黃 靜,李 永,何 鑫,段文馨,吳文寧

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,安徽 合肥 230032)

抑郁癥是一種常見神經(jīng)精神疾病,據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示,全球抑郁癥患者高達(dá)3.5億,并且在青少年中越來越高發(fā);在新冠疫情暴發(fā)后,抑郁癥的患病人數(shù)更是大幅增加。該病的主要特征是連續(xù)且長期的情緒低落、興趣減退[1],表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)元損傷和植物性癥狀,并且具有很高的自殺傾向[2]。抑郁癥明顯增加了患者家庭及社會的負(fù)擔(dān),嚴(yán)重?fù)p害了人們的生活質(zhì)量。目前,臨床上用于抑郁癥治療的藥物主要包括5-羥色胺再攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)、5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑(serotonin and norepinephrine reuptake inhibitors, SNRIs)、去甲腎上腺素和特異性5-羥色胺能抗抑郁藥(noradrenergic and specific serotonergic antidepressants, NaSSAs)等[3]。然而,由于藥物不良反應(yīng)大、療效不佳等原因使得患者的依從性不高。因此,闡明抑郁癥的潛在發(fā)病機(jī)制,篩選出新的作用靶點(diǎn)和藥物,是目前迫切需要解決的熱點(diǎn)問題,對抑郁癥的治療及臨床合理用藥至關(guān)重要。

DAPT(GSI-IX)是一種小分子γ-分泌酶(γ-secretase)抑制劑,γ-分泌酶是一種高度保守的膜包埋蛋白酶,具有切割受體細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的活性。DAPT作為一種有效的、特異性的γ-分泌酶抑制劑,可以通過間接抑制γ-分泌酶介導(dǎo)的Notch切割來抑制Notch信號通路[4],進(jìn)而影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞分化,還可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡。研究表明,DAPT具有抗炎以及神經(jīng)保護(hù)作用,可用于自身免疫性疾病、淋巴增生性疾病[5]、腎臟疾病[6]、神經(jīng)損傷[7]和癌癥[8]等疾病的治療,改善患者癥狀。最近研究表明,DAPT對改善阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的癥狀起重要作用[9]。但是DAPT對抑郁癥的確切作用及機(jī)制尚未被闡明。因此,本課題通過慢性社會挫敗應(yīng)激(chronic social defeat stress, CSDS)建立小鼠抑郁模型,研究DAPT對小鼠抑郁樣行為的作用,并探究其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠(體質(zhì)量為19～24 g)和雄性CD1小鼠(7～8月齡),均從安徽醫(yī)科大學(xué)SPF級別實(shí)驗(yàn)動物中心處獲得,合格證號分別為:SYXK(皖)2017-006和SYXK(皖)2020-001。實(shí)驗(yàn)所用動物均飼養(yǎng)在12/12 h光暗循環(huán)、恒溫(22～24 ℃)和適當(dāng)濕度(55%～65%)的SPF級別環(huán)境下。本課題涉及到的所有與動物相關(guān)的實(shí)驗(yàn),均依照安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑DAPT(MCE,208255-80-5);NLRP3抗體(兔,Cell Signaling Technology,15101S);ASC抗體(兔,Cell Signaling Technology,67824S);caspase-1抗體(兔,Abcam,ab1872);TNF-α抗體(兔,Abcam,ab6671);p62抗體(兔,Cell Signaling Technology,23214S);Atg5抗體(兔,Cell Signaling Technology,12994S);Atg7抗體(兔,Cell Signaling Technology,8558S);Beclin1抗體(兔,Cell Signaling Technology,3495S);β-actin抗體(小鼠,Affinity,T0022);山羊抗小鼠抗體(中杉金橋,ZB-2305);山羊抗兔抗體(中杉金橋,ZB-2301);Western blot一抗稀釋液(江蘇碧云天生物技術(shù)公司,P0023A);SuperSignalTMWest Femto化學(xué)發(fā)光試劑盒(賽默飛世爾科技公司,34096);IL-1β ELISA試劑盒(ELK Biotechnology,ELK1271);IL-18 ELISA試劑盒(ELK Biotechnology,ELK2269)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器ANY-maze動物行為追蹤分析系統(tǒng)(美國Stoeling公司);Spectra Max 190全波長酶標(biāo)儀(美谷分子儀器公司);Allegra X-15R高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司);Western blot全套實(shí)驗(yàn)裝置(美國Bio-Rad公司);ChemiDocTMMP Imaging System(美國Bio-Rad公司)。

1.4 抑郁模型的建立CSDS是目前最常用的抑郁模型的建立方法,具體方法如下:將一只C57小鼠與一只具有攻擊性的CD1小鼠放在中間用穿孔的透明塑料隔板隔開的鼠籠中,適應(yīng)1～2 d后開始造模。每天拿掉隔板,因體質(zhì)量和月齡的差異,CD1鼠會攻擊C57小鼠,每天允許攻擊時(shí)間為10 min。結(jié)束后用隔板將二者分開,以防身體接觸,但允許視覺、嗅覺和聽覺接觸。24 h后,C57小鼠將接受另一從未接觸過的CD1鼠的攻擊。持續(xù)時(shí)間為10 d,10 d后采用社會接觸實(shí)驗(yàn)篩選出CSDS敏感型小鼠用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.5 行為學(xué)測試

1.5.1社會接觸實(shí)驗(yàn)(social interaction test, SIT) 用于篩選出CSDS模型建立后的敏感型小鼠。在開放箱(48 cm×45 cm×50 cm)一邊的中間位置放入一個(gè)透明的隔離盒(10 cm×6 cm,四周有透氣小孔,用來放CD1小鼠),以隔離盒為中心,在其四周畫出一個(gè)大小為14 cm×26 cm的矩形作為社會接觸區(qū)。第一階段不放入CD1鼠,放入C57實(shí)驗(yàn)小鼠后開始計(jì)時(shí),讓其自由探索2.5 min,記錄實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)入接觸區(qū)的累積時(shí)間。第二階段放入一只從未和實(shí)驗(yàn)小鼠接觸過的CD1鼠,然后再把上一階段的實(shí)驗(yàn)小鼠放入其中,計(jì)時(shí)2.5 min,記錄該階段實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)入接觸區(qū)的累積時(shí)間。社會接觸率等于目標(biāo)存在期小鼠在接觸區(qū)的累積時(shí)間/目標(biāo)缺席期小鼠在接觸區(qū)的累積時(shí)間。

1.5.2曠場實(shí)驗(yàn)(open field test, OFT) OFT是評估小鼠對于新環(huán)境的探索和緊張度及情緒變化的方法。將OFT反應(yīng)箱(96 cm×96 cm×50 cm)平均分成9個(gè)方格。實(shí)驗(yàn)開始前小鼠需要適應(yīng)至少半小時(shí)。首先在安靜的環(huán)境下將小鼠放入反應(yīng)箱中,讓其在箱中自由活動2 min,觀察并記錄小鼠在3 min內(nèi)的移動總距離、穿越規(guī)定的網(wǎng)格線的次數(shù)以及在中間方格區(qū)域停留的時(shí)間等。每只小鼠測試完成后,用75%的酒精清理反應(yīng)箱然后用干抹布擦干。

1.5.3糖水偏愛實(shí)驗(yàn)(sucrose preference test, SPT) SPT是評估小鼠快感缺失程度的指標(biāo)。首先將裝有1%的蔗糖水和普通自來水的2個(gè)水瓶放在同一只鼠的鼠籠上,小鼠自由飲用24 h,在此期間每6 h互換兩個(gè)水瓶的位置,盡量減少小鼠因?yàn)槲恢孟埠枚斐蓽y量結(jié)果的誤差。訓(xùn)練階段結(jié)束后,把所有水瓶取下對所有小鼠斷食斷水12 h。然后將兩個(gè)水瓶分別裝入等體積的1%的蔗糖水和自來水,放在鼠籠上讓小鼠自由飲用12 h,之后測量出每只小鼠的糖水和水的消耗量。糖水偏愛率用糖水消耗量/(糖水消耗量+自來水消耗量)來表示。

1.5.4強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test, FST) FST是評判小鼠絕望程度的指標(biāo)。將小鼠單獨(dú)放在一個(gè)透明的玻璃圓筒中(直徑25 cm),筒內(nèi)裝入30 cm深的水(水溫保持在25 ℃左右),在安靜的環(huán)境下將小鼠放入其中,讓小鼠自由游泳6 min,前2 min為適應(yīng)階段,然后記錄后4 min小鼠的累積不動時(shí)間。

1.5.5懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test, TST) TST同樣是測試小鼠的絕望程度。在小鼠尾部(約1 cm)處用膠帶固定,將其懸掛在測試儀器上,使小鼠頭部距離實(shí)驗(yàn)臺面約15 cm,在安靜的環(huán)境中保持小鼠懸掛6 min,前2 min為適應(yīng)階段,然后記錄后4 min小鼠的不動時(shí)間。

1.6 Western blot檢測行為學(xué)測試結(jié)束后,將各組小鼠處死后取出腦組織,冰上剝離出海馬組織,進(jìn)行冰凍研磨、裂解,按照BCA蛋白濃度定量試劑盒說明書測定蛋白質(zhì)濃度,并根據(jù)濃度算出對應(yīng)的上樣量。具體步驟為:點(diǎn)樣、凝膠電泳(70 V, 1 h; 120 V, 1 h)、轉(zhuǎn)膜(200 mA, 40 min; 200 mA, 1 h)、封閉(5%脫脂奶粉,室溫1 h)、一抗4 ℃孵育過夜(NLRP3、ASC、caspase-1、TNF-α、p62、Atg7、Atg5、Beclin1)、TBST洗膜、孵育對應(yīng)的二抗(室溫1 h)、TBST洗膜,最后將膜放在配好的顯影液中進(jìn)行孵育顯影,保存條帶圖。ImageJ分析軟件進(jìn)行分析,β-actin作為內(nèi)參條帶。

1.7 ELISA檢測取新鮮小鼠海馬組織進(jìn)行冰凍研磨、裂解、離心后取出上清備用。試劑盒和樣本室溫平衡后,打開酶標(biāo)板,每孔加入標(biāo)準(zhǔn)工作緩沖液100 μL或樣品100 μL,37 ℃孵育80 min。之后棄去酶標(biāo)板中液體,每孔加入200 μL洗滌緩沖液,洗滌3次。拍干后每孔加入100 μL生物素化抗體工作液,37 ℃孵育50 min。接著棄去酶標(biāo)板中液體,每孔加入200 μL洗滌緩沖液,洗滌3次。拍干后每孔加入100 μL HRP酶工作液,37 ℃孵育50 min。棄去酶標(biāo)板中液體,每孔加入200 μL洗滌緩沖液,洗滌5次。拍干后每孔加入90 μL TMB,37 ℃孵育20 min。最后在每孔中加入50 μL終止液,450 nm波長下立即讀數(shù)并計(jì)算結(jié)果。

1.8 動物分組與處理在抑郁模型建立的實(shí)驗(yàn)中,將C57BL/6J雄性小鼠分為control組和CSDS組兩組,每組12只小鼠;在研究DAPT抗抑郁的實(shí)驗(yàn)中,將C57BL/6J雄性小鼠分為4組,分別為control組、陰性對照組(DAPT組)、模型組(CSDS組)、抑制劑組(CSDS+DAPT組),每組10只小鼠。DAPT組和CSDS+DAPT組在造模期間每天1次腹腔注射給抑制劑DAPT(5 mg·kg-1)。

2 結(jié)果

2.1 CSDS誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為為了明確DAPT是否具有抗抑郁作用,我們首先通過CSDS建立小鼠抑郁模型。結(jié)果如Fig 1所示,與對照組相比,CSDS處理10 d后小鼠的體質(zhì)量明顯降低,社會接觸率和糖水偏愛率也明顯降低,FST和TST不動時(shí)間顯著增加;同時(shí),在OFT中,CSDS處理組小鼠總的移動距離和在中央?yún)^(qū)域停留的時(shí)間均明顯少于對照組小鼠,這些結(jié)果表明,CSDS誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)明顯的抑郁樣行為,提示抑郁模型建立成功。

Fig 1 CSDS induced depressive-like behavior in n=12)

2.2 DAPT改善CSDS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為接著我們給予小鼠腹腔注射DAPT,觀察其對小鼠抑郁樣行為是否具有改善作用。如Fig 2所示,DAPT處理明顯抑制CSDS誘導(dǎo)的小鼠體質(zhì)量減輕、社會接觸率和糖水偏愛率的降低;同時(shí),在FST和TST中,DAPT處理也明顯縮短了CSDS組小鼠的不動時(shí)間。而DAPT單獨(dú)使用對小鼠的體質(zhì)量、社會接觸率、糖水偏愛率以及強(qiáng)迫游泳、懸尾的不動時(shí)間均無明顯影響,這些結(jié)果表明,DAPT改善了慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為。

Fig 2 DAPT ameliorated CSDS-induced depressive-like behavior in n=10)

2.3 DAPT增加抑郁小鼠的自主活動能力如Fig 3所示,在OFT中,CSDS組小鼠的總移動距離、穿線次數(shù)以及在中央?yún)^(qū)域的總時(shí)間均較對照組明顯減少,而DAPT處理明顯增加CSDS組小鼠總移動距離、穿線次數(shù)以及在中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間,這些結(jié)果表明,DAPT可以改善慢性應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠的自主活動能力減弱。

Fig 3 DAPT increased locomotor activity of depressive-like mice induced by n=10)

2.4 DAPT抑制CSDS誘導(dǎo)小鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體的激活研究表明,NLRP3炎癥小體在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。為了進(jìn)一步探究DAPT抗抑郁癥作用的機(jī)制,我們觀察了其對小鼠海馬NLRP3炎癥小體激活的影響。如Fig 4所示,與對照組相比,CSDS組小鼠海馬組織中NLRP3, ASC和caspase-1的蛋白表達(dá)是明顯上調(diào)的,提示NLRP3炎癥小體被激活,DAPT處理明顯降低了這些蛋白的表達(dá),而DAPT單獨(dú)處理不影響這些蛋白的表達(dá),這表明DAPT抑制了CSDS誘導(dǎo)的海馬NLRP3炎癥小體激活,提示DAPT的抗抑郁作用可能與其抑制NLRP3炎癥小體激活有關(guān)。

Fig 4 DAPT inhibited NLRP3 inflammasome activation in depressive-like mice induced by

2.5 DAPT減輕CSDS誘導(dǎo)小鼠海馬組織中炎癥因子的表達(dá)作為免疫炎癥反應(yīng)過程中的關(guān)鍵信號分子,NLRP3炎癥小體激活可促進(jìn)IL-1β、IL-18、TNF-α等多種致炎因子的成熟釋放,進(jìn)而介導(dǎo)一系列的炎癥反應(yīng),參與包括抑郁癥在內(nèi)的多種炎癥性疾病的發(fā)生。因此,我們進(jìn)一步觀察了DAPT對上述炎癥因子表達(dá)的影響。如Fig 5所示,與對照組相比,CSDS組小鼠海馬TNF-α的蛋白表達(dá)、IL-1β和IL-18水平均明顯升高,DAPT處理能明顯降低CSDS小鼠TNF-α、IL-1β和IL-18的表達(dá),而DAPT單獨(dú)處理不影響這些炎癥因子的表達(dá)。這些結(jié)果表明,DAPT的抗抑郁作用可能是通過抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。

Fig 5 DAPT inhibited expression of inflammatory cytokines in depressive-like mice induced by n=3)

Fig 6 DAPT activated autophagy in hippocampus of depressive-like n=3)

2.6 DAPT增加抑郁小鼠海馬的自噬水平自噬功能的改變是抑郁癥發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)重要因素。因此,為了深入探究DAPT改善慢性應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為的可能機(jī)制,我們觀察了其對自噬相關(guān)蛋白p62、Atg7、Atg5和Beclin1表達(dá)的影響,如Fig 6所示,CSDS組小鼠海馬Atg7、Atg5和Beclin1蛋白表達(dá)水平較對照組明顯降低,p62表達(dá)則明顯增加,DAPT處理則明顯增加CSDS組小鼠Atg7、Atg5和Beclin1蛋白的表達(dá),降低p62表達(dá)水平,而DAPT單獨(dú)處理不影響上述自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),提示DAPT的抗抑郁作用可能與其增加海馬自噬功能相關(guān)。

3 討論

抑郁癥是由多種因素引起的一種情感障礙性疾病,發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前被廣泛認(rèn)可的發(fā)病假說包括單胺能神經(jīng)遞質(zhì)假說、神經(jīng)營養(yǎng)因子假說、下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA軸)假說、細(xì)胞因子假說、線粒體和氧化應(yīng)激假說以及“微生物-腸-腦軸”假說等。其中細(xì)胞因子假說近些年越來越被重視,大量的研究表明炎癥與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān),抑郁癥患者或者動物模型體內(nèi)炎癥水平明顯升高,而抗炎藥物有助于抑郁癥的治療[10-11]。DAPT作為γ-分泌酶的抑制劑,本身具有優(yōu)良的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用,因此我們推測DAPT可能具有抗抑郁作用。為了驗(yàn)證這一猜想,我們通過CSDS建立小鼠抑郁模型,觀察DAPT的抗抑郁作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DAPT明顯抑制CSDS誘導(dǎo)的小鼠社會接觸率和糖水偏愛率的降低,縮短了FST和TST中的不動時(shí)間,并且提高了小鼠的自主活動能力,這些結(jié)果表明DAPT改善了CSDS誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為,具有抗抑郁作用。

炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物,在免疫炎癥反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用。NLRP3炎癥小體是目前研究最廣泛的炎癥小體,包括感應(yīng)分子NLRP3,連接蛋白ASC和效應(yīng)分子pro-caspase-1。NLRP3炎癥小體激活可剪切pro-caspase-1變成caspase-1,進(jìn)而促進(jìn)前致炎因子pro-IL-1β和pro-IL-18的成熟和釋放,參與了腦缺血[12]、神經(jīng)退行性疾病[13]、癲癇[14]等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。最近研究表明,抑郁癥患者血清NLRP3水平是上調(diào)的,并且抑郁小鼠腦內(nèi)NLRP3炎癥小體也是被激活的[15],而抑制NLRP3炎癥小體的激活具有抗抑郁作用,提示NLRP3炎癥小體在抑郁癥的病理過程中扮演重要角色。因此,為了研究DAPT的抗抑郁作用機(jī)制,我們觀察了其對NLRP3炎癥小體的影響。結(jié)果顯示,DAPT能明顯抑制CSDS誘導(dǎo)的小鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體復(fù)合物(NLRP3、ASC、caspase-1)和炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-18表達(dá)的增加,這些表明DAPT能阻斷抑郁小鼠腦內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),提示DAPT的抗抑郁作用可能與其抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

自噬是亞細(xì)胞水平的“自我吞噬”,可通過形成自噬溶酶體降解受損的大分子和細(xì)胞器,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身代謝和某些細(xì)胞器的更新。生理性自噬在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起重要作用,自噬失調(diào)則會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究表明,自噬在衰老、免疫、腫瘤發(fā)生及神經(jīng)退行性疾病[16-17]等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。最近研究表明,抑郁小鼠腦內(nèi)自噬水平是下調(diào)的,激活自噬能改善應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為[18],提示自噬與抑郁癥發(fā)生密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究DAPT抗抑郁的作用機(jī)制,我們觀察了其對小鼠海馬自噬功能的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),DAPT抑制了CSDS誘導(dǎo)的小鼠海馬自噬相關(guān)蛋白Atg7、Atg5和Beclin1表達(dá)的降低和p62蛋白表達(dá)的升高,表明DAPT增加了抑郁小鼠海馬自噬功能,提示DAPT可能是通過提高海馬自噬功能來改善小鼠抑郁樣行為的。

綜上所述,本研究通過CSDS建立小鼠抑郁模型,探究DAPT對慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為的作用及其機(jī)制。結(jié)果證實(shí)DAPT能改善CSDS誘導(dǎo)的抑郁樣行為,其機(jī)制可能與抑制小鼠海馬組織中NLRP3炎癥小體激活以及提高自噬功能有關(guān)。我們的研究為探究抑郁癥的發(fā)生機(jī)制提供新思路,并為抑郁癥臨床藥物的開發(fā)提供新的藥物靶點(diǎn)。