構(gòu)完整性以及溶酶體內(nèi)pH穩(wěn)定性的作用,還參與多種細(xì)胞內(nèi)的生理過程,如溶酶體胞吐的調(diào)節(jié)和自噬囊泡的降解等[12]。此外,Beclin 1、LC3和p62是自噬的關(guān)鍵介質(zhì),被廣泛用作在正常和病理?xiàng)l件下監(jiān)測(cè)和量化自噬活動(dòng)的標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)由BECN 1基因編碼的Beclin 1蛋白,在自噬囊泡形成的起始階段起中心作用,誘導(dǎo)產(chǎn)生活躍的吞噬囊泡并將自噬相關(guān)蛋白定位于吞噬泡[13]。當(dāng)吞噬泡形成后,Beclin 1結(jié)合LC3,LC3前體被半胱氨酸蛋白酶裂解生成LC3-I,LC3-I可與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ[14]。自噬底物p62/SQSTM1作為泛素化蛋白,是泛素化蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和微生物的受體,可將被清除的物質(zhì)與底物受體相結(jié)合,然后被轉(zhuǎn)運(yùn)至吞噬泡進(jìn)而被溶酶體水解酶降解,其表達(dá)水平與自噬呈負(fù)相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腎組織p62蛋白升高,Beclin 1、Agt7蛋白、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值降低,同時(shí)LAMP1表達(dá)也降低,應(yīng)用恩格列凈干預(yù)后,逆轉(zhuǎn)了上述相關(guān)蛋白的表達(dá)。這表明高糖環(huán)境下腎組織自噬-溶酶體通路受阻,自噬底物降解受損,而恩格列凈可改善DKD小鼠腎組織溶酶體結(jié)構(gòu)和功能,促進(jìn)自噬底物降解,從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

此外,細(xì)胞自噬與凋亡密切相關(guān)。研究表明,抑制自噬相關(guān)蛋白Agt 7的表達(dá)導(dǎo)致自噬通量受損,引起線粒體受損和活性氧的積累,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。Bcl-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白,Bcl-2與Beclin 1結(jié)合形成復(fù)合物,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,Bcl-2磷酸化會(huì)導(dǎo)致Bcl-2-Beclin 1復(fù)合物解離,從而激活細(xì)胞自噬,同時(shí)其也可以與Bax/Bad結(jié)合形成復(fù)合物抑制細(xì)胞凋亡,但長時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡途徑的激活[17]。caspases作為細(xì)胞凋亡過程中的執(zhí)行者,caspase-3可以與p62的泛素結(jié)合域結(jié)合,隨后p62與LC3相互作用將caspase-3募集到自噬體而降解,從而抑制細(xì)胞凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn),模型組小鼠腎組織caspase-3、Bax升高,Bcl-2降低;經(jīng)恩格列凈干預(yù)后,DKD小鼠腎組織caspase-3、Bax降低,Bcl-2升高。這表明恩格列凈可改善DKD小鼠腎組織細(xì)胞凋亡。

綜上所述,恩格列凈可通過保護(hù)DKD小鼠腎組織細(xì)胞溶酶體結(jié)構(gòu)和功能,修復(fù)自噬-溶酶體通路,促進(jìn)自噬底物降解,抑制炎癥因子的產(chǎn)生,進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡,降低尿蛋白排泄,改善腎功能,從而減輕腎臟損傷,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)完成于河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,向全體老師和同學(xué)們表示感謝。)