胡凱超,高 巖,何佳琦,楚世峰,張 釗,陳乃宏

(1.中國醫(yī)學科學院藥物研究所 神經(jīng)科學中心,天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室,北京 100050;2.天津中醫(yī)藥大學中藥學院,天津 301617)

缺血性腦卒中約占腦卒中患病人口總數(shù)的87%,是由腦部血管堵塞引起的腦組織缺血、缺氧性腦損傷,具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率等特點,給社會和家庭造成沉重負擔[1]。迄今為止,唯一被FDA批準治療缺血性腦卒中的溶栓藥物重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)具有治療時間窗短,易引發(fā)出血轉(zhuǎn)化等缺點[2],而在血流恢復(fù)后神經(jīng)系統(tǒng)又會遭受到不同程度的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷,包括線粒體功能障礙、興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凋亡、鐵死亡[3]等其他病理過程[4]。因此,針對I/R損傷的關(guān)鍵步驟去尋找有效的神經(jīng)保護劑對缺血性腦卒中的治療具有重要意義。

近年來許多研究表明,鐵死亡參與腦缺血進程中神經(jīng)細胞的損傷[5]。其主要機制是,在二價鐵或酯氧合酶的作用下,催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸,發(fā)生脂質(zhì)過氧化,從而誘導(dǎo)細胞死亡[6]。具體來說,鐵死亡表現(xiàn)出獨特的形態(tài)特征,如線粒體收縮和線粒體膜密度增加、外部膜破裂、內(nèi)部膜壓縮和完整的細胞核。在分子水平上,表現(xiàn)為鐵蓄積式鐵離子失衡和細胞內(nèi)谷胱甘肽(glutathione,GSH)耗竭,以及谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)失活,并伴有脂質(zhì)過氧化物水平升高,最終導(dǎo)致細胞膜損傷和細胞死亡[7]。在參與調(diào)控鐵死亡信號通路中,核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信號通路與鐵死亡的發(fā)生機制具有高度的相關(guān)性。Nrf2入核后促進轉(zhuǎn)錄的多個基因在防止鐵死亡的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用,包括胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(cystine/glutamate transporter,SLC7A11,xCT)、鐵蛋白輕重鏈,甚至GPX4本身,都是Nrf2的靶基因[8]。表明針對Nrf2的調(diào)控為抗缺血性腦卒中鐵死亡的重要途徑。

人參皂苷Rg1是一種四環(huán)三萜類衍生物(Fig 1A),是人參的主要活性成分。最近的許多研究認為它是最有效的抗中風候選藥物之一[9-10]。Rg1對實驗性急性缺血性卒中有明顯療效,表現(xiàn)為其縮小梗死體積、減輕間質(zhì)水腫程度和改善神經(jīng)評分的能力,但是其根本的機制仍然在探索中[11]。前期研究證明,Rg1可以通過促進Nrf2入核,激活含有抗氧化反應(yīng)元件的基因的轉(zhuǎn)錄,增加抗氧化酶的表達,從而減輕I/R后的氧化應(yīng)激[12]。但其能否上調(diào)GPX4蛋白表達,進而減輕缺血性腦卒中引起的神經(jīng)細胞鐵死亡尚未有報道。因此,我們針對Rg1對缺血性腦卒中后神經(jīng)元鐵死亡的影響及其相關(guān)機制展開進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SD大鼠,雄性,體質(zhì)量(260～280) g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(清潔級,合格證編號:SCXK(京)2021-0011),購入后飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院藥物研究所動物房,室溫維持在(26±2)℃,相對濕度(55±5)%,12 h /12 h光照/避光循環(huán),自由攝食與飲水。

1.1.2細胞株 HT22小鼠海馬神經(jīng)元細胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天傳代,供后續(xù)實驗使用。

1.1.3藥品與試劑 人參皂苷Rg1(上海源葉生物科技有限公司,B21057,純度HPLC≥98%);ML385(索萊寶,IM1020);Ferrostatin-1(Fer-1)(MACKLIN,F864515);CCK-8(索萊寶,CA1210);Anti-GPX4抗體(Abcam公司,ab125066);Anti-Nrf2抗體(Abcam公司,ab76026);Anti-xCT抗體(ABclonal,A2413);Anti-β-actin抗體(Sigma,A5441);Anti-Rabbit IgG (H+L)抗體(KPL,5450-0010);Anti-Mouse IgG (H+L)抗體(KPL,5450-0011);Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fluor594(affinity,S0006);GSH/GSSG試劑盒(同仁化學,G263),MDA試劑盒(同仁化學,M496),SOD試劑盒(同仁化學,S311),Fe2+試劑盒(北京普利來基因技術(shù)有限公司,E1042)。

1.1.4儀器 小動物呼吸麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);MCAO栓線(北京西濃科技有限公司);高速組織研磨儀(康濤科技);ECL發(fā)光儀(GE公司,Amersham Imager 680);DYY-7C型垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置及蛋白電泳系統(tǒng)電源(北京六一儀器廠);Milli-Q plus超純水儀(Millipore公司);透射電子顯微鏡(日本電子株式會社,JEM-1200EX);倒置熒光生物顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司,DSY2000X);三氣培養(yǎng)箱(Heal Force,HF100);熒光酶標儀(美谷分子儀器有限公司,SpectraMax iD3)。

1.2 方法

1.2.1動物分組、模型制備及給藥 將20只SD雄性大鼠隨機分為sham組、MCAO組、MCAO+Rg1(40 mg·kg-1)組及MCAO+Fer-1(0.2 mg·kg-1)組,每組各5只。sham組分離CCA、ECA、ICA,不插入線栓,其余與MCAO組相同。MCAO造模90 min后拔栓,同時立即尾靜脈注射生理鹽水,Rg1或Fer-1。24 h后進行神經(jīng)行為學檢測,隨后取材。

1.2.2神經(jīng)行為學評分Zea Longa法 造模完成后24 h,提鼠尾離開地面約一尺,觀察兩前肢狀況;將大鼠置于地面,觀察行走情況。采用5級評分法(0～5分),分數(shù)越高說明其神經(jīng)行為損傷越重。0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:不能伸展對側(cè)前爪;2分:身體向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分:身體向?qū)?cè)傾倒;4分:意識喪失,不能自發(fā)行走;5分:動物死亡。

1.2.3神經(jīng)行為學評分Garcia Test 造模完成后24 h,通過Garcia Test評價神經(jīng)功能。Garcia Test是由7個獨立測試組成,分別為自發(fā)活動、腹部感覺、觸須反應(yīng)、肢體對稱性、側(cè)身轉(zhuǎn)向、前肢爬行、攀爬。每個單獨測試的表現(xiàn)按0(表現(xiàn)最差)至3(表現(xiàn)最好)的等級評分,以得分(max=21)的總和評價大鼠的神經(jīng)功能,評分越低,造模越嚴重[13]。

1.2.4透射電鏡觀察神經(jīng)細胞線粒體 大鼠神經(jīng)功能評分完成后,腹腔注射水合氯醛(400 mg·kg-1)麻醉,心臟灌注PBS沖洗,4%多聚甲醛溶灌流固定,完成后斷頭取腦,取皮質(zhì)半暗帶組織,修剪成1 mm3大小的組織塊,電鏡固定液中4 ℃保存過夜。通過分級乙醇系列脫水后,將細胞包埋在樹脂中過夜。超薄切片隨后用檸檬酸鉛染液和醋酸雙氧軸染液染色。使用透射電子顯微鏡收集圖像。

1.2.5Western blot實驗 大鼠神經(jīng)功能評分完成后,腹腔注射水合氯醛麻醉,斷頭取腦,冰上分離皮質(zhì)半暗帶區(qū)域,立即于-80 ℃凍存。取出提取皮質(zhì)或細胞總蛋白,BCA試劑盒定量,SDS-PACE凝膠電泳,10%分離膠分離。轉(zhuǎn)膜,5%BSA封閉2 h,根據(jù)目標蛋白分子量裁膜,分別加入對應(yīng)一抗(GPX4,1 ∶5 000;xCT,1 ∶2 000;Nrf2,1 ∶2 000;β-actin,1 ∶10 000),4 ℃過夜。TBST洗膜10 min,重復(fù)3次,加入二抗(1 ∶5 000),室溫孵育2 h,回收二抗,TBST洗膜10 min,重復(fù)3次,ECL儀曝光成像。

1.2.6OGD/R誘導(dǎo)HT22細胞損傷模型及Rg1給藥 對數(shù)生長期細胞以5×103/孔密度接種于96孔板內(nèi),正常培養(yǎng)24 h后,更換為Earle's平衡鹽溶液并置于三氣培養(yǎng)箱(94%N2、5%CO2和1%O2)進行低氧培養(yǎng),時間為2 h、4 h、6 h和8 h;缺氧完成后更換完全培養(yǎng)基,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)24 h。CCK-8法檢測細胞活力,根據(jù)實驗結(jié)果確定HT22細胞OGD/R最佳時間。最終確定后續(xù)實驗中,OGD 8 h后,模型組更換為完全培養(yǎng)基,Rg1組更換為含不同濃度Rg1的完全培養(yǎng)基,正常培養(yǎng)24 h。

1.2.7CCK-8法檢測細胞活力 細胞培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)板取出,每孔避光加入10 μL CCK-8溶液在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h,用酶標儀測定在450 nm處的吸光度,計算細胞活力。

1.2.8細胞內(nèi)GSH/GSSG含量檢測 收集處理后的各組細胞樣品,凍融裂解細胞后,8 000×g離心10 min,上清分為兩份,分別加入掩蔽劑作為GSSG樣品管和ddH2O作為總谷胱甘肽樣品管,隨后加入工作液在37 ℃培養(yǎng)10 min。用酶標儀在405 nm或415 nm下測定吸光度。根據(jù)標注曲線分別計算出總谷胱甘肽和GSSG的濃度。樣品中GSH濃度使用以下公式計算:GSH=總谷胱甘肽(GSH+GSSG)-GSSG×2。

1.2.9細胞內(nèi)MDA含量檢測 收集處理后的各組細胞樣品,離心后去除上清,加入Antioxidant PBS solution吹打裂解,再加入Lysis Buffer充分渦旋后靜置5 min。取10 μL用BCA法進行蛋白質(zhì)定量。各微管中加入Working solution,渦旋振蕩器充分混勻。在95 ℃,反應(yīng)15 min。冰浴上冷卻5 min,10 000×g離心10 min。取上清加至96孔板黑板中。用熒光酶標儀檢測檢測熒光強度(Ex:540 nm,Em:590 nm)。根據(jù)MDA的標準曲線計算樣品中的MDA濃度,并用蛋白濃度進行校準。

1.2.10細胞內(nèi)SOD含量檢測 冰浴超聲破碎HT22細胞(60 W,0.5 s間隔,15 min)后,4 ℃ 10 000×g離心15 min,上清液制成樣品溶液。取10 μL樣品用于BCA蛋白定量。樣品加入WST工作液,酶工作液,混勻。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。用酶標儀在450 nm處讀數(shù)。按說明書計算SOD活性。

1.2.11細胞內(nèi)Fe2+含量檢測 HT22細胞加入裂解液,置于搖床裂解2 h。取10 μL樣品裂解液用BCA蛋白定量。樣品加入高錳酸鉀溶液與緩沖液,混勻,60 ℃孵育1 h。冷卻至室溫,加入鐵離子檢測劑,混勻,室溫孵育30 min。取200 μL于96孔板,在550 nm測定吸光度。繪制標準曲線并計算鐵離子濃度。

1.2.12細胞免疫熒光 將生長狀態(tài)良好的HT22細胞以2×104/孔密度接種在24孔板內(nèi)的圓形蓋玻片上,按上述OGD/R方法造模。完成后棄掉培養(yǎng)液,用冰浴的PBS洗1次,加入適量4%多聚甲醛冰上固定20 min,棄去多聚甲醛,PBS輕輕洗3次。加入0.5% TritonX-100/PBS透化10 min,棄掉Triton,PBS輕輕洗3次。加5% BSA封閉30min,隨后加一抗(GPX4,1 ∶200),4 ℃孵育過夜。回收一抗,加PBS,放在搖床上慢速搖晃5 min,重復(fù)3次,加二抗[Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Fluor594,1 ∶200]室溫避光孵育2 h。回收二抗,PBS搖床洗3次,每次5 min。用DAPI染色液在室溫下孵育10 min染色細胞核,再次用PBS搖床洗3次,每次5 min。取3 μL 90%甘油滴于載玻片上,用鑷子夾取蓋玻片,反扣于甘油上,指甲油封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 Rg1可改善HT22細胞OGD/R模型的存活率Rg1結(jié)構(gòu)式如Fig 1A所示,CCK-8檢測結(jié)果表明,實驗濃度范圍內(nèi)的Rg1對正常HT22細胞的存活率均無影響(Fig 1B)。隨后我們檢測不同氧糖剝奪時間對HT22細胞活力的影響,HT22細胞存活率隨OGD時間增加逐漸下降,當OGD 8 h時,細胞存活率為55.07%±0.83%(Fig 1C)。后續(xù)研究選擇OGD培養(yǎng)8 h,復(fù)氧24 h作為HT22細胞的OGD/R造模條件。如Fig 1D所示,加入Rg1后,細胞存活率明顯上升。Rg1濃度在0.1～10 μmol·L-1檢測范圍相較模型組均具有顯著性,Rg1濃度為10 μmol·L-1時保護效果最佳,HT22細胞的存活率為81.4%± 5.73%(P<0.001)。

2.2 Rg1可抑制HT22細胞OGD/R模型引起的鐵死亡OGD/R損傷后HT22細胞GSH/GSSG比值顯著降低(P<0.05),而Rg1劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果,在10 μmol·L-1時效果最佳,上調(diào)OGD/R后HT22細胞GSH/GSSG比值(P<0.001)(Fig 2A);OGD/R損傷后SOD活性明顯降低(P<0.05),Rg1(10 μmol·L-1)能恢復(fù)SOD活性(P<0.01)(Fig 2B);此外,OGD/R后HT22細胞MDA(P<0.001)和Fe2+(P<0.01)含量明顯上升,Rg1(1,10 μmol·L-1)能明顯下調(diào)OGD/R損傷后HT22細胞MDA(P<0.05或P<0.001)(Fig 2C)和Fe2+(P<0.05)(Fig 2D)的含量。為研究Rg1影響OGD/R后HT22細胞鐵死亡的機制,本研究采用Western blot檢測了HT22細胞GPX4、xCT蛋白表達情況,結(jié)果表明OGD/R能降低HT22細胞GPX4和xCT(Fig 3B)蛋白的表達(P<0.01),提示OGD/R增加HT22細胞鐵死亡敏感性,Rg1給藥后,HT22細胞GPX4、xCT蛋白表達均有顯著性的提高,且在10 μmol·L-1濃度時效果最佳(P<0.01)。說明Rg1能顯著逆轉(zhuǎn)OGD/R導(dǎo)致的HT22細胞鐵死亡敏感性增強。為了進一步驗證Rg1降低OGD/R誘導(dǎo)HT22細胞鐵死亡敏感性的作用,我們采用免疫熒光觀察GPX4蛋白表達的變化。結(jié)果表明OGD/R處理后HT22細胞GPX4蛋白熒光信號明顯變?nèi)?而隨著Rg1劑量增高,GPX4信號增強(Fig 3C),這與Western blot結(jié)果一致。

2.3 Nrf2介導(dǎo)Rg1對OGD/R后HT22細胞鐵死亡的抑制作用Nrf2是GPX4和xCT的上游轉(zhuǎn)錄因子,為研究Rg1是否能上調(diào)Nrf2含量,采用Western blot檢測Rg1給藥后Nrf2蛋白水平的變化,結(jié)果表明Rg1給藥后HT22細胞Nrf2蛋白表達明顯上調(diào)(Fig 4B),且在10 μmol·L-1濃度時效果最佳(P<0.01)。為了驗證Nrf2在Rg1抑制OGD/R處理HT22細胞鐵死亡中的作用,加入小分子抑制劑ML385,其可抑制Nrf2與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。結(jié)果表明,加入ML385(10 μmol·L-1)后,Rg1(10 μmol·L-1)對OGD/R后HT22細胞存活率(Fig 4C)以及GPX4和xCT(Fig 4E)蛋白的上調(diào)作用均被抑制,提示Rg1通過促進Nrf2/xCT/GPX4通路,減少OGD/R后HT22細胞鐵死亡。

Fig 1 Effect of ginsenoside Rg1 on survival rate of HT22 cells induced by

2.4 Rg1可改善MCAO大鼠神經(jīng)功能我們采用大鼠MCAO模型驗證Rg1在體水平對腦卒中的保護作用,實驗設(shè)計如Fig 5所示。MCAO模型缺血1.5 h,再灌注24 h后,采用Zea Longa法以及Garcia Test對大鼠進行神經(jīng)行為學評分。結(jié)果顯示與sham組相比,MCAO組大鼠Zea Longa和Garcia Test(Tab 1)評分差異均有顯著性(P<0.001),而在Rg1(40 mg·kg-1)或Fer-1(0.2mg·kg-1)給藥后神經(jīng)行為學評分均有明顯的改善。

2.5 Rg1改善MCAO大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞線粒體鐵死亡典型特征為了檢測Rg1對MCAO大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞鐵死亡的影響,我們?nèi)∪毖氚祹Ц浇M織,采用透射電子顯微鏡觀察各組細胞線粒體微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,sham組大鼠皮層神經(jīng)細胞狀態(tài)良好,胞質(zhì)分布均勻,線粒體形態(tài)正常。與sham組相比,MACO組大鼠細胞電鏡下出現(xiàn)線粒體外膜破裂、線粒體皺縮、嵴減少、膜致密等鐵死亡典型特征;MCAO+Rg1組和鐵死亡抑制劑MCAO+Fer-1組神經(jīng)細胞線粒體外膜均未見破裂,收縮明顯逆轉(zhuǎn),且線粒體嵴未見嚴重損傷(Fig 6)。

Fig 2 Effect of ginseng Rg1 on content of ferroptosis markers in HT22 cells induced by

Fig 3 Effect of ginsenoside Rg1 on content of ferroptosis-related proteins in HT22 cells induced by OGD/R

Fig 4 Effect of Nrf2 on inhibitory effect of Rg1 on ferroptosis in HT22 cells after

Fig 5 Schematic diagram of MCAO modeling,administration and sampling in rats

Tab 1 Effect of ginsenoside Rg1 on Zea Longa and Garcia Test scores in MCAO

2.6 Rg1對MCAO大鼠皮質(zhì)腦組織鐵死亡相關(guān)蛋白的影響Western blot實驗進一步檢測Rg1對MCAO模型中鐵死亡相關(guān)蛋白的影響,結(jié)果顯示,與sham組相比,MCAO組大鼠皮質(zhì)腦組織內(nèi)鐵死亡負調(diào)節(jié)蛋白GPX4(P<0.05)和xCT(P<0.05)(Fig 7B)水平明顯降低;與MCAO組相比,MCAO+Rg1組大鼠皮質(zhì)腦組織GPX4蛋白表達增加(P<0.05)、xCT蛋白表達明顯增加(P<0.01),MCAO+Fer-1組GPX4(P<0.05)蛋白以及xCT(P<0.01)蛋白表達也明顯上升。Rg1處理組對鐵死亡相關(guān)蛋白的上調(diào)效果與鐵死亡抑制劑Fer-1組相當,動物水平上驗證Rg1具有改善卒中后神經(jīng)元鐵死亡的作用。

Fig 7 Effect of ginsenoside Rg1 on ferroptosis-related proteins in cortical tissue of MCAO rats

3 討論

人參和三七在臨床治療缺血性腦卒中的復(fù)方和中成藥中占比巨大[14],人參皂苷Rg1為二者共有的主要活性成分,是通心絡(luò)膠囊、血栓心寧片等中成藥的共同有效成分,具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景[15-16]?，F(xiàn)代藥理研究表明,人參皂苷Rg1可改善動物局灶性腦缺血引起的神經(jīng)損傷、腦梗死體積和血腦屏障通透性,其主要機制是通過抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥觸發(fā)的細胞凋亡與壞死程序[11]。既往研究報道,神經(jīng)元死亡的主要原因是壞死、凋亡、自噬、焦亡等,但這些機制均不能完全解釋缺血性腦卒中引起的腦損傷,鐵死亡作為一種新型的細胞死亡方式,被證實參與腦卒中損傷的生理病理過程[5]。在實驗性中風動物模型中,鐵螯合劑、Liproxstatin-1、Ferrostatin-1等鐵死亡抑制劑均能有效的減少缺血性卒中后的再灌注損傷來改善神經(jīng)預(yù)后[17]。提示抑制神經(jīng)細胞鐵死亡可能成為治療缺血性腦卒中的有效手段。而Rg1對缺血性腦卒中的保護作用是否與抑制細胞鐵死亡有關(guān)還未見報道,因此,本實驗對Rg1影響缺血性腦卒中后神經(jīng)細胞鐵死亡的作用進行研究。

OGD/R模型是模擬體內(nèi)缺血/缺氧/再灌注情況較理想的模型,HT22細胞是小鼠神經(jīng)元細胞系,體外研究谷氨酸毒性誘導(dǎo)鐵死亡的良好模型,因此本實驗采用OGD/R誘導(dǎo)HT22細胞模擬體內(nèi)缺血再灌注的情況,研究Rg1對缺血性腦卒中神經(jīng)元的保護作用[18]。結(jié)果表明在OGD 8 h/R 24 h時,HT22細胞存活率明顯降低,而10、1和0.1 μmol·L-1的Rg1均能提高OGD/R后細胞存活率,并隨著Rg1濃度的增加而升高,所以后續(xù)研究選擇10、1和0.1 μmol·L-1作為Rg1的高,中和低劑量濃度。實驗發(fā)現(xiàn)OGD/R損傷后HT22細胞GSH/GSSG比值明顯降低,SOD活性減弱,而Rg1改變了這一結(jié)果,上調(diào)了OGD/R后HT22細胞GSH/GSSG比值,恢復(fù)了SOD活性。此外,OGD/R后HT22細胞內(nèi)MDA與Fe2+明顯升高,Rg1降低了MDA和Fe2+的水平,提示Rg1降低了OGD/R后HT22細胞鐵死亡的相關(guān)指標,減少了細胞鐵死亡。GPX4是細胞鐵死亡的核心負調(diào)控蛋白,GPX4能降解小分子過氧化物和某些脂質(zhì)過氧化物,抑制脂質(zhì)過氧化。GPX4表達下調(diào)則會對鐵死亡更敏感;相反,若上調(diào)GPX4的表達,則會產(chǎn)生對鐵死亡的耐受[3]。xCT蛋白負責攝入胱氨酸,參與GSH的合成,GSH又是GPX4降解脂質(zhì)過氧化物的底物,起到抗氧化和抵抗鐵死亡的作用(Fig 8)。實驗發(fā)現(xiàn)OGD/R能降低HT22細胞GPX4和xCT蛋白的表達,進一步說明OGD/R會誘導(dǎo)HT22細胞鐵死亡。Rg1給藥能恢復(fù)HT22細胞GPX4和xCT蛋白表達。說明Rg1能明顯降低OGD/R損傷后HT22細胞鐵死亡的敏感性。Nrf2能促進GPX4和xCT基因的轉(zhuǎn)錄。實驗發(fā)現(xiàn)Rg1能促進OGD/R后HT22細胞Nrf2的表達。在加入抑制Nrf2與DNA結(jié)合的小分子抑制劑ML385后,Rg1提高OGD/R后HT22細胞存活率,上調(diào)GPX4和xCT蛋白表達的作用被抵消,提示Rg1可能通過促進Nrf2/GPX4/xCT通路,減少OGD/R后HT22細胞鐵死亡。

Fig 8 Schematic diagram of protective mechanism of Rg1 on neuronal ferroptosis induced by MCAO or OGD/R

此外,我們前期研究還發(fā)現(xiàn),Rg1可降低MCAO大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元靶向Nrf2的miR-144含量,增強Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性,但其是否能上調(diào)GPX4和xCT蛋白的表達尚未可知[12]。在本實驗中,Rg1能上調(diào)MCAO大鼠皮質(zhì)腦組織GPX4和xCT蛋白的表達,緩解神經(jīng)元線粒體形態(tài)損傷,并改善MCAO后大鼠神經(jīng)功能。提示Rg1可能通過促進Nrf2/xCT/GPX4通路抑制MCAO大鼠神經(jīng)元鐵死亡。

綜上,人參皂苷Rg1可通過促進Nrf2/xCT/GPX4通路抑制缺血性腦卒中神經(jīng)元鐵死亡(Fig 8)。本課題研究進一步闡明并完善人參皂苷Rg1治療缺血性腦卒中的相關(guān)作用機理,為以抑制鐵死亡作為缺血性腦卒中的治療手段以及為Rg1治療缺血性腦卒中的開發(fā)應(yīng)用提供了理論參考和實驗依據(jù)。