王劭文,周亞男,孫 毅,蘇瑞斌

(1.南京中醫(yī)藥大學,江蘇 南京 210000;2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所,抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室,北京 100850)

經典致幻劑(psychedelics)是一種作用于五羥色胺2A受體(serotonin 2A receptor, 5-HT2AR)而發(fā)揮致幻效應的精神活性物質[1],主要包括麥角酸二乙酰胺(lysergic acid diethylamide, LSD)、 2, 5-二甲氧基-4-甲基苯丙胺(2,5-dimethoxy-4-methylamphetamine, DOM)、裸蓋菇素(psilocybin)及其代謝產物脫磷酸裸蓋菇素(psilocin)等。近年的研究表明,經典致幻劑有調節(jié)精神狀態(tài)的作用,臨床具有治療抑郁癥、焦慮癥[2]、抗成癮[3]等的潛能,其中Psilocybin被美國 FDA指定為重度抑郁癥突破性治療藥物,已進入二期臨床試驗。然而,由幻覺效應導致的精神錯亂、沖動性行為等副作用是影響致幻劑臨床安全性的重大風險。因此,探究致幻劑作用機制,以規(guī)避致幻劑臨床副作用,是推動致幻劑臨床應用的重要方向。

動物實驗顯示,經典致幻劑可引起小鼠和大鼠誘導甩頭反應(head-twitch response, HTR)。甩頭反應是嚙齒類動物的頭部快速的左右運動行為[4],是目前經典致幻劑研究中使用最多的動物模型,甩頭反應與人類的幻覺反應密切相關[5]。經典致幻劑誘導甩頭行為的分子機制目前文獻報道較少,研究發(fā)現,經典致幻劑激活5-HT2AR后,通過激活下游多種信號分子來發(fā)揮作用[6],而由于經典致幻劑誘導甩頭行為的作用時間較快,目前研究普遍發(fā)現動物給藥后5 min內就會誘導甩頭反應[4],短時間內蛋白水平難以發(fā)生明顯變化,蛋白質的修飾變化可能在其中發(fā)揮了重要作用[7]。蛋白質翻譯后修飾主要包括磷酸化、乙?；头核鼗揎棥５鞍踪|磷酸化修飾是一種廣泛存在的翻譯后修飾類型,主要發(fā)生在信號轉導通路、發(fā)育分化、癌癥機理等研究領域[8]。乙?；堑鞍踪|功能的主要調節(jié)機制,主要參與細胞代謝[9]和轉錄調控[10]等。泛素化修飾介導大部分蛋白質的降解[11]。

5-HT2AR主要存在于前額葉皮層,為經典致幻劑的主要作用部位,前額葉皮層也與認知和信息處理等高級功能密切相關[12],因此我們選擇前額葉皮層為研究對象。為探究經典致幻劑的幻覺等急性藥理效應是否與蛋白質修飾有關,本研究建立致幻劑誘導的大鼠甩頭反應動物模型,通過檢測大鼠前額葉皮層中蛋白質磷酸化、乙?；头核鼗盒揎椬兓瘉硖骄繀⑴c大鼠甩頭反應的蛋白質修飾類型,為探究經典致幻劑誘導甩頭反應的分子機制研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級Sprague-Dawley大鼠,♂,體質量(180～230)g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號SCXK(京)2019-0010。動物倫理學審查編號:IACUC of AMMS-06-2019-007。

1.2 試劑及抗體LSD、DOM(軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所,自制,純度>99%)、Psilocin(軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所,自制,純度>99%); P-Threonine抗體(杭州景杰生物科技股份有限公司,PTM-705RM)、P-Serine 抗體(Abcam,ab9332)、P-Tyrosine抗體(杭州景杰生物科技股份有限公司,PTM-702RM)、Ubiquitin抗體(杭州景杰生物科技股份有限公司,PTM-5798)、Acetyllysine抗體(杭州景杰生物科技股份有限公司,PTM-105RM)、二抗均購自Jackson ImmunoResearch公司;RIPA裂解液(北京普利萊基因技術有限公司,C1053-100);Cocktail(Roche,04693116001)、PhosStop(Roche,4906845001)、Trichostatin A(上海陶術生物科技有限公司,T6270)、Nicotinamide(上海陶術生物科技有限公司,T0934)、PR-619(Selleck,S7130);BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司,P1511)、蛋白上樣緩沖液(北京博邁德基因技術有限公司,PA124-01)、顯影液(Millipore,P90720)。

1.3 儀器和工具透明箱(25 cm×25 cm×25 cm);手術剪(直)、眼科鑷(彎)、咬骨鉗、咬骨剪、手術刀、大鼠腦模具、彎鑷;高通量組織研磨器(QIAGEN TissueLyserⅡ)、DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠,2085943),顯影儀(上海天能科技有限公司,5200)。

1.4 方法

1.4.1甩頭反應實驗 將大鼠隨機分為對照組(VEH)和給藥組(LSD、DOM、Psilocin)。均采用腹腔注射方式,給藥體積為0.2 mL/200 g。LSD、DOM和Psilocin溶于生理鹽水,VEH為等量生理鹽水。LSD(0.025、0.1、0.5 mg·kg-1)、DOM(0.5、1、3、4、5、6 mg·kg-1)、Psilocin(0.25、0.5、2、4 、8 mg·kg-1)和 VEH單次給藥后立即將大鼠置于觀察箱,記錄給藥10 min或30 min內大鼠的總甩頭次數。

1.4.2組織樣本解剖 根據大鼠腦圖譜及腦模具,選擇前囟5.16～3.16 mm、3.16～0.16 mm兩個部分各切2 mm、3 mm腦片(Fig 1示藍色三角形部位)。樣本置于凍存管,液氮或-80 ℃保存。

Fig 1 Anatomical diagram of prefrontal cortex in rats

1.4.3蛋白提取 分別提取各樣本中的全部蛋白。在RIPA裂解液中加入相應的蛋白修飾抑制劑,PhosStop每10 mL提取液中加入1片,cocktail每50 mL提取液中加入1片。磷酸化蛋白使用cocktail和PhosStop進行抑制,乙?；鞍资褂胏ocktail、Trichostatin A(3 μmol·L-1)和Nicotinamide(50 mmol·L-1)進行抑制,泛素化蛋白使用cocktail和PR-619(50 μmol·L-1)進行抑制。各組加入2顆小鋼珠,使用高通量組織研磨器進行組織研磨。取100 μL上清,進行BCA 蛋白測定,檢測各組上清液的蛋白濃度,再提取500 μL上清液加入125 μL 5×蛋白上樣緩沖液,煮沸變性后分裝放于-80 ℃冰箱保存。

1.4.4蛋白質免疫印跡(Western blot) 上樣前再次煮沸10 min,將樣品濃度調至2 g·L-1,每孔上樣10 μL,使用15孔10% SDS-PAGE凝膠在80 V和120 V恒壓下進行電泳,200 mA恒流下選擇適當時間將蛋白轉移至PVDF膜,使用5% BSA室溫封閉2 h,加入相應稀釋于5% BSA的特異性一抗(1 ∶1 000) 4 ℃冰箱孵育過夜,洗膜3次,每次5 min。加入5% BSA稀釋的相應二抗(1 ∶1 000),室溫孵育1 h,洗膜后使用ECL顯影液進行曝光顯影。

2 結果

2.1 經典致幻劑誘導大鼠甩頭反應大鼠腹腔給予溶劑和不同濃度的致幻劑后,記錄30 min內的甩頭次數(Fig 2A)。結果顯示,與VEH組比較,LSD在0.025 mg·kg-1劑量下甩頭次數明顯升高(P<0.001,Fig 2B); DOM在3 mg·kg-1劑量下甩頭次數明顯升高(P<0.0001,Fig 2C); Psilocin在8 mg·kg-1劑量下甩頭次數明顯升高(P<0.05,Fig 2D)。因此,我們選擇LSD (0.025 mg·kg-1)、DOM (3 mg·kg-1) 和 psilocin (8 mg·kg-1)的劑量腹腔注射建立動物模型并進行接下來的研究。已有研究證明,經典致幻劑誘導甩頭反應的量效曲線為倒“U“型[13],在我們的實驗體系中,DOM和LSD誘導的甩頭次數符合這一特點。

2.2 經典致幻劑給藥10 min時誘導大鼠前額葉皮層蛋白質修飾變化大鼠腹腔給藥溶劑和致幻劑后,甩頭10min 時取大鼠前額葉皮層進行蛋白質修飾檢測(Fig 3A)。Western blot結果顯示,與VEH組相比,LSD、DOM和Psilocin組在蛋白質絲氨酸和蘇氨酸修飾上有較明顯的上調或下調趨勢。在蛋白質絲氨酸變化中,在給藥致幻劑LSD和DOM后,在50～55 ku條帶相較VEH組上調,Psilocin沒有明顯上調趨勢;在蛋白質蘇氨酸變化中,在55～100 ku的條帶處相較VEH組明顯上調。180～100、36 ku處致幻劑給藥組(LSD、DOM、Psilocin)相較VEH組呈下降趨勢。Psilocin組從55～250 ku部分相較VEH組呈下降趨勢;酪氨酸的磷酸化修飾沒有明顯差異。蛋白的乙酰化和泛素化修飾未見明顯變化(Fig 3B)。結果提示我們,經典致幻劑腹腔給藥誘導大鼠甩頭10 min后,前額葉皮層的蛋白磷酸化發(fā)生變化。

2.3 經典致幻劑給藥30 min時誘導大鼠前額葉皮層蛋白質修飾變化大鼠腹腔給藥溶劑和致幻劑后,甩頭30 min時取大鼠前額葉皮層進行蛋白質修飾檢測(Fig 4A)。Western blot結果顯示,與VEH組相比,LSD、DOM組在蛋白質蘇氨酸修飾存在下調趨勢。在蛋白質絲氨酸變化中,絲氨酸的磷酸化修飾沒有明顯差異;在蛋白質蘇氨酸變化中,在85 ku處LSD和DOM組相較VEH組呈下降趨勢,Psilocin存在上調趨勢;在蛋白質酪氨酸變化中,LSD組相較VEH組在15 ku處有一條帶。蛋白的乙?；头核鼗揎椢匆娒黠@變化(Fig 4B)。該結果表明,經典致幻劑腹腔給藥誘導大鼠甩頭30 min后,前額葉皮層的蛋白磷酸化發(fā)生變化。結合之前得到的10 min時也發(fā)生磷酸化變化,我們得到經典致幻劑在誘導甩頭過程中會誘導前額葉皮層蛋白質磷酸化變化。

3 討論

經典致幻劑是一類通過作用于五羥色胺受體而誘導人類幻覺效應的藥物,幻覺作用是致幻劑對社會造成潛在危害的原因之一,也是影響致幻劑臨床應用安全性的重要原因之一。在本研究中,我們通過單次腹腔注射經典致幻劑進行大鼠的甩頭反應實驗,確定甩頭次數最高的劑量及甩頭次數增高較快的時間,通過蛋白修飾泛抗體檢測實驗發(fā)現給藥10 min和30 min后前額葉皮層中的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化修飾發(fā)生變化,而乙酰化和泛素化未見明顯變化,提示我們蛋白質的磷酸化修飾是經典致幻劑誘導甩頭過程中的重要機制。而蛋白質泛素化修飾在我們的結果中未見明顯變化,也尚未查閱到經典致幻劑與泛素化的相關文獻報道。關于乙酰化修飾,有文獻表明經典致幻劑LSD在靜脈給藥兔30 min時腦中發(fā)生組蛋白乙?；揎梉14],但在我們的結果中未檢測到明顯的乙酰化修飾,這可能因為實驗條件限制,蛋白提取效率不夠高,也可能是兔和大鼠種屬差異。

目前對于經典致幻劑的研究認為,經典致幻劑在激活5-HT2AR后通過激活下游的Gq和Gs信號通路從而介導動物的甩頭行為[15-16],與環(huán)磷酸腺苷和Ca2+的釋放有關,提示我們信號通路中的蛋白激酶A等蛋白質可能在其中發(fā)揮了作用。一項蛋白質組學研究檢測了致幻劑5-MeO-DMT作用于類腦器官下的蛋白質變化,發(fā)現934種蛋白在5-MeO-DMT的處理后發(fā)生差異表達[17],為蛋白質在經典致幻劑的機制研究中提供了依據。另一項基于細胞水平的磷酸化蛋白質組學研究發(fā)現,經典致幻劑DOI相較非致幻型5-HT2AR激動劑利舒脲(Lisuride)會特異性誘導5-HT2AR胞外第三環(huán)的絲氨酸280位磷酸化[18]。提示我們幻覺現象的產生可能與蛋白質磷酸化密切相關,我們的研究結果初步證實了此假設。但是蛋白修飾的變化可能也是由蛋白質水平變化所導致,在我們的研究中僅檢測了蛋白質修飾的變化,并沒有驗證蛋白水平的變化。

Fig 2 Effects of LSD, DOM and Psilocin on head-twitch response in SD rats in 30 min

Fig 3 Effects of LSD, DOM, Psilocin on protein phosphorylation, acetylation and ubiquitination in PFC of SD rats in 10 min(n=3)

Fig 4 Effects of LSD, DOM, Psilocin on protein phosphorylation, acetylation and ubiquitination in PFC of SD rats in 30 min(n=3)

在一項動物水平的磷酸化蛋白質組學研究中提到,腹腔急性給藥苯環(huán)利定進行精神分裂癥造模后,給藥15 min時腦組織中蛋白質的磷酸化變化更明顯于30 min和240 min時的磷酸化變化,并且由于藥物作用時間較快,15 min時蛋白水平沒有明顯的改變[7]。因此,我們推測在經典致幻劑急性作用過程中,主要為蛋白質磷酸化修飾的變化。

綜上所述,現有的經典致幻劑分子機制的研究僅停留在細胞水平以及5-HT2AR結構及下游信號通路水平,而幻覺的產生往往通過腦內多個腦區(qū)的相互作用來實現,因此有必要從動物組織水平對幻覺產生的機制進行深一步研究。在本研究中我們使用經典致幻劑中最常用的甩頭反應動物模型,研究甩頭行為下大鼠前額葉皮層中的蛋白質修飾變化。結果發(fā)現,經典致幻劑單次給藥大鼠10和30 min時前額葉皮層中會發(fā)生不同蛋白的磷酸化上調或下調變化,證明經典致幻劑在誘導急性的藥理作用過程中伴隨著蛋白質磷酸化修飾。但僅通過泛抗體檢測實驗無法精確了解磷酸化蛋白的種類和變化倍數,無法進一步驗證蛋白質磷酸化修飾是否與幻覺或甩頭反應有關,也無法研究幻覺或甩頭行為發(fā)生的具體機制,因此有必要繼續(xù)通過更高精度的磷酸化蛋白質組學方法對此條件下的大鼠腦組織樣本進行進一步定量檢測,以便發(fā)現經典致幻劑作用下的關鍵基因及蛋白,深入了解經典致幻劑誘導幻覺作用可能的分子機制,為將來經典致幻劑幻覺治療藥物的研發(fā)提供方向。