李凌凌,劉文一,王 楠,趙齊林,吳蘭香

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.生命科學(xué)研究院,2.附屬第一醫(yī)院心胸外科,重慶 400016)

肺癌是全世界發(fā)病率與死亡率均較高的惡性腫瘤,其中80%～85%為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell cancer, NSCLC)[1]。由于該疾病早期無(wú)典型癥狀,接近70%的NSCLC患者確診時(shí)已屬中晚期,不僅失去了手術(shù)機(jī)會(huì),而且對(duì)常規(guī)化療及放療均不敏感,5年生存率僅約15%[2]。近年來(lái),表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)等分子靶向藥物的問(wèn)世,使得NSCLC的臨床治療獲得了突破性進(jìn)展。

奧希替尼(osimertinib, Osi)是首個(gè)獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的第三代EGFR-TKI,可選擇性地與敏感突變型及T790M耐藥突變型EGFR發(fā)生不可逆結(jié)合,阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)而達(dá)到抗腫瘤的目的。鑒于其良好的臨床療效與安全性,該藥被推薦用于EGFR突變陽(yáng)性NSCLC患者的一線(xiàn)治療[3]。然而,絕大多數(shù)在用藥初始階段具有良好反應(yīng)性的患者,9～14個(gè)月后均會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥現(xiàn)象,導(dǎo)致治療失敗、疾病進(jìn)展[4]。該現(xiàn)象產(chǎn)生的原因非常復(fù)雜,目前,已發(fā)現(xiàn)的分子機(jī)制主要包括兩大類(lèi):EGFR依賴(lài)性機(jī)制,如EGFR C797S突變等;EGFR非依賴(lài)性機(jī)制,如c-MET、HER2等代償性信號(hào)通路建立以及病理組織類(lèi)型轉(zhuǎn)化等[5]。為了克服Osi耐藥、增強(qiáng)其療效,除了目前正在研發(fā)的針對(duì)EGFR C797S突變的第四代EGFR-TKI外,尋找耐藥逆轉(zhuǎn)劑、探索聯(lián)合治療方案已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。目前已有研究表明,帕比司他、阿司匹林及姜黃素對(duì)NSCLC細(xì)胞EGFR-TKI藥物獲得性耐藥具有一定的逆轉(zhuǎn)作用[6-8],但是,特異性安全性更高、療效穩(wěn)定有效性更好的藥物逆轉(zhuǎn)劑還有待被進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)。

本研究以O(shè)si獲得性耐藥的NSCLC細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)高通量篩選FDA批準(zhǔn)的藥物分子庫(kù),發(fā)現(xiàn)金諾芬(auranofin, ANF)對(duì)NSCLC細(xì)胞Osi獲得性耐藥有顯著逆轉(zhuǎn)作用,為臨床克服該現(xiàn)象提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;FDA批準(zhǔn)的1 470種藥物分子庫(kù)(L4200)和CCK-8試劑盒(C0005)購(gòu)于美國(guó)TargetMol公司;基質(zhì)膠(356234)和Transwell小室(353097)購(gòu)于美國(guó)康寧公司;青霉素-鏈霉素(C0222)、結(jié)晶紫染液(C0121)、EdU試劑盒(C0071S)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;4%多聚甲醛(DF0135)購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司;Osi(B1104)購(gòu)于美國(guó)APExBIO生物科技有限公司;ANF(HY-B1123)購(gòu)于上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR073A)購(gòu)于日本TaKaRa公司;PCR引物由上海生物工程有限公司合成;Anti-HSPB8 (DF2481)購(gòu)于美國(guó)Affinity Biosciences,Anti-GAPDH(bs-2188R)購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司,Anti-LC3B(3868T)購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司,辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(ZB-2301)購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1975(攜帶EGFR L858R和T790M突變)和PC9(攜帶EGFR第19外顯子缺失突變)購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。H1975和PC9細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975和PC9細(xì)胞,用0～0.5 μmol·L-1遞增濃度的Osi處理,直至細(xì)胞可在含0.5 μmol·L-1Osi培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng),即為H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前2周撤去藥物,常規(guī)培養(yǎng)以備用。

1.2.2CCK-8法進(jìn)行高通量藥物篩選并檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞,接種于96孔板中(5×103個(gè)細(xì)胞/孔),24 h后加入10 μmol·L-1或1 μmol·L-1濃度的1 470種待測(cè)藥物,同時(shí)加入0.5 μmol·L-1Osi,于37 ℃、5% CO2條件下處理72 h后,加入10%的CCK-8溶液繼續(xù)孵育1 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度,細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度)/(對(duì)照組吸光度-空白組吸光度)×100%;檢測(cè)細(xì)胞活力時(shí),用不同濃度的Osi(0、1.25、2.5、5、10 μmol·L-1)或/和ANF(0.625、1.25、2.5、5 μmol·L-1)處理細(xì)胞72 h,加入CCK-8試劑后繼續(xù)孵育1 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度后,計(jì)算細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)。

1.2.3藥物協(xié)同指數(shù)測(cè)定 將H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,接種于96孔板(5×103個(gè)細(xì)胞/孔)中。培養(yǎng)24 h后,采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,參考單藥的IC50值,Osi組設(shè)濃度0、2、4、6、8 μmol·L-1,ANF組設(shè)濃度0、0.8、1、2 μmol·L-1,繼續(xù)孵育72 h,檢測(cè)方法同“1.2.2”。計(jì)算每個(gè)濃度下對(duì)細(xì)胞活力的抑制率,采用Compusyn軟件分析兩藥聯(lián)合效應(yīng),并采用中位數(shù)效應(yīng)原理確定藥物聯(lián)合指數(shù)(combination index, CI)。CI=D1/Dx1+D2/Dx2,其中,D1和D2分別表示Osi和ANF聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生同等效果所需要的劑量,Dx1和Dx2分別表示抑制一定水平細(xì)胞活力所需的Osi和ANF的劑量。CI<1代表兩藥在該濃度組合下具有協(xié)同作用,CI=1代表兩藥在該濃度組合下具有相加作用,CI>1代表兩藥在該濃度組合下具有拮抗作用。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板(2×105個(gè)細(xì)胞/孔),24 h后單獨(dú)加入Osi、單獨(dú)加入ANF或者用Osi+ANF聯(lián)合處理,48 h后收集貼壁及上清中所有細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶(PI)染色液,于4 ℃避光孵育15 min,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5EdU細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于24孔板(4×104個(gè)細(xì)胞/孔),24 h后單獨(dú)加入Osi、單獨(dú)加入ANF或者用Osi+ANF聯(lián)合處理,48 h后加入EdU繼續(xù)孵育2 h。將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后,用Click反應(yīng)液和Hoechst避光染色,于正置熒光顯微鏡下觀(guān)察并拍照,ImageJ軟件處理圖像并計(jì)數(shù)。EdU陽(yáng)性細(xì)胞率=Edu染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/Hoechst標(biāo)記細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板(2×105個(gè)細(xì)胞/孔),24 h后單獨(dú)加入Osi、單獨(dú)加入ANF或者用Osi+ANF聯(lián)合處理,48 h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至24孔板Transwell小室的上室中(2×104個(gè)細(xì)胞/孔)進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng),下室中加入含20% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL,培養(yǎng)24 h后加入4%多聚甲醛固定15 min,加入0.1%結(jié)晶紫室溫下染色15 min,于顯微鏡下拍照并用ImageJ軟件計(jì)數(shù)。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中,提前24 h于Transwell小室中鋪基質(zhì)膠,其余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.7RNA的提取以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975/OR和PC9/OR細(xì)胞接種于6孔板,24 h后單獨(dú)加入2 μmol·L-1Osi、單獨(dú)加入1 μmol·L-1ANF或者用Osi+ANF聯(lián)合處理,48 h后用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,同時(shí)提取H1975和PC9兩種細(xì)胞的總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,以cDNA為模版進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán),計(jì)算2-ΔΔCt值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,所用引物見(jiàn)Tab 1。

Tab1 Sequence of primers(5′- 3′)

1.2.8Western blot檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975/OR和PC9/OR細(xì)胞接種于6孔板中,24 h后單獨(dú)加入2 μmol·L-1Osi、單獨(dú)加入1 μmol·L-1ANF或者用Osi+ANF聯(lián)合處理,48 h后收集細(xì)胞提取蛋白,同時(shí)收集H1975和PC9兩種細(xì)胞的蛋白,用BCA試劑盒檢測(cè)不同組蛋白濃度,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉2 h后,4 ℃搖床過(guò)夜孵育一抗,用TBST洗滌3次后,加入二抗室溫孵育1 h,再用TBST洗滌3次后,使用ECL系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9RNA的抽提以及RNA-seq檢測(cè) 委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序,采用TRIzol(Invitrogen)法提取H1975和PC9敏感株以及H1975/OR和PC9/OR(分別用2 μmol·L-1Osi單獨(dú)處理和2 μmol·L-1Osi與1 μmol·L-1ANF聯(lián)合處理)細(xì)胞的總RNA,檢測(cè)RNA樣品的質(zhì)量以保證使用合格的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。RNA文庫(kù)的建立采用TruSeqTMRNA sample preparation Kit(Illumina,SanDiego,CA)試劑盒,文庫(kù)使用Illumina HiSeq xten/NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150。

2 結(jié)果

2.1 建立并驗(yàn)證NSCLC細(xì)胞Osi獲得性耐藥模型本研究首先利用Osi敏感性H1975和PC9細(xì)胞,按照藥物濃度遞增法建立Osi獲得性耐藥細(xì)胞株H1975/OR與PC9/OR。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,Osi對(duì)H1975與H1975/OR的IC50值分別為0.074 μmol·L-1與5.204 μmol·L-1,耐藥指數(shù)為70.31;Osi對(duì)PC9與PC9/OR的IC50值分別為0.042 μmol·L-1與5.692 μmol·L-1,耐藥指數(shù)為136.99(P<0.01,Fig 1A)。流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果(Fig 1B)所示,與敏感株相比,0.5 μmol·L-1Osi處理48 h后,H1975/OR細(xì)胞凋亡率較H1975細(xì)胞降低了72.6%(6.99%vs25.51%,P<0.05),而PC9/OR細(xì)胞的凋亡率較PC9細(xì)胞下降了84.6%(4.55%vs29.53%,P<0.01)。以上結(jié)果表明,Osi獲得性耐藥NSCLC細(xì)胞株構(gòu)建成功。

2.2 NSCLC細(xì)胞Osi獲得性耐藥逆轉(zhuǎn)劑篩選為了尋找NSCLC細(xì)胞Osi獲得性耐藥的逆轉(zhuǎn)劑,本研究利用FDA批準(zhǔn)的1 470種藥物分子庫(kù),通過(guò)CCK-8方法篩選與0.5 μmol·L-1Osi聯(lián)用后可以明顯殺傷H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞的藥物(Fig 2A)。首先將藥物濃度設(shè)置在10 μmol·L-1,將10 μmol·L-1待篩藥物與0.5 μmol·L-1Osi共同作用于H1975/OR細(xì)胞進(jìn)行初篩,篩選出對(duì)細(xì)胞活力抑制率>50%的藥物,共有91種(Fig 2B),其中30%為激酶抑制劑,17%為RNA、DNA、蛋白合成抑制劑,還包括組蛋白去乙?；敢种苿?、離子通道類(lèi)抑制劑、蛋白酶體抑制劑等(Fig 2C)。隨后,將這91種藥物的濃度降至1 μmol·L-1,與0.5 μmol·L-1Osi聯(lián)用后,同時(shí)在H1975/OR和PC9/OR細(xì)胞上進(jìn)行復(fù)篩,發(fā)現(xiàn)14種藥物對(duì)H1975/OR細(xì)胞活力的抑制率>50%,11種藥物對(duì)PC9/OR細(xì)胞活力的抑制率>50%,其中有7種藥物對(duì)兩種耐藥細(xì)胞活力的抑制率同時(shí)>50%,分別是帕比司他、硼替佐米、卡非佐米、伏立諾他、ANF、羅米地辛、高三尖杉酯堿(Fig 2D)。接下來(lái),本研究比較了這7種藥物在單獨(dú)給藥以及與0.5 μmol·L-1Osi聯(lián)用時(shí)對(duì)兩種耐藥細(xì)胞活力的影響,發(fā)現(xiàn)ANF在兩種情況下對(duì)細(xì)胞的殺傷作用差異最為明顯:單獨(dú)給藥時(shí),ANF對(duì)H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞活力的抑制率分別為46.07%與40.32%;當(dāng)與0.5 μmol·L-1Osi聯(lián)用時(shí),對(duì)H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞活力的抑制率分別上升到了66.67%與70.76%(Fig 2E)。以上研究結(jié)果表明,不同于所篩選出的其他藥物,盡管ANF在單獨(dú)用藥時(shí)對(duì)Osi獲得性耐藥的NSCLC細(xì)胞有一定殺傷作用,但是與Osi聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果更加明顯,提示ANF的作用靶點(diǎn)極有可能與NSCLC細(xì)胞在耐藥過(guò)程中發(fā)生改變的某些生物學(xué)特性密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)NSCLC細(xì)胞Osi獲得性耐藥的逆轉(zhuǎn)作用,并探索其耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制,不僅有助于探索新的安全有效的耐藥逆轉(zhuǎn)方案,還可以從全新視角了解更全面的Osi獲得性耐藥產(chǎn)生原因,為臨床克服該現(xiàn)象提供新的解決思路。

Fig 1 Establishment and validation of osimertinib acquired resistant NSCLC cell lines

Fig 2 High-throughput screening drugs to reverse osimertinib acquired resistance

Fig 3 Different concentrations of auranofin and osimertinib combination effect on osimertinib resistant NSCLC cells

2.3 ANF與Osi聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)為了進(jìn)一步驗(yàn)證ANF與Osi聯(lián)合用藥的效果,并確定兩藥聯(lián)用的最佳劑量,本研究首先利用CCK-8法檢測(cè)了ANF單獨(dú)處理Osi獲得性耐藥NSCLC細(xì)胞的IC50值,以便初步確定藥物濃度范圍。結(jié)果表明,ANF對(duì)H1975/OR細(xì)胞的IC50值為1.16 μmol·L-1,對(duì)PC9/OR細(xì)胞的IC50值為1.40 μmol·L-1(Fig 3A)。隨后,將不同濃度ANF(0、0.8、1、2 μmol·L-1)與不同濃度Osi(0、2、4、6、8 μmol·L-1)作用于細(xì)胞,觀(guān)察對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力的抑制率(Fig 3B),并將抑制率數(shù)據(jù)輸入CompuSyn軟件中計(jì)算CI值[9]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在所選的藥物濃度配比方案下,兩株細(xì)胞中所計(jì)算出的CI值<1,說(shuō)明在這些濃度下,兩種藥物聯(lián)用均產(chǎn)生了協(xié)同作用。其中,以1 μmol·L-1ANF+2 μmol·L-1Osi方案CI值最小,協(xié)同作用最強(qiáng)(Fig 3C),為最佳配比,故作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。

2.4 ANF與Osi聯(lián)用對(duì)Osi獲得性耐藥NSCLC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖與凋亡的影響在EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,ANF與Osi聯(lián)合處理48 h后,H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例分別下降了71.7%與86.5%,而ANF單獨(dú)處理組則分別下降了39.9%與30.4%,Osi單獨(dú)處理組分別下降13.6%與11.5%(P<0.01,Fig 4A)。流式凋亡檢測(cè)結(jié)果也顯示,相比于兩者單獨(dú)用藥,ANF與Osi聯(lián)合處理48 h后,兩種耐藥細(xì)胞株的凋亡率較兩種藥物單獨(dú)處理組均明顯增多(P<0.01,Fig 4B)。以上結(jié)果提示,ANF與Osi聯(lián)用可明顯抑制H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖并誘導(dǎo)凋亡。

2.5 ANF與Osi聯(lián)用對(duì)Osi獲得性耐藥的NSCLC細(xì)胞遷移與侵襲的影響細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,ANF與Osi聯(lián)合處理48 h后H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞的遷移能力分別下降了86.5%與81.8%,而ANF單獨(dú)處理組則分別下降了60.6%與40.2%,Osi單獨(dú)處理組分別下降了14.2%與32.5% (P<0.01,Fig 5A);同樣,細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,ANF與Osi聯(lián)合處理使H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞的侵襲能力分別下降了75.5%與80.3%,而ANF單獨(dú)處理組則分別下降了49.6%與44.5%,Osi單獨(dú)處理組分別下降了11.5%與13.1%(P<0.01,Fig 5B)。以上結(jié)果提示,ANF與Osi聯(lián)用可顯著抑制H1975/OR與PC9/OR細(xì)胞的侵襲與遷移能力。

Fig 5 Auranofin and osimertinib combination inhibited migration and invasion ability of osimertinib resistant NSCLC cells

2.6 ANF和Osi聯(lián)合用藥后誘導(dǎo)HSPB8和自噬增加在H1975/OR與PC9/OR通過(guò)RNA-seq結(jié)果篩選聯(lián)合用藥與單獨(dú)用Osi的差異表達(dá)基因(Fig 6A),共有36個(gè)基因在兩個(gè)細(xì)胞中均上調(diào),34個(gè)基因在兩種細(xì)胞中均下調(diào)(Fig 6B),此外,在H1975與H1975/OR的RNA-seq結(jié)果中發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因中HSPB8耐藥后下調(diào),而該基因在聯(lián)合用藥后上調(diào),對(duì)敏感株和耐藥株進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(Fig 6C)發(fā)現(xiàn)HSPB8在耐藥后明顯下調(diào)(P<0.01),而聯(lián)合用藥后明顯上調(diào)(P<0.01),Western blot結(jié)果顯示(Fig 6D),在兩種細(xì)胞中,與敏感株相比,HSPB8表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01),與單獨(dú)加Osi相比,Osi和ANF聯(lián)用HSPB8表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01),且LC3-II/LC3-I水平明顯上調(diào)(P<0.01),說(shuō)明細(xì)胞耐藥機(jī)制是通過(guò)下調(diào)HSPB8,而聯(lián)合用藥可以促進(jìn)HSPB8表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞自噬增多最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。

Fig 6 Auranofin and osimertinib combination induced HSPB8 expression and autophagy in osimertinib resistance NSCLC cells

3 討論

肺癌的靶向治療在多數(shù)研究中取得了明顯有效的成果,EGFR突變?cè)诜蜗侔┲斜壤哌_(dá)40%～55%,第三代靶向藥物Osi因?yàn)槠浏熜э@著而被廣泛應(yīng)用,但是患者產(chǎn)生了獲得性耐藥限制了其應(yīng)用。因此,開(kāi)發(fā)、發(fā)掘新的藥物克服Osi耐藥,有望為臨床耐Osi肺癌患者提供一個(gè)新的治療思路。本研究通過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)一種抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物ANF可恢復(fù)Osi敏感性,并證明了其與Osi聯(lián)用有協(xié)同效果,在細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲遷移上有明顯的趨勢(shì)。

ANF是一種含金的化合物,1985年被FDA批準(zhǔn)用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,很多研究表明其可以作為一種抗癌藥發(fā)揮作用[10],在哺乳動(dòng)物中ANF發(fā)揮其作用的機(jī)制主要是抑制硫氧還蛋白氧化還原酶TrxR1和TrxR2,這個(gè)機(jī)制在1998年被研究,到目前仍然是最主要的作用機(jī)制。硫氧還蛋白還原酶是硫氧還蛋白系統(tǒng)的關(guān)鍵酶,在很多癌癥中報(bào)道癌組織中TrxR/Trx系統(tǒng)上調(diào),且和癌癥的進(jìn)展與耐藥相關(guān),高表達(dá)TrxR/Trx系統(tǒng)還與肺癌和乳腺癌預(yù)后差相關(guān)[11]。除此之外,ANF可以通過(guò)其他多種作用機(jī)制發(fā)揮抗癌作用,在多發(fā)性骨髓瘤中已被報(bào)道ANF可以抑制NF-κB和JAK2/STAT3信號(hào)通路從而抑制骨髓瘤的進(jìn)展[12],2013年Wang等報(bào)道PKCitoa也是ANF的靶點(diǎn)之一。在NSCLC中報(bào)道ANF可以抑制PKCitoa,進(jìn)而抑制ELF3的磷酸化和后續(xù)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的功能,最終導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制[13]。多數(shù)研究表明,ANF單獨(dú)應(yīng)用具有抗癌作用,但是所需濃度較大,會(huì)產(chǎn)生一定的副作用,而聯(lián)合用藥可以降低兩藥的濃度減小副作用且可產(chǎn)生較好的抑制效果,Liu通過(guò)高通量的藥物庫(kù)篩選出ANF在耐藥的肺小細(xì)胞癌中增強(qiáng)順鉑療效,聯(lián)合用藥誘導(dǎo)ROS增多,最終導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷和DNA損傷[14]。ANF被報(bào)道與吉非替尼聯(lián)用也有協(xié)同抗癌效果,但是其對(duì)增強(qiáng)Osi敏感性效果尚未被研究。

HSPB8屬于熱休克蛋白中小分子熱休克蛋白家族(small heat shock proteins,sHSPs),在環(huán)境和生理刺激下表達(dá)增多,分子量22 ku,其與BAG3結(jié)合后可將錯(cuò)誤折疊蛋白通過(guò)自噬途徑降解[15]。有研究報(bào)道,HSPB8既有促癌作用又有抑癌作用,在不同腫瘤中表達(dá)情況不同,如在黑色素瘤中,HSPB8和TAK1結(jié)合導(dǎo)致p38-MAPK信號(hào)通路激活最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,激活的TAK1在Ser552位點(diǎn)結(jié)合并磷酸化β-catenin,導(dǎo)致CDK2轉(zhuǎn)錄減少,最終導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯[16];在肝細(xì)胞癌中,HSPB8和PI3K結(jié)合抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移[17]。其在肺癌中的研究較少,本研究發(fā)現(xiàn)HSPB8在肺癌中發(fā)揮抑癌作用且與自噬相關(guān)。

綜上所述,本研究從高通量篩選入手,從1 470種FDA批準(zhǔn)的藥物庫(kù)中在H1975/OR和PC9/OR細(xì)胞中篩選增強(qiáng)Osi敏感性的藥物,最終選出ANF在其血藥濃度時(shí)即可發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增強(qiáng)Osi療效的作用,并從兩個(gè)細(xì)胞系的功能上進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)用效果明顯,對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),耐藥后HSPB8表達(dá)水平下調(diào),而聯(lián)合用藥后HSPB8和自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平上調(diào),自噬增強(qiáng)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡增多說(shuō)明HSPB8作為抑癌基因在NSCLC耐Osi細(xì)胞株中發(fā)揮作用。該研究有望對(duì)臨床耐藥患者的用藥方案的選擇提供新思路。