林云釵,王 航,周 強(qiáng)

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,福建 福州 350000;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院濱海院區(qū)國(guó)家區(qū)域醫(yī)療中心心血管內(nèi)科,福建 福州 350212;3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部,4.廈門(mén)大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院內(nèi)分泌科,福建 福州 350000)

動(dòng)脈粥樣硬化是誘發(fā)多種心血管疾病的重要原因,人血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移異?？纱龠M(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展[1-2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)是一種長(zhǎng)度超過(guò)220 nt的非編碼RNA分子,其可充當(dāng)微小RNA(microRNA,miRNA)競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)分子而參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過(guò)程[3-4]。LINC00707在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)水平升高,干擾其表達(dá)可抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[5]。但還沒(méi)有相關(guān)研究報(bào)道LINC00707在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。此外,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p在LINC00707上有結(jié)合位點(diǎn)。miR-30c-5p在氧化型低密度脂蛋白(oixidized low-density lipoprotein,ox-LDL)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平降低,上調(diào)其表達(dá)可減輕細(xì)胞損傷[6]。然而,miR-30c-5p在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中的作用尚未有研究。因此,本研究用ox-LDL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞HVSMCs建立體外動(dòng)脈粥樣硬化細(xì)胞模型,進(jìn)而探索LINC00707在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程中作用,此外,我們還探索miR-30c-5p是否為L(zhǎng)INC00707的功能靶標(biāo),以及LINC00707是否通過(guò)影響miR-30c-5p表達(dá)水平發(fā)揮其調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人血管平滑肌細(xì)胞HVSMC(HTX2352)購(gòu)自深圳市豪地華拓生物;ox-LDL(IO1300)、CCK-8試劑(CA1210)購(gòu)自北京索萊寶;DMEM培養(yǎng)基(12430047)、胎牛血清(10100147)與胰蛋白酶(15400054)購(gòu)自美國(guó)Gibco;美國(guó)Invitrogen提供LipofectamineTM3000(L3000075)、TRIzol試劑(15596026CN)、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑;廣州銳博生物合成si-NC、si-LINC00707、miR-NC、miR-30c-5p mimic、anti-miR-NC、miR-30c-5p Inhibitor;Transwell小室(PI8P01250)購(gòu)自美國(guó)Corning;IL-6(ml058097)、TNF-α(ml077385)、IL-10(ml064299)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物;雙熒光素酶報(bào)告基因載體(E1330)購(gòu)自美國(guó)Promega;美國(guó)Santa Cruz提供一抗抗體[兔抗人E-cadherin(ab40772)、N-cadherin(ab18203)抗體]與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(ab205781)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái),上海赫田科學(xué)儀器有限公司;PCR儀,德國(guó)Eppendorf公司;7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,美國(guó)ABI公司;DW-110W192超低溫冰箱,廣州傲雪制冷設(shè)備有限公司;渦旋振蕩器,韓國(guó)JeioTech公司;ELX800型酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Tek公司;CKX41型倒置顯微鏡,日本Olympus公司;Smartspec3000型分光光度計(jì),美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 將HVSMCs培養(yǎng)于含有100 mg·L-1ox-LDL的DMEM培養(yǎng)基的6孔板(1×105個(gè)/孔)中孵育24 h[7],記為ox-LDL組。在不含有ox-LDL的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞做為對(duì)照組(Con組)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞經(jīng)100 mg·L-1ox-LDL刺激24 h,分別記為ox-LDL+si-NC組、ox-LDL+si-LINC00707組、ox-LDL+miR-NC組、ox-LDL+miR-30c-5p mimic組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-LINC00707和anti-miR-NC、si-LINC00707和miR-30c-5p Inhibitor分別共轉(zhuǎn)染至HVSMCs,隨后細(xì)胞經(jīng)100 mg·L-1ox-LDL刺激24 h,分別記為ox-LDL+si-LINC00707+anti-miR-NC組、ox-LDL+si-LINC00707+miR-30c-5p Inhibitor 組。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中LINC00707、miR-30c-5p的表達(dá)水平 使用TRIzol試劑根據(jù)制造商說(shuō)明從細(xì)胞中分離和提取總RNA。為了量化mRNA表達(dá),使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后使用PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。GAPDH和U6分別作為L(zhǎng)INC00707和miR-30c-5p 檢測(cè)的內(nèi)對(duì)照,采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4CCK-8實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按每孔3×103個(gè)細(xì)胞的密度播種到96孔板中。每孔中加入100 μL含有CCK-8的新鮮培養(yǎng)基,37 ℃孵育2 h,在450 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 取各組HVSMCs細(xì)胞接種于小室的上室(1×105個(gè)/孔),下室添加500 μL含有20% FBS的完全培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h,用多聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞20 min,0.1%結(jié)晶紫染色10 min,隨機(jī)挑選5個(gè)區(qū)域于顯微鏡下計(jì)數(shù)染色細(xì)胞。

1.2.6ELISA法 將對(duì)照緩沖液和HVSMCs培養(yǎng)液上清加入到含有IL-6 和IL-1β抗體的ELISA孔板中,37 ℃孵育2 h。清洗后,每孔加入100 μL二抗偶聯(lián)HRP,孵育2 h。清洗后,將100 μL處理過(guò)的TMB加入各孔,避光,孵育15 min,加終止液終止反應(yīng),測(cè)定吸光度值。

1.2.7雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) Starbase預(yù)測(cè)miR-30c-5p在LINC00707上存在互補(bǔ)序列。將預(yù)測(cè)的序列擴(kuò)增并克隆到pmirGLO載體以構(gòu)建野生型WT-LINC00707載體。采用點(diǎn)突變手段獲得預(yù)測(cè)序列的突變序列,隨后構(gòu)建突變型MUT-LINC00707載體。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將WT-LINC00707、MUT-LINC00707分別與miR-NC或miR-30c-5p mimic共轉(zhuǎn)染至HVSMCs。24 h后,檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.8Western blot 將各組細(xì)胞與500 μL含有1% PMSF蛋白酶抑制劑的預(yù)冷裂解緩沖液孵育30 min,提取總蛋白,用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE分離40 μg蛋白后,將分離的條帶轉(zhuǎn)膜,脫脂奶粉封閉培養(yǎng)2 h。加入E-cadherin(1 ∶1 000)、N-cadherin(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶3 000)一抗稀釋液,與PVDF膜在4 ℃條件下孵育24 h,隨后加入二抗稀釋液(1 ∶5 000)室溫下孵育1 h。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光試劑和ImageJ軟件檢測(cè)和分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 抑制LINC00707對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HVSMCs活性、遷移的影響與Con組比較,ox-LDL組LINC00707的表達(dá)量升高(P<0.05),miR-30c-5p的表達(dá)量降低(P<0.05),細(xì)胞存活率和N-cadherin蛋白水平升高(P<0.05),遷移細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05),E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05);與ox-LDL組、ox-LDL+si-NC組比較,ox-LDL+si-LINC00707組中LINC00707的表達(dá)量降低(P<0.05),miR-30c-5p的表達(dá)量升高(P<0.05),細(xì)胞存活率和N-cadherin蛋白水平降低(P<0.05),遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05),E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05),見(jiàn)Fig 1、Tab 1。

Tab 1 Effect of inhibiting LINC00707 on active migration of HVSMCs induced by

Fig 1 Effect of LINC00707 inhibition on HVSMC migration-and migration-related protein expression induced by ox-LDL

2.2 抑制LINC00707對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HVSMCs中炎性因子的影響與Con組比較,ox-LDL組IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05),IL-10的水平降低(P<0.05);與ox-LDL組、ox-LDL+si-NC組比較,ox-LDL+si-LINC00707組IL-6、TNF-α的水平降低(P<0.05),IL-10的水平升高(P<0.05),見(jiàn)Tab 2。

2.3 LINC00707靶向調(diào)控miR-30c-5pmiR-30c-5p在LINC00707上存在結(jié)合位點(diǎn),見(jiàn)Fig 2。過(guò)表達(dá)miR-30c-5p可降低WT-LINC00707載體的熒光素酶活性(P<0.05),見(jiàn)Tab 3。si-LINC00707組miR-30c-5p的表達(dá)量比si-NC組中的高(P<0.05),見(jiàn)Tab 4。

Fig 2 Binding site for miR-30c-5p on LINC00707

Tab 2 Effect of inhibitory LINC00707 on inflammatory factors in HVSMCs induced by

Tab 3 Dual-luciferase reporter assay

Tab 4 Expression of miR-30c-5p regulated by LINC00707

2.4 miR-30c-5p在ox-LDL誘導(dǎo)的HVSMCs中的調(diào)控作用ox-LDL+miR-30c-5p mimic組與ox-LDL+miR-NC組比較,細(xì)胞存活率和N-cadherin蛋白含量降低(P<0.05),遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05),E-cadherin蛋白含量和IL-10的水平升高(P<0.05),IL-6、TNF-α的水平降低(P<0.05),見(jiàn)Fig 3、Tab 5。

Fig 3 Effects of miR-30c-5p on migration and expression of HVSMCs and migration-related proteins induced by ox-LDL

2.5 miR-30c-5p表達(dá)下調(diào)在ox-LDL誘導(dǎo)的HVSMCs中對(duì)LINC00707沉默介導(dǎo)作用的影響與ox-LDL+si-LINC00707+anti-miR-NC組比較,ox-LDL+si-LINC00707+miR-30c-5p Inhibitor 組細(xì)胞存活率和N-cadherin蛋白水平升高(P<0.05),遷移細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05),E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05),見(jiàn)Fig 4、Tab 6。

2.6 抑制miR-30c-5p對(duì)抑制LINC00707處理的ox-LDL誘導(dǎo)的HVSMCs中炎性因子的影響與ox-LDL+si-LINC00707+anti-miR-NC組比較,ox-LDL+si-LINC00707+miR-30c-5p Inhibitor 組IL-6、TNF-α的水平升高(P<0.05),IL-10的水平降低(P<0.05),見(jiàn)Tab 7。

Fig 4 Effects of inhibition of miR-30c-5p on inhibition of HVSMC migration and migration-related protein expression induced by ox-LDL treated with LINC00707

3 討論

ox-LDL可通過(guò)引發(fā)炎癥等促進(jìn)人血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移,并可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展[8-9]。LncRNA在動(dòng)脈粥樣硬化中表達(dá)異常,并可通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA/mRNA分子軸而調(diào)節(jié)ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移等,還可能作為動(dòng)脈粥樣硬化防治的潛在靶點(diǎn)[10-11]。

Tab 5 Effects of miR-30c-5p on active migration and inflammatory factors of HVSMCs induced by ox-LDL

Tab 6 Effects of inhibition of miR-30c-5p on active migration of HVSMCs induced by ox-LDL treated with LINC00707

Tab 7 Effects of inhibition of miR-30c-5p on inflammatory factors induced in HVSMCs induced by ox-LDL treated with LINC00707

LINC00707在LPS誘導(dǎo)的人胚肺細(xì)胞中高表達(dá),敲低其表達(dá)可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而減輕細(xì)胞損傷[12]。沉默LINC00707可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[13]。但LINC00707在ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)及其作用尚未可知。在本次試驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)LINC00707的表達(dá)量在ox-LDL誘導(dǎo)的HVSMCs中明顯升高,提示LINC00707在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示,ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞存活率升高,遷移細(xì)胞數(shù)增多,N-cadherin表達(dá)上調(diào),而E-cadherin表達(dá)下調(diào),與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果相似[14],而抑制LINC00707表達(dá)后ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞存活率降低,遷移細(xì)胞數(shù)減少,N-cadherin表達(dá)下調(diào),E-cadherin表達(dá)上調(diào),提示抑制LINC00707表達(dá)可減弱ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移能力。此外,IL-6、TNF-α的含量在ox-LDL誘導(dǎo)的HVSMCs中升高,而IL-10的表達(dá)量則降低,也與已發(fā)表研究結(jié)果相似[15],而抑制LINC00707表達(dá)可降低IL-6、TNF-α的水平,增加IL-10的水平,提示LINC00707低表達(dá)可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生而抑制炎癥反應(yīng)。

miR-30c-5p通過(guò)靶向OPG進(jìn)而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分化[16]。miR-30c-5p過(guò)表達(dá)可通過(guò)逆轉(zhuǎn)ox-LDL誘導(dǎo)的凋亡及炎癥反應(yīng)減輕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[17]。miR-30c-5p過(guò)表達(dá)可減輕膿毒癥引起的急性腎損傷[18]。此外,miR-30c-5p可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡及自噬活性,進(jìn)而減輕新型隱球菌感染程度。本研究結(jié)果顯示,在ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞中miR-30c-5p的表達(dá)量降低,初步證實(shí)LINC00707可負(fù)向調(diào)控miR-30c-5p的表達(dá),miR-30c-5p過(guò)表達(dá)可降低ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移能力及炎癥反應(yīng),而抑制miR-30c-5p表達(dá)可拮抗LINC00707低表達(dá)對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HVSMCs損傷的抑制作用。

綜上所述,LINC00707在ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞中高表達(dá),而miR-30c-5p則表現(xiàn)出低表達(dá)趨勢(shì)。功能實(shí)驗(yàn)顯示,下調(diào)LINC00707可通過(guò)靶向作用導(dǎo)致miR-30c-5p表達(dá)上調(diào),從而抑制ox-LDL誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、增殖和遷移,提示LINC00707/miR-30c-5p通路可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程,為發(fā)展治療該疾病的方法提供了新的策略。然而,我們?nèi)孕柽M(jìn)一步探索是否還有其他miRNAs參與LINC00707對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程的調(diào)控作用。另外,鑒于miRNAs能夠通過(guò)抑制靶mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解來(lái)調(diào)節(jié)生理和病理過(guò)程,在隨后的研究中還需要探索miR-30c-5p的靶mRNA是否參與LINC00707對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過(guò)程的調(diào)控作用。