廖 軍,蔡 沁,張曉東

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院,福建 泉州 362000;2.福建醫(yī)科大學(xué),福建 福州 362002)

中耳炎是耳鼻喉科常見疾病,其雖然不會危及生命,但卻是導(dǎo)致患者聽力障礙的主要原因,且病情往往反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn),免疫因素與其密切相關(guān),免疫反應(yīng)紊亂導(dǎo)致的免疫功能障礙是該病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素,因此如何改善免疫反應(yīng)紊亂,提高免疫功能是目前臨床工作的重點(diǎn)及焦點(diǎn)[2-3]。白介素-33(interleukin,IL-33)是一種多效性的細(xì)胞因子,其可通過與其特異性受體瘤變抑制因子2(suppression of tumorigenictiy 2,ST2)相結(jié)合來活化或極化多種類型的免疫細(xì)胞,從而參與免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)控,進(jìn)而發(fā)揮抗炎或促炎的作用,由此可推測IL-33/ST2信號在中耳炎免疫調(diào)節(jié)中將發(fā)揮不可忽視的作用[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn),中耳黏膜液體失衡是中耳炎發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié),而上皮鈉通道(epithelial sodium channel,ENaC)作為調(diào)控離水和離子的轉(zhuǎn)運(yùn)的重要途徑在其中發(fā)揮著重要作用,因此,如何調(diào)控鈉通道是近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)之一[5]。地骨皮是枸杞的干燥根皮,是我國傳統(tǒng)中藥材,據(jù)今已有近兩千年的藥用歷史,而地骨皮甲素是其有效藥用成分,具有抗菌、消炎、降壓、降糖、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等多種功效,故地骨皮甲素治療中耳炎將具有廣闊的發(fā)展前景[6]。但I(xiàn)L-33/ST2信號通路是否參與了鈉通道的調(diào)節(jié)目前尚無研究,因此,本文就地骨皮甲素調(diào)節(jié)IL-33/ST2信號對中耳炎大鼠免疫功能及鈉通道進(jìn)行研究探討,為臨床上治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物材料本實(shí)驗(yàn)選取上海凱學(xué)生物科技有限公司提供的60只SPF級SD雄性大鼠(合格證書為:SCXK(滬)2020-0005),平均體質(zhì)量(180～250)g,飼養(yǎng)條件為(20～25)℃恒溫,50%±5%恒濕,模仿晝夜交替,晝夜各12 h,無菌飲食2周,本次實(shí)驗(yàn)于福建醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心完成,按照《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料地骨皮甲素(貨號:PB270,北京普非有限公司);IL-33/ST2信號抑制劑anti-ST2(貨號:ab25877-ST2,上海恒斐有限公司);3型肺炎鏈球菌(貨號:A0680,上海酶研有限公司);誘發(fā)電位儀(型號:7S-12型,日本三榮公司);蘇木精染液(貨號:H9627,美國Sigma公司);伊紅染液(貨號:AG1100-100 mL,上海吉至有限公司);光學(xué)顯微鏡(型號:CX-60,日本OLYMPUS公司);酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(貨號:446502,美國R&D公司);全波長酶標(biāo)儀(型號:Multiskan Sky,上海輔澤有限公司);熒光實(shí)時定量PCR儀(型號:CFX96,上海土森視覺有限公司);PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀(型號:164-5051,美國 Bio-Rad公司);實(shí)時Real-Time PCR 試劑盒(貨號:7000,美國ABI公司);TRIzol試劑(貨號:Invitrogen,上海文韌有限公司);cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號:XY-TE-0738,上海烜雅有限公司);SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒(貨號:KGP113,江蘇凱基有限公司);蛋白質(zhì)裂解液(貨號:SY0320-NWS,北京百奧萊博有限公司);SDS-PAWE凝膠電泳試劑(貨號:CDLG-4942,武漢純度有限公司);IL-33抗體(貨號:70005-T16,北京義翹神州股份有限公司);ST2抗體(貨號:253486,深圳豪地華拓有限公司);GAPDH抗體(貨號:PL0403130,深圳豪地華拓有限公司);ECL檢測試劑盒(貨號:KFS09,北京百奧萊博有限公司)。

1.3 建模選取50只SPF級SD雄性大鼠,腹腔注射40 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉大鼠,固定后,進(jìn)行常規(guī)備皮、消毒,然后暴露出兩側(cè)聽泡,在其表面相鄰2 mm處穿刺2個小孔以進(jìn)入中耳腔,從其中一個孔注射50 μL 1×1011CFU·L-1的Ⅲ型肺炎鏈球菌懸液,另一個孔用于注射過程中排氣,注射完成后用骨蠟封閉穿刺孔,逐層縫合傷口,同時給大鼠注射4萬U的青霉素鈉以預(yù)防感染,每天1次,注射3 d,待蘇醒后將大鼠放回籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng),2周后,耳鏡觀察到鼓膜充血,鼓室混濁,部分可見液平面及中耳內(nèi)氣泡形成,則視為造模成功,大鼠建模過程中因感染或意外死亡3只,其余均建模成功。

1.4 分組及給藥從建模成功的大鼠中隨機(jī)選取40只,將其分為模型(MO)組,地骨皮甲素(OS)組,IL-33/ST2信號抑制劑(ST)組,地骨皮甲素+IL-33/ST2信號抑制劑(UN)組,每組10只,同時選取剩余10只正常大鼠作為正常對照(NO)組,對OS組灌胃40 mg·kg-1的地骨皮甲素[15],對ST組灌胃0.2 mL 1 kg·L-1的anti-ST2,對UN組灌胃40 mg·kg-1的地骨皮甲素和0.2 mL 1 kg·L-1的anti-ST2,兩組均1 d一次,持續(xù)14 d,NO組、MO組同期給予灌胃同體積生理鹽水。

1.5 聽性腦干反應(yīng)檢測聽力水平實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,應(yīng)用誘發(fā)電位儀對各組大鼠進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem responses,ABR)閾值檢測,將大鼠置于隔音室中,記錄電極(藍(lán)色)放置于額部皮下,參考電極(黑色)放置于同側(cè)耳后皮下,接地電極(紅色)放置于對側(cè)耳后皮下,屏蔽耳機(jī)置 于外耳道口,然后耳機(jī)給聲,ABR刺激聲是短聲,以click聲作為誘發(fā)音源,脈沖寬度0.1 ms,刺激重復(fù)率20 Hz,疊加1 000次,從110 dB SPL開始,逐次減低10 dB SPL,以波Ⅲ剛出現(xiàn)時的聲音強(qiáng)度做為聽覺反應(yīng)閾值,記錄短聲click及8、16、32 kHz純音聽力閾值。

1.6 標(biāo)本采集聽力測試完成后,腹腔注射40 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,取聽泡鉆孔,用PBS灌洗中耳腔3次,收集灌洗液,在4 000 r·min-1條件下離心10 min,取上清液,置于冰箱密封保存,同時取主動脈血,離心后取上清液置于冰箱密封保存,并取中耳黏膜組織,10%福爾馬林中固定48 h后,置于冰箱密封保存。

1.7 HE法檢測大鼠中耳黏膜病理形態(tài)取各組大鼠中耳黏膜組織,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水后,蒸餾水洗滌2次,用蘇木精染色2 min,自來水沖洗后,用1% 鹽酸乙醇分化30 s,自來水沖洗,伊紅染色2 min,自來水沖洗后,切片在無水乙醇內(nèi)來回?fù)u蕩數(shù)秒,重復(fù)1次,待風(fēng)干后,進(jìn)行脫水、透明、中性樹膠封片處理,用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠免疫功能取各組大鼠耳泡灌洗液及血清,嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明檢測Th1細(xì)胞因子干擾素-γ(interferon,INF-γ)、Th2細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4(interleukin,IL-4),依次進(jìn)行繪制樣本布局表、配置試劑標(biāo)準(zhǔn)品、清洗孔板、加樣、覆膜、洗版、加顯色劑終止液處理,實(shí)驗(yàn)完成后立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長處,測定每孔吸光度A,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算INF-γ、IL-4的含量。

1.9 Real-time PCR法檢測ENaC mRNA相對表達(dá)取各組大鼠中耳黏膜組織,用TRIzol試劑提取總RNA,用cDNA 第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后利用熒光實(shí)時定量PCR儀測定α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC基因轉(zhuǎn)錄差異,反應(yīng)條件為,95 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃ 20 s、59℃ 20 s、72 ℃ 30 s循環(huán)進(jìn)行40次,72 ℃延伸5 min,在82.5 ℃檢測熒光強(qiáng)度并收集α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC熒光信號,反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,以同一樣本中的GAPDH的Ct值作為內(nèi)參,采用 2-ΔΔCt計(jì)算其基因相對表達(dá)量,引物序列見Tab 1。

1.10 免疫印跡法檢測IL-33/ST2信號相關(guān)蛋白表達(dá)取各組中耳黏膜組織,清洗、剪碎后置于離心管中,加入蛋白質(zhì)裂解液后研磨成勻漿,冰上振蕩30 min,在4 ℃、13 000 r·min-1的條件下離心15 min,取上清液用BCA法測定蛋白濃度,處理好待測樣品后,用SDS-PAWE 凝膠電泳試劑盒進(jìn)行電泳分離,電泳完成后在冰浴下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1.5 h,封閉1 h,按說明書用封閉液稀釋一抗(1 ∶1 000),加入稀釋的IL-33、ST2一抗,4 ℃搖床振蕩1 h,PBS洗滌3次,加入稀釋的二抗(1 ∶5 000),37 ℃輕搖室溫孵育2 h;PBS洗滌3次,顯色液顯影,用ECL熒光試劑盒測定結(jié)果,利用凝膠成像儀成像后,進(jìn)行灰度值檢測,以同一樣本中的GAPDH作為內(nèi)參,計(jì)算比值求得IL-33、ST2蛋白的相對表達(dá)含量。

Tab 1 α-ENaC, β-ENaC, γ-ENaC primer sequence

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠聽力水平結(jié)果與NO組相比,MO組大鼠click及8、16、32 kHz純音聽力閾值顯著升高(P<0.05),與MO組比較,OS組、ST組、UN組大鼠click及8、16、32 kHz純音聽力閾值顯著降低(P<0.05),且ST組與 OS組相比無明顯差異(P>0.05),UN組比ST組降低明顯(P<0.05),見Fig 1。

Fig 1 Hearing level of rats in each

2.2 各組大鼠中耳黏膜HE結(jié)果NO組大鼠中耳黏膜組織正常,黏膜、血管呈暗紅色,且未見明顯炎性細(xì)胞浸潤,MO組中耳黏膜細(xì)胞出現(xiàn)明顯腫脹,且有多處細(xì)胞脫落,黏膜明顯增厚,可見大量炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生,與MO組相比,OS組、ST組、UN組病理癥狀明顯改善,黏膜腫脹程度明顯好轉(zhuǎn),炎性細(xì)胞浸潤數(shù)量明顯減少,見Fig 2。

2.3 各組大鼠免疫功能結(jié)果與NO組相比,MO大鼠耳泡灌洗液及血清中INF-γ含量明顯降低(P<0.05),IL-4含量明顯升高(P<0.05),與MO組比較,OS組、ST組、UN組耳泡灌洗液及血清中INF-γ含量明顯升高(P<0.05),IL-4含量明顯降低(P<0.05),且ST組與OS組相比無明顯差異(P>0.05),UN組比ST組變化明顯(P<0.05),見Tab 2。

Fig 2 Pathological morphology of middle ear mucosa of rats in each group (HE×100)

Tab 2 Levels of immune function related indexes of rats in each

2.4 各組大鼠中耳黏膜組織ENaC mRNA相對表達(dá)結(jié)果與NO組相比,MO組大鼠中耳黏膜組織中α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05),與MO組比較,OS組、ST組、UN組中耳黏膜組織中α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05),且ST組與 OS組相比無明顯差異(P>0.05),UN組比ST組升高明顯(P<0.05),見Tab 3。

Tab 3 Middle ear mucosa of rats in each group α- ENaC, β- ENaC, γ- ENaC mRNA

2.5 各組大鼠中耳黏膜組織中IL-33/ST2信號相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果與NO組相比,MO組大鼠中耳黏膜組織中IL-33、ST2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),與MO組比較,OS組、ST組、UN組大鼠中耳黏膜組織中IL-33、ST2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),且ST組與OS組相比無明顯差異(P>0.05),UN組比ST組降低明顯(P<0.05),見Fig 3,4。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),肺炎鏈球菌是中耳炎發(fā)生、發(fā)展過程中的最常見致病菌,可占60%左右,因此本文選擇其作為致病菌建立中耳炎大鼠模型[7-8]。中醫(yī)理論中,中耳炎屬于“耳閉”、耳脹等范疇,其病機(jī)主要為正氣不足、風(fēng)邪外襲、內(nèi)蘊(yùn)濕熱,以致痞塞耳竅、濕濁困耳、耳竅失養(yǎng)、清竅失聰?shù)?因此健脾益氣、補(bǔ)肺益腎、去濕化濁、清氣通竅是關(guān)鍵所在[9-10]。地骨皮是一種常用的中藥材,其味甘、性寒,歸肝、肺、腎經(jīng),具有清肺降火、涼血除蒸之功效,而地骨皮甲素是從其中分離出的一種生物堿類物質(zhì),不僅具有地骨皮的作用,還兼之抗炎、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)、抗腫瘤等多種功效[11]。本文研究發(fā)現(xiàn),地骨皮甲素具有顯著療效,其可顯著提高中耳炎大鼠聽力水平,改善病理損傷。對于中耳炎大鼠,地骨皮甲素主要是通過抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用,來抑制機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生,從而抑制炎癥因子、黏附性因子的表達(dá)及分泌、抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生等,進(jìn)而達(dá)到改善中耳黏膜病理形態(tài)的目的,最終有效提高大鼠聽力水平。卡迪麗婭·木拉提等[12]研究發(fā)現(xiàn),對于分泌性中耳炎大鼠,地骨皮甲素具有顯著療效,可有效改善大鼠中耳組織病理形態(tài),提高INF-γ含量,降低IL-4含量,這與本文結(jié)果類似。

Fig 3 Expression of IL-33 and ST2 protein in middle ear mucosaof rats in each

Fig 4 Electrophoresis of IL-33 and ST2 protein expressionin middle ear mucosa of rats in each group

Th1/Th2細(xì)胞因子分泌失調(diào)是多種免疫炎癥疾病的發(fā)病基礎(chǔ),中耳炎也是如此,INF-γ是Th1細(xì)胞分泌的標(biāo)志因子,IL-4是Th2細(xì)胞分泌的標(biāo)志因子,因此檢測INF-γ、IL-4可有效反映Th1/Th2失衡情況。研究發(fā)現(xiàn),中耳黏膜與呼吸道黏膜具有同源性,既中耳黏膜表面同樣覆蓋著氣道表面液體,維持著中耳腔的液體平衡,從而確保其保持相對干燥狀態(tài),進(jìn)而保證聲波從鼓膜正常的傳導(dǎo)至內(nèi)耳,而ENaC作為介導(dǎo)液體吸收的主要通道,在其中發(fā)揮著不可或缺的作用,因此越來越受到臨床工作者的重視[13]。本文研究表明,地骨皮甲素可顯著提高INF-γ含量,降低IL-4含量,并促進(jìn)α-ENaC、β-ENaC、γ-ENaC mRNA表達(dá),這說明其可有效改善大鼠免疫功能,促進(jìn)鈉通道表達(dá)。對于中耳炎大鼠,地骨皮甲素可能是通過調(diào)控相關(guān)信號通路的表達(dá),來調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng),從而抑制炎癥介質(zhì)的合成及釋放、減少對肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞刺激等,進(jìn)而有效調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,糾正Thl/Th2細(xì)胞免疫失衡,并改善機(jī)體液體平衡,加快耳泡中積液的清除,最終達(dá)到提高免疫功能,促進(jìn)鈉通道表達(dá)的目的。鐘倫坤等[14]研究發(fā)現(xiàn),分泌性中耳炎大鼠INF-γ含量明顯降低,IL-4含量明顯升高,給予治療后,INF-γ含量明顯升高,IL-4含量明顯降低,這與本文結(jié)果類似。

而近年來研究發(fā)現(xiàn),IL-33與ST2結(jié)合后可誘導(dǎo)大量Th2細(xì)胞向炎癥部位轉(zhuǎn)移,促使其分泌大量炎癥因子,從而引起以Th2細(xì)胞為主的一系列免疫炎癥反應(yīng),因此,可推測IL-33/ST2信號與中耳炎進(jìn)展密切相關(guān),可能是導(dǎo)致其遷延不愈的重要因素[15]。本文研究發(fā)現(xiàn),與MO組比較,OS組、ST組、UN組大鼠中耳黏膜組織中IL-33、ST2蛋白表達(dá)顯著降低,且ST組與 OS組相比無明顯差異,UN組比ST組降低明顯,這說明地骨皮甲素可有效抑制IL-33/ST2信號,其作用與IL-33/ST2信號抑制劑相同,且與IL-33/ST2信號抑制劑聯(lián)合后效果更佳,故可推測地骨皮甲素可通過IL-33/ST2信號發(fā)揮作用。而對于中耳炎大鼠,地骨皮甲素可能是通過調(diào)控上游相關(guān)信號通路,來抑制IL-33的合成及分泌,從而抑制與ST2的結(jié)合,達(dá)到抑制IL-33/ST2信號激活的目的,進(jìn)而抑制免疫炎癥的發(fā)生、抑制Th2細(xì)胞的遷移等,最終有效改善大鼠臨床癥狀。顧瀟怡等[16]研究發(fā)現(xiàn),IL-33在分泌性中耳炎中表達(dá)異常升高,從而使Th1/Th2信號傳導(dǎo)系統(tǒng)失衡,進(jìn)而促進(jìn)中耳炎進(jìn)程,這與本文結(jié)果類似。

綜上所述,地骨皮甲素具有顯著療效,可顯著改善中耳炎大鼠免疫功能,促進(jìn)鈉通道表達(dá),其作用機(jī)制可能與抑制IL-33/ST2信號有關(guān)。但本文還存在一定不足,如未進(jìn)行多樣本、多中心研究,未設(shè)置多劑量組,未進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等,在以后的實(shí)驗(yàn)中會繼續(xù)深入研究,以期為臨床提供更多、更可靠的數(shù)據(jù)支持。