劉 宇,程路峰,武 洋,李夢(mèng)佳,阿米爾·澤布,古麗若依·帕爾哈提,陳佳琪,毛旭文

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,2. 新疆天然藥物活性組分與釋藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830017)

隨著炎癥性腸炎(inflammatory bowel disease,IBD)發(fā)病率不斷攀升,全球共有680萬(wàn)例炎癥性腸炎患者,僅我國(guó)就有266萬(wàn)例[1]。IBD屬于以胃腸道為主的慢性全身性炎癥,病變多集中在結(jié)腸、直腸黏膜層以及黏膜下層,嚴(yán)重時(shí)甚至涉及全消化道,嚴(yán)重影響身體健康。目前,IBD病因尚不明確,且沒(méi)有根治性的治療藥物,這使得IBD成為迫切需要解決的重大問(wèn)題[2]。傳統(tǒng)治療IBD藥物包括5-氨基水楊酸類、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素類等,但多有潛在的免疫排斥反應(yīng)、不耐受等情況,許多患者的病情得不到有效控制[3]。近年來(lái),JAK、IL-12、IL-13等靶點(diǎn)逐漸被研究者們所關(guān)注,臨床研究發(fā)現(xiàn)托法替尼(JAK抑制劑)、烏司奴單抗(IL-12和IL-23抑制劑)能夠有效緩解炎癥性腸炎[4-5],一些中藥對(duì)IBD的治療優(yōu)勢(shì)也逐漸得到了驗(yàn)證[6]。隨著IBD治療的個(gè)性化以及治療靶點(diǎn)的不斷增加,開(kāi)發(fā)來(lái)源于植物、中草藥的天然化合物在IBD治療上具有很大的應(yīng)用前景。

鉤藤為茜草科鉤藤屬植物,是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥,可以用于治療高血壓、癲癇、焦慮等疾病[7]。鉤藤的化學(xué)成分復(fù)雜多樣,主要活性成分生物堿類約70余種,其有效成分鉤藤堿(rhynchophylline,Rhy)具有降低血壓、平喘、抗癌等功效,開(kāi)發(fā)前景可觀[8]。既往研究發(fā)現(xiàn),鉤藤堿能夠抑制炎性介質(zhì)(如TNF α、IL-1β等)的產(chǎn)生,同時(shí)可以通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/NLRP3途徑發(fā)揮抗炎、抗氧化作用[9],但鉤藤堿治療炎癥性腸炎作用及其機(jī)制尚待闡明。因此,本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法,結(jié)合體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討鉤藤堿治療炎癥性腸炎的可行性及作用機(jī)制,以期為后續(xù)治療炎癥性腸炎藥物的研發(fā)提供思路及參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物60只C57BL/6j,♀♂各半,體質(zhì)量(20±2) g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006)。于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng),SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(新)2016-0002,光照12 h/d,黑暗12 h/d,溫度(21±2) ℃,濕度40%～45%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理批號(hào):IACUC-20211016-39。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

1.3 藥品與試劑鉤藤堿,購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):C22M11S113789;葡聚糖硫酸鈉,上海麥克林生化科技有限公司,批號(hào):C12750877;地塞米松注射液,上?，F(xiàn)代哈森(商丘)藥業(yè)有限公司,批號(hào):1905190231;小鼠糞便隱血試劑盒,上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):0701A22;腫瘤壞死因子(TNF-α,批號(hào):063016HLP104840701)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β,批號(hào):JL20884)、髓過(guò)氧化物酶(MPO,批號(hào):063016HLP103670701)、趨化因子配體1(CXCL1,批號(hào):063016HLP201500701)ELISA檢測(cè)試劑盒,均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司;NO試劑盒,北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):BC1475;JAK1抗體(批號(hào):BB04078927)、JAK2抗體(批號(hào):BA11156538)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器酶標(biāo)儀,型號(hào):CoDa,Bio-RaD公司生產(chǎn);二氧化碳CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Scientific公司);V18R型高速冷凍離心機(jī)(瑞士Dynamica公司);Power Pac3000型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 鉤藤堿治療IBD網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)

2.1.2鉤藤堿靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)檢索PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得鉤藤堿(CAS:76-66-4)3D結(jié)構(gòu)、SMILES號(hào)等,并利用SwissTargetPrediction平臺(tái)對(duì)鉤藤堿進(jìn)行潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。

2.1.3IBD疾病靶點(diǎn)篩選 利用GeneCards、OMIM、CTD及TTD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行“IBD”疾病靶點(diǎn)檢索,匯總?cè)ブ睾蟮玫郊膊∠嚓P(guān)靶點(diǎn)。通過(guò)Draw Veen Diagram在線程序?qū)^藤堿和IBD靶基因取交集獲得鉤藤堿-IBD共同靶點(diǎn),此集合為鉤藤堿治療IBD的可能靶點(diǎn)。

2.1.4藥物-疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及互作分析 為進(jìn)一步明確靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系,利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)2.1.3項(xiàng)獲得的鉤藤堿-IBD共同靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白-蛋白互作分析,導(dǎo)入Cytoscape軟件,運(yùn)用Network Analyzer及CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾翱梢暬治?將Degree值前10位的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

2.1.5潛在靶點(diǎn)GO功能富集分析與KEGG通路分析 通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析,通過(guò)生信平臺(tái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及可視化處理。

2.1.6藥物-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 選取Cytoscape軟件分析中Degree值前10位作用靶點(diǎn),從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得鉤藤堿3D結(jié)構(gòu),通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)在RCSB PDB平臺(tái)獲得蛋白受體,輸出pdbqt文件后通過(guò)CB-Docks進(jìn)行分子對(duì)接。若配體與受體能自發(fā)進(jìn)行結(jié)合,則結(jié)合能<0 kcal·mol-1(1 kcal= 4.186 kJ),若結(jié)合能<-5 kcal·mol-1表示兩者結(jié)合活性較好,若結(jié)合能<-7 kcal·mol-1表示結(jié)合較強(qiáng)且穩(wěn)定[10]。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.2.1動(dòng)物分組及給藥 60只C57/BL6j小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥組及鉤藤堿低、中、高劑量組,每組10只。對(duì)照組小鼠每日正常飲食飲水,不做處理。模型組、陽(yáng)性藥組及鉤藤堿低、中、高劑量組小鼠每日自由飲用2.5% DSS溶液代替飲水,自由進(jìn)食。鉤藤堿(低、中、高)組分別灌胃鉤藤堿溶液(2、4、8 mg·kg-1),陽(yáng)性藥組腹腔注射0.4 mg·kg-1地塞米松,每日1次,連續(xù)7 d。

Tab 1 Basic information of database

2.2.2疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分 實(shí)驗(yàn)期間,每日同一時(shí)間記錄各組小鼠體質(zhì)量變化、大便性狀及糞便隱血情況。根據(jù)Tab 2評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算DAI評(píng)分。

Tab 2 DAI scoring criteria

2.2.3結(jié)腸長(zhǎng)度、重量及結(jié)腸黏膜損傷(CMDI)評(píng)分 給藥結(jié)束后,取小鼠結(jié)腸段,測(cè)量長(zhǎng)度,后剖開(kāi)并清洗腸腔,稱取結(jié)腸重量,觀察結(jié)腸病變情況并進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷(CMDI)評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 CMDI scoring criteria

2.2.4ELISA法檢測(cè)小鼠結(jié)腸中TNF-α、IL-1β、CXCL1、MPO水平 取結(jié)腸組織加入適量PBS,勻漿,4 ℃,5 000×g,離心10 min,取上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)勻漿中腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、趨化因子1(CXCL1)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)含量。

2.2.5腸道通透性檢測(cè) 構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的IBD模型后,采用異硫酸熒光素-硫酸葡聚糖(FITC-dextran)示蹤法,取給藥7 d后的各組小鼠,禁食禁水4 h,灌胃給予FITC-dextran,灌胃4 h后,眼眶靜脈叢取血并離心處理。在分光光度計(jì)490 nm處檢測(cè)血漿中FITC-D含量表示小鼠腸黏膜通透性。

2.3 體外實(shí)驗(yàn)

2.3.1細(xì)胞培養(yǎng) Caco2細(xì)胞接種于含1%雙抗、10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,隔天換液,待細(xì)胞融合至90%,用0.25%胰酶消化并傳代。

2.3.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 CCK-8法檢測(cè)不同濃度鉤藤堿溶液處理后對(duì)Caco2細(xì)胞增殖活性的影響。調(diào)整細(xì)胞懸液密度為7×107個(gè)·L-1,每孔100 μL接種至96孔板孵育24 h,設(shè)空白組、對(duì)照組、模型組、鉤藤堿組。模型組與鉤藤堿組加入DSS誘導(dǎo)炎癥模型,鉤藤堿組加入不同濃度的鉤藤堿溶液,使鉤藤堿培養(yǎng)液的終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100 mg·L-1,各組6個(gè)復(fù)孔。孵育48 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,孵育1 h后450 nm測(cè)定吸光度。

2.3.3ELISA檢測(cè)鉤藤堿對(duì)Caco2細(xì)胞中TNF-α和IL-6含量 給予鉤藤堿溶液(2.5、5、10 mg·L-1)干預(yù)48 h后,收集各組細(xì)胞上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的含量。

2.3.4檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO水平 收集鉤藤堿干預(yù)后各組細(xì)胞上清液,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)NO水平。

2.3.5Western blot法檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 為進(jìn)一步探討鉤藤堿干預(yù)后Caco2細(xì)胞關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況,收集鉤藤堿干預(yù)后細(xì)胞,加適量RIPA裂解液,4 ℃,12 000 r·min-1,離心10 min,提取總蛋白并蛋白定量,取20 μg蛋白,100 ℃煮5 min使蛋白充分變性。每次上樣20 μL,通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,一抗及二抗孵育,曝光顯影,以目的蛋白與β-actin條帶灰度值比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

3.1.1鉤藤堿-IBD交集靶點(diǎn)獲取結(jié)果 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得104個(gè)鉤藤堿作用靶點(diǎn)及6 684個(gè)IBD作用靶點(diǎn)。采用Draw Veen Diagram在線程序繪制韋恩圖,得到70個(gè)鉤藤堿-IBD交集靶點(diǎn)(Fig 1)。

Fig 1 Intersection target of rhynchophylline-IBD

3.1.2藥物-疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)獲取結(jié)果 通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析鉤藤堿-IBD共同靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系及網(wǎng)絡(luò)可視化,篩選疾病-藥物共同靶點(diǎn)中的前十位起重要作用的關(guān)鍵靶點(diǎn),包括酪氨酸蛋白激酶2(JAK2)、酪氨酸蛋白激酶1(JAK1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)等(Fig 2,Tab 4)。

3.1.3GO及KEGG通路富集分析 GO富集發(fā)現(xiàn)(Fig 3A),交集靶點(diǎn)主要參與跨膜酪氨酸激酶受體蛋白、炎癥反應(yīng)、蛋白酪氨酸激酶活性等過(guò)程。KEGG富集發(fā)現(xiàn)(Fig 3B),交集靶點(diǎn)涉及PI3K-Akt、NF-κB等經(jīng)典信號(hào)通路,以及cAMP、Hippo等新穎信號(hào)通路。

Fig 2 PPI diagram of rhynchophylline-IBD intersection target

Tab 4 Information on key targets of rhynchophylline in treatment of IBD

3.1.4分子對(duì)接驗(yàn)證 分子對(duì)接結(jié)果如Tab 5所示,對(duì)交集靶點(diǎn)度值前十的核心靶點(diǎn)對(duì)接發(fā)現(xiàn),鉤藤堿及陽(yáng)性藥地塞米松能夠與選定的10個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行自發(fā)結(jié)合,鉤藤堿與JAK2和JAK1受體蛋白的結(jié)合最穩(wěn)定。利用CB-Docks分析最佳結(jié)果對(duì)接模式圖(Fig 4)。

Tab 5 Rhynchophylline-IBD target binding energy prediction

Fig 3 GO functional enrichment analysis (A), KEGG pathway analysis (B)

Fig 4 Molecular docking diagram results Cartoon structure is protein; rod structure is drug

3.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

3.2.1鉤藤堿對(duì)IBD小鼠體質(zhì)量及DAI評(píng)分的影響 小鼠飲用2.5% DSS溶液后,第3天出現(xiàn)懶動(dòng)、進(jìn)食和飲水量減少、體質(zhì)量下降、腹瀉、血便。與對(duì)照組比較,模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿組小鼠體質(zhì)量下降幅度明顯減小(P<0.01),懶動(dòng)、進(jìn)食和飲水量減少、體質(zhì)量下降、腹瀉、血便情況明顯好轉(zhuǎn)。模型組小鼠DAI評(píng)分逐漸升高(P<0.01),第5～7天出現(xiàn)不同程度的肉眼血便。與模型組比較,經(jīng)鉤藤堿和地塞米松干預(yù)后,小鼠DAI評(píng)分顯著降低(P<0.01),見(jiàn)Fig 5,6。

Fig 5 Effect of rhynchophylline on body *P<0.05,**P<0.01 vs control; #P<0.05,##P<0.01 vs model

Fig 6 Effect of rhynchophylline on DAI score in IBD mice n=6)

3.2.2鉤藤堿對(duì)IBD小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸質(zhì)量及結(jié)腸黏膜損傷(CMDI)評(píng)分的影響 與對(duì)照組比較,模型組小鼠結(jié)腸明顯縮短(P<0.01)、結(jié)腸重量明顯減輕(P<0.01),CMDI評(píng)分明顯上升(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿及陽(yáng)性藥地塞米松干預(yù)后小鼠結(jié)腸縮短幅度明顯減小(P<0.01)、結(jié)腸重量減輕幅度明顯減小(P<0.05)、CMDI評(píng)分明顯下降(P<0.05),見(jiàn)Fig 7。

3.2.3鉤藤堿對(duì)小鼠結(jié)腸勻漿中炎癥因子水平的影響 模型組小鼠結(jié)腸勻漿中TNF-α、IL-1β、CXCL1、MPO濃度明顯高于對(duì)照組(P<0.01),鉤藤堿和地塞米松干預(yù)后,TNF-α、IL-1β、CXCL1、MPO濃度明顯下降(P<0.01),且含量與鉤藤堿給藥濃度成負(fù)相關(guān)(Fig 8)。

3.2.4鉤藤堿對(duì)腸通透性的影響 與對(duì)照組比較,模型組小鼠血清中FITC-Dex濃度明顯增高(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿及陽(yáng)性藥組地塞米松組小鼠血清中FITC-Dex濃度明顯降低(P<0.05),見(jiàn)Fig 9。

3.3 體外實(shí)驗(yàn)

3.3.1鉤藤堿對(duì)Caco2細(xì)胞增殖活性的影響 使用不同濃度鉤藤堿進(jìn)行干預(yù)后,與正常組相比,模型組細(xì)胞的增殖活性明顯降低(P<0.01);與模型組相比,鉤藤堿濃度在0.01～100 mg·L-1對(duì)Caco2細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用(P<0.05),其中5 mg·L-1的鉤藤堿溶液對(duì)Caco2細(xì)胞增殖作用影響最明顯(P<0.01),見(jiàn)Fig 10。

3.3.2鉤藤堿對(duì)Caco2細(xì)胞中TNF-α和IL-6含量的影響 與正常組比較,模型組TNF-α和IL-6水平顯著上升(P<0.01);與模型組比較,各給藥組TNF-α和IL-6水平明顯著下降,且呈劑量依賴性(P<0.05),優(yōu)于陽(yáng)性藥地塞米松組,見(jiàn)Fig 11。

3.3.3鉤藤堿對(duì)Caco2細(xì)胞上清液中NO水平的影響 與正常組比較,模型組NO水平明顯上升(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿及地塞米松干預(yù)后NO水平明顯下降(P<0.01),見(jiàn)Fig 12。

Fig 8 Effect of rhynchophylline on TNF-α, IL-1β, CXCL1 and MPO in colonic homogenate of IBD mice n=6)

Fig 9 Effect of rhynchophylline on serum FITC-Dex concentration in IBD mice n=6)

Fig 10 Effect of rhynchophylline on proliferation of Caco2 cells n=6)

Fig 11 Effect of rhynchophylline on TNF-α and IL-6 content in Caco2 cells n=3)

3.3.4鉤藤堿對(duì)Caco2細(xì)胞中JAK2、JAK1蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果表明,模型組JAK2和JAK1蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高(P<0.01);與模型組比較,鉤藤堿組JAK2和JAK1蛋白表達(dá)較模型組明顯降低且呈劑量依賴性(P<0.01),見(jiàn)Fig 13。

Fig 12 Effect of rhynchophylline on NO level in supernatant of Caco2 cells n=3)

4 討論

IBD作為一類病因不明且病程反復(fù)的疾病,一直是當(dāng)前醫(yī)學(xué)面臨的一道難關(guān),盡管已有的常規(guī)治療藥物能夠使IBD的疾病過(guò)程得到改善,但由于全身給藥或藥物在體內(nèi)重新分布而產(chǎn)生嚴(yán)重副作用的可能性很高。因此,尋找治療IBD靶向性強(qiáng)、有效性高的藥物是需要突破的關(guān)鍵。

已有研究發(fā)現(xiàn),阻斷Janus激酶(JAK)能夠有效抑制黏膜免疫細(xì)胞中多種促炎細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),JAK是一個(gè)酪氨酸激酶的家族,該家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2四個(gè)亞型,與自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)密切相關(guān)[11]。JAK參與許多必需的細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo),在細(xì)胞因子信號(hào)傳遞中扮演著重要角色。JAK2的異常激活能夠刺激細(xì)胞因子的運(yùn)輸進(jìn)而促進(jìn)IBD的發(fā)生發(fā)展[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)[13],在IBD大鼠腸黏膜中p-JAK2含量會(huì)顯著增加,可誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子(如IL-6等)的釋放。JAK1是免疫反應(yīng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的另一類關(guān)鍵促炎因子,在IBD小鼠中JAK1和相關(guān)促炎因子表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)[14]。也就是說(shuō),JAK抑制劑成為了一種新的有希望治療炎癥性腸病的藥物。如托法替尼(非選擇性JAK抑制劑)、非戈替尼(JAK1選擇性小分子抑制劑)已被批準(zhǔn)用于IBD的治療,能夠明顯消退IBD癥狀,且激酶抑制劑屬于口服小分子藥物,使得其在IBD治療上備受關(guān)注[15]。而JAK抑制劑治療IBD目前仍處于初始階段,相關(guān)研究較少,來(lái)源于植物、食物、中草藥的具有毒副作用少,療效確切等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的天然化合物有望成為治療IBD的替代選擇。

隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)鉤藤藥理學(xué)研究的不斷深入,確定了鉤藤堿是其發(fā)揮藥理作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ),具有降壓、抗驚厥、抗炎等藥理作用,但關(guān)于鉤藤堿治療炎癥性腸炎作用及其機(jī)制尚待闡明。本研究通過(guò)對(duì)鉤藤堿治療IBD進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析并結(jié)合體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行可行性及機(jī)制探索。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析獲得鉤藤堿與IBD交集靶點(diǎn)共70個(gè),功能學(xué)分析發(fā)現(xiàn),交集靶點(diǎn)可參與跨膜酪氨酸激酶受體蛋白、炎癥反應(yīng)、蛋白酪氨酸激酶活性等過(guò)程。分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)JAK2和JAK1受體蛋白與鉤藤堿結(jié)合最穩(wěn)定,提示鉤藤堿可能通過(guò)調(diào)控JAK2和JAK1靶點(diǎn)進(jìn)而抑制IBD的發(fā)展。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,鉤藤堿可明顯減小IBD小鼠體重下降幅度,升高IBD小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度及重量,降低DAI評(píng)分,抑制結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β、CXCL1、MPO炎癥因子產(chǎn)生,同時(shí)降低小鼠腸道通透性,改善小鼠結(jié)腸炎癥狀,表明鉤藤堿具有治療炎癥性腸炎的潛力。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,0.01～100 mg·L-1鉤藤堿溶液能夠促進(jìn)Caco2細(xì)胞增殖,其中5 mg·L-1的鉤藤堿溶液對(duì)Caco2細(xì)胞增殖作用影響最明顯。此外,鉤藤堿能夠顯著降低細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平,且含量與鉤藤堿給藥濃度成負(fù)相關(guān),表明鉤藤堿能夠顯著改善DSS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷。而NO能使細(xì)胞間的緊密連接松弛進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜的通透性增高,并直接作用于腸黏膜而損傷腸黏膜上皮[16]。本研究對(duì)Caco2細(xì)胞上清液NO水平進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn),鉤藤堿能夠顯著降低Caco2細(xì)胞NO的釋放量,表明鉤藤堿能夠降低腸粘膜通透性,減輕腸黏膜上皮損傷。Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組JAK2和JAK1蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著升高,鉤藤堿干預(yù)后JAK2和JAK1蛋白表達(dá)較模型組顯著降低且呈劑量依賴性,符合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,因此推測(cè)鉤藤堿可能通過(guò)抑制JAK2和JAK1蛋白表達(dá),減輕機(jī)體炎癥反應(yīng),從而發(fā)揮治療IBD的作用。

Fig 13 Effect of rhynchophylline on JAK2 and JAK1 protein expression in Caco2 cells n=3)

既往研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)和趨化等多種生理學(xué)過(guò)程,該通路的活化是IBD發(fā)病的重要特征之一[17]。JAK信號(hào)能夠激PI3K/AKT信號(hào)通路,抑制免疫炎癥反應(yīng)[18]。本研究通過(guò)GO及KEGG分析發(fā)現(xiàn),鉤藤堿-IBD交集靶點(diǎn)與跨膜酪氨酸激酶受體蛋白生物過(guò)程、PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān),推測(cè)鉤藤堿可能通過(guò)調(diào)控JAK信號(hào)進(jìn)而激活PI3K/AKT信號(hào)通路,減輕機(jī)體炎癥反應(yīng),發(fā)揮治療IBD的作用。

綜上所述,本研究采用數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法,從網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)的方向探索了鉤藤堿用于治療炎癥性腸炎的可行性及作用機(jī)制,體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)鉤藤堿可能通過(guò)靶向抑制JAK2和JAK1從而減輕機(jī)體炎癥反應(yīng),發(fā)揮治療IBD的作用。鉤藤堿有望成為JAK抑制劑,治療炎癥性腸炎。