賴運(yùn)浩,譚綺婷,黃庭祺,劉 石,彭月榮,李芳紅,趙正剛,周素瑾,麥家洛,趙子建

(1. 廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院,廣東 廣州 510006;2. 北京理工大學(xué)珠海學(xué)院材料與環(huán)境學(xué)院 廣東 珠海 519085;3. 廣州華津醫(yī)藥科技有限公司, 廣東 廣州 510700)

鼻咽癌是一種高發(fā)于中國(guó)南部以及一些東南亞地區(qū),在世界其他地區(qū)卻罕見的癌癥[1]。鼻咽癌發(fā)生率男性高于女性[2]。EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染和環(huán)境以及遺傳因素是鼻咽癌發(fā)生的主要原因[3]。目前鼻咽癌主要治療技術(shù)手段是進(jìn)行常規(guī)化療或者放療,但治療效果有限,30%～40%病人治療4年后復(fù)發(fā)且發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,且對(duì)放射治療不敏感[4-6]。因此尋找一種治療有效減少?gòu)?fù)發(fā)的手段具有重要意義。

溶瘤細(xì)菌療法是目前極具創(chuàng)新療法,靶向性高,定植腫瘤微環(huán)境[7]。細(xì)菌可以通過基因工程改造編碼和通過局部遞送有效載荷,包括小分子、毒素、免疫調(diào)節(jié)劑、前藥物轉(zhuǎn)化酶,小干擾RNA和納米體等[8]。已有臨床試驗(yàn)證明VNP20009的安全性[9],但其有效性有待研究。由廣州華津醫(yī)藥科技有限公司自主研發(fā)SGN1利用VNP20009靶向性以及絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞具有甲硫氨酸依賴性特點(diǎn)進(jìn)行基因工程改造獲得高表達(dá)甲硫氨酸酶減毒沙門菌SGN1,甲硫氨酸酶可分解甲硫氨酸為甲硫醇、α-酮丁酸和氨,進(jìn)一步降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)甲硫氨酸水平[10]。前期已有研究在其他腫瘤如乳腺癌中有良好治療效果,且副作用低[11],但鼻咽癌對(duì)甲硫氨酸限制的敏感性以及高表達(dá)甲硫氨酸酶減毒沙門菌SGN1在鼻咽癌上的治療作用仍有待進(jìn)一步研究。本研究通過甲硫氨酸限制培養(yǎng)以及利用減毒沙門菌SGN1研究對(duì)鼻咽癌的治療作用及機(jī)制,為后期臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種與細(xì)胞株 SGN1、VNP20009-V(VNP-V)均來自廣州華津醫(yī)藥科技有限公司。人源鼻咽癌細(xì)胞HNE細(xì)胞、5-8F細(xì)胞和CNE-2細(xì)胞,由中南大學(xué)研究中心贈(zèng)予。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～5周齡的♂BALB/c-nude裸鼠鼠購(gòu)自廣東藥康生物科技有限公司,飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)倫理嚴(yán)格遵循廣東藥科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)規(guī)定(批號(hào):GOPUSPF2017048)。

1.1.3試劑與儀器 普通RPMI 1640培養(yǎng)基(含甲硫氨酸, 貨號(hào)11875119)、不含甲硫氨酸的RPMI 1640(貨號(hào)A14517-01)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;L-甲硫氨酸(L-Methionine, Met, 貨號(hào)M5308)、L-同型半胱氨酸(L-Homocysteine, Hcy, 貨號(hào)H9633)、硫酸卡那霉素(E00400)購(gòu)自Sigma公司;青霉素和鏈霉素(貨號(hào)15140-122)購(gòu)自賽默飛公司;胎牛血清(FBS, 貨號(hào)Z7185FBS)購(gòu)自Zeta公司;胰蛋白胨(貨號(hào)VG0300)、酵母提取物(貨號(hào)LP0021B)購(gòu)置賽默飛公司;PBS片劑(磷酸緩沖鹽溶液, 貨號(hào)B640435)、硫酸慶大霉素(貨號(hào)A506614)、CCK-8試劑盒(貨號(hào)E606335)購(gòu)自上海生工生物公司;氯化鈣(貨號(hào)1.02378)、硫酸鎂(貨號(hào)1.05886)購(gòu)自德國(guó)默克公司;BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)23235)購(gòu)自賽默飛公司、ECL發(fā)光液(貨號(hào)E412-01-AA)購(gòu)自南京諾維贊公司;Bcl-2(貨號(hào)D55G8)、GADPH(貨號(hào)2118S)抗體購(gòu)自CST公司;HPR標(biāo)記的山羊抗兔二抗(貨號(hào)A21245)購(gòu)自賽默飛公司;細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C1052)上海碧云天生物技術(shù)有限公司;APC Annexin-V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)640932)購(gòu)自Biolegend公司。AC2-4S1型二級(jí)生物安全柜購(gòu)自ESCO公司;TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司;ChemiDoc+XRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)伯樂公司;倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)尼康公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人源鼻咽癌細(xì)胞培養(yǎng)采用1%雙抗(含100 mg·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素)以及10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每隔2～3 d進(jìn)行傳代1次。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.2.2細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取人鼻咽癌細(xì)胞接種于6孔板,分為con、Met-Hcy+、Met-Hcy-(con:對(duì)照組含終濃度為200 μmol·L-1甲硫氨酸不含同型半胱氨酸RPMI 1640完全培養(yǎng)基;Met-Hcy+:含終濃度為200 μmol·L-1同型半胱氨酸不含甲硫氨酸RPMI 1640完全培養(yǎng)基;Met-Hcy-:既不含甲硫氨酸也不含同型半胱氨酸RPMI 1640完全培養(yǎng)基)。各組放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行2、4、6 d進(jìn)行培養(yǎng)。取相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行消化并且用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)。

1.2.3細(xì)胞平板克隆 每組細(xì)胞以每孔3000個(gè)細(xì)胞分別接種于6孔板中,分成con組和met-組(met-為RPMI 1640完全培養(yǎng)基不含甲硫氨酸組別),貼壁后con組為含甲硫氨酸的1640完全培養(yǎng)基,met-改為不含甲硫氨酸RPMI 1640完全培養(yǎng)基,每隔3 d進(jìn)行換液,培養(yǎng)21 d;吸除上清液用PBS清洗2次,添加1 mL甲醇固定15 min;用2%結(jié)晶紫染液染色15 min,直接用肉眼計(jì)數(shù)形成細(xì)胞克隆數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化重懸種板,每孔添加4×105個(gè)細(xì)胞過夜培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)孔進(jìn)行劃痕,劃痕完成后用1 mL PBS洗2次將劃痕時(shí)漂浮起來的細(xì)胞洗去,分為對(duì)照組con和實(shí)驗(yàn)組met-,然后根據(jù)組別加入完全培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基甲硫氨酸缺陷培養(yǎng)基。在0 h、24 h在劃痕同一位置進(jìn)行拍照取樣,通過觀察劃痕面積的變化情況對(duì)細(xì)胞的遷移性能進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,細(xì)胞數(shù)為5×105/皿,實(shí)驗(yàn)組met-用甲硫氨酸缺陷培養(yǎng)基處理48 h或4 d,用胰酶消化輕微吹打成單細(xì)胞懸液,1 000×g離心5 min用PBS清洗2遍。離心去上清,各加入1 mL預(yù)冷70%乙醇固定24 h。固定后離心去上清,加入PI染液37 ℃避光溫育30 min,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期情況。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用甲硫氨酸缺陷培養(yǎng)基提前種板分為對(duì)照組con和實(shí)驗(yàn)組met-,對(duì)照組按照1 ∶1 000的比例加入甲硫氨酸(200 mmol·L-1),而實(shí)驗(yàn)組則進(jìn)行甲硫氨酸缺陷培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d后進(jìn)行消化處理,后將細(xì)胞懸液離心2分鐘棄去上清,加入1 mL PBS進(jìn)行吹打混勻;再離心2分鐘棄去上清;接著添加100 μL Binding Buffer吹打混勻進(jìn)行緩沖,再加5 μL APC Annexin V混勻;后再加10 μL PI染液充分混勻進(jìn)行染色,避光靜置15分鐘;靜置結(jié)束后再加入400 μL的Binding Buffer,混勻后使用流式細(xì)胞術(shù)法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.2.7蛋白免疫印跡檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá) 使用RIPA強(qiáng)裂解液對(duì)各組蛋白進(jìn)行提取,用BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定并用5 × SDS進(jìn)行95 ℃變性。經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,按1 ∶1 000稀釋一抗,然后4 ℃孵育過夜,用二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h后,用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行曝光,用Image Lab分析條帶灰度。

1.2.8細(xì)菌細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 分別劃線接種VNP-V和SGN1于5 mL改良型LB液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1卡那霉素)過夜培養(yǎng),取過夜培養(yǎng)液以1 ∶100轉(zhuǎn)接于改良型LB液體培養(yǎng)基8000 ×g離心5 min去除培養(yǎng)基,生理鹽水重懸離心重復(fù)3次,離心生理鹽水重懸后調(diào)節(jié)濃度為1×1012cfu·L-1,根據(jù)不同需求用于后續(xù)菌胞共培養(yǎng)。每組以1.0×105個(gè)細(xì)胞每孔分別接種于6孔板中,貼壁后,根據(jù)細(xì)胞細(xì)菌比例1 ∶100分別加入VNP-V和SGN1共培養(yǎng)5 h后,用慶大霉素進(jìn)行滅活24 h進(jìn)行用CCK8進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞增殖,而細(xì)胞凋亡情況通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9裸鼠皮下構(gòu)建5-8F異種腫瘤模型 制備5-8F細(xì)胞懸液濃度為每毫升0.5×107細(xì)胞,取200 μL注射于裸鼠右腋下,待皮下腫瘤約80～100 mm3分成3組con、VNP-V、SGN1,每組3只分別進(jìn)行瘤內(nèi)給藥,對(duì)照組瘤內(nèi)注射20 μL生理鹽水,而VNP-V組和SGN1組分別注射2×105cfu/只。每隔3 d使用游標(biāo)卡尺量取腫瘤體積[腫瘤體積(mm3)=0.52×長(zhǎng)(mm)×寬2(mm2)]和稱取小鼠體質(zhì)量,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 人源鼻咽癌細(xì)胞HNE-2、5-8F和CNE-2具有甲硫氨酸依賴性為了證明人源鼻咽癌細(xì)胞對(duì)甲硫氨酸具有依賴性,在甲硫氨酸缺陷的培養(yǎng)條件下對(duì)鼻咽癌細(xì)胞5-8F、HNE-2、CNE-2進(jìn)行培養(yǎng),分別在第0、2、4、6天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的5-8F、HNE-2、CNE-2細(xì)胞正常生長(zhǎng),而甲硫氨酸缺陷組生長(zhǎng)受到顯著抑制即使補(bǔ)充同型半胱氨酸組(P<0.01),5-8F、HNE-2、CNE-2細(xì)胞生長(zhǎng)仍然受到抑制(Fig 1A-C),以上結(jié)果提示,人源鼻咽癌細(xì)胞HNE-2、5-8F和CNE-2具有甲硫氨酸依賴性。

Fig 1 Nasopharyngeal carcinoma cells depended on methionine

2.2 甲硫氨酸限制抑制鼻咽癌細(xì)胞的克隆形成能力和遷移能力為進(jìn)一步探討甲硫氨酸限制對(duì)鼻咽癌細(xì)胞5-8F、HNE-2的增殖和遷移能力的影響,通過平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),甲硫氨酸缺陷培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組鼻咽癌細(xì)胞單克隆形成能力相對(duì)對(duì)照組顯著受到了抑制,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Fig 2A,B,P<0.01)。此外,同時(shí)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn),通過劃痕面積的改變來檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 2C),劃痕后24 h,甲硫氨酸缺陷培養(yǎng)組的細(xì)胞劃痕傷口愈合受到抑制。以上結(jié)果表明甲硫氨酸缺陷對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HNE-2、CNE-2的遷移有抑制作用。

2.3 甲硫氨酸限制促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡和周期阻滯為了探索甲硫氨酸缺陷對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期作用,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)甲硫氨酸缺陷后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡和周期的變化。首先用PI檢測(cè)甲硫氨酸缺陷對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2周期的變化情況,結(jié)果表明,甲硫氨酸缺陷阻滯鼻咽癌細(xì)胞周期在G2/M期(Fig 3A,B)。然后進(jìn)一步用PI/Annexin-V染料檢測(cè)在甲硫氨酸缺陷培養(yǎng)條件下鼻咽癌凋亡情況,結(jié)果表明,甲硫氨酸缺陷促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡(Fig 3C,D),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白情況,通過Western blot檢測(cè)抗凋亡蛋白Bcl-2,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸剝奪明顯下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞Bcl-2的表達(dá)(Fig 3E-G),從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

2.4 SGN1誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生凋亡前期研究減毒沙門細(xì)菌SGN1可表達(dá)甲硫氨酸酶從而降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)甲硫氨酸[10],因此進(jìn)一步驗(yàn)證SGN1對(duì)人源鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,首先將鼻咽癌細(xì)胞5-8F、HNE-2、CNE-2與SGN1以共培養(yǎng)比例(1 ∶100)進(jìn)行菌胞共培養(yǎng)5 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SGN1抑制人鼻咽癌細(xì)胞5-8F、HNE-2和CNE-2細(xì)胞增殖(Fig 4A),并且通過PI/Annexin-V染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),SGN1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡(Fig 4B,C),且較對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

Fig 2 Effect of methionine deprivation on monoclonal formation and migration of nasopharyngeal carcinoma cells(n=3)

2.5 SGN1抑制鼻咽癌異種移植瘤生長(zhǎng)為了進(jìn)一步觀察SGN1在體內(nèi)的效果,我們通過構(gòu)建鼻咽癌皮下異種移植瘤(5-8F)模型,通過瘤內(nèi)給予藥物后,觀察裸鼠的活動(dòng)、進(jìn)食無(wú)明顯差別,體質(zhì)量呈穩(wěn)定趨勢(shì)。與對(duì)照組、VNP-V相比,SGN1顯著抑制腫瘤生長(zhǎng),且瘤重明顯低于對(duì)照組(P<0.05)和VNP-V組(P<0.01)(Fig 5C,D),而VNP-V相對(duì)對(duì)照組組無(wú)明顯差異(Fig 5 B),說明SGN1可抑制鼻咽癌異種移植瘤的生長(zhǎng)。

3 討論

鼻咽癌是一種復(fù)雜多因素疾病,且疾病發(fā)生發(fā)展速度快,目前治療藥物有限,因此尋找一種治療有效減少副作用的藥物具有重要意義。甲硫氨酸是人體必須氨基酸,參與DNA、蛋白質(zhì)等重要物質(zhì)的合成,而腫瘤普遍具有甲硫氨酸依賴性,剝奪甲硫氨酸能夠特異的抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。而且前期研究主要關(guān)注限制甲硫氨酸飲食和注射重組甲硫氨酸酶療法,盡管這兩種限制甲硫氨酸的方法有一定抑制腫瘤的作用,但同時(shí)也伴有較為嚴(yán)重的副作用,如導(dǎo)致患者體重減輕、引起機(jī)體免疫反應(yīng)等[13-14]。而細(xì)菌作為靶向載體表達(dá)作用分子,具有用于治療腫瘤潛在的臨床價(jià)值。SGN1具有VNP20009靶向性及安全性和可分解腫瘤細(xì)胞內(nèi)甲硫氨酸特性,能特異的與腫瘤競(jìng)爭(zhēng)甲硫氨酸,前期研究已在骨肉瘤、乳腺癌取得顯著的藥效作用[15],在本研究經(jīng)甲硫氨酸限制處理人鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,克隆形成率下降以及遷移。以上結(jié)果表明,SGN1可限制腫瘤甲硫氨酸,發(fā)揮抑制人鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

甲硫氨酸限制影響S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-l-methionine,SAM)合成減少,從而降低甲基化進(jìn)而造成代謝缺陷,導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。甲硫氨酸依賴性腫瘤細(xì)胞中的甲硫氨酸減少可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在S/G2期,而停滯在S/G2期細(xì)胞易發(fā)生自發(fā)性死亡并對(duì)化療藥物更加敏感[16]。本研究通過剝奪腫瘤細(xì)胞甲硫氨酸使腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。G2期檢查點(diǎn)能防止受損DNA和未完成復(fù)制DNA進(jìn)入有絲分裂,而鼻咽癌細(xì)胞DNA復(fù)制在G2/M期受阻,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不能完成DNA復(fù)制進(jìn)一步阻斷細(xì)胞有絲分裂,從而可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種方式,由多基因控制此過程,如Bcl-2、caspase家族等[17]。通過甲硫氨酸缺陷處理人鼻咽癌細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸缺陷處理后人鼻咽癌細(xì)胞凋亡率增加,并且Western blot結(jié)果顯示下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2,以上結(jié)果表明甲硫氨酸剝奪可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,因此通過剝奪腫瘤細(xì)胞甲硫氨酸抑制腫瘤生長(zhǎng)是可行有效的。

Fig 3 Effect of methionine deprivation on cell cycle and apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells(n=3)

Fig 4 SGN1 inhibited proliferation and induced apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells(n=3)

Fig 5 SGN1 inhibited nasopharyngeal carcinoma 5-8F subcutaneous xenograft tumor growth(n=3)

細(xì)菌的天然靶向性可作為介導(dǎo)載體用于抗腫瘤治療,減毒沙門菌SGN1以VNP20009為載體表達(dá)甲硫氨酸酶,甲硫氨酸酶可分解腫瘤內(nèi)甲硫氨酸,可解決重組甲硫氨酸酶容易被人體代謝的問題。本研究首先通過SGN1與鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)減毒沙門菌SGN1抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SGN1顯著抑制鼻咽癌5-8F皮下抑制瘤的生長(zhǎng),而小鼠體質(zhì)量則不受影響。說明減毒沙門菌SGN1可作為鼻咽癌潛在治療藥物,但SGN1是通過哪些信號(hào)分子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及在患者體內(nèi)激活免疫功能協(xié)助如何抗腫瘤機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述,高表達(dá)甲硫氨酸酶減毒沙門菌SGN1顯著抑制人鼻咽癌細(xì)胞的增殖,可能通過阻滯細(xì)胞周期G2/M期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此利用沙門菌靶向表達(dá)甲硫氨酸酶用于治療鼻咽癌具有臨床潛在價(jià)值,同時(shí)也為SGN1在臨床治療鼻咽癌提供藥理研究基礎(chǔ)。