向凡舒，蔡文超，郭 壯，劉慧杰，余海燕，單春會(huì)*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆特色果蔬貯藏加工教育部工程研究中心，新疆 石河子 832000；2.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽(yáng) 441053；3.北京忠和房縣生物食品有限公司，湖北 十堰 442100；4.湖北廬陵王酒業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 十堰 442100）

米酒，又稱(chēng)醪糟，其作為國(guó)酒的起源，釀造歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)[1]，因酒香濃郁、口感甘甜和營(yíng)養(yǎng)豐富，深受中國(guó)和日本等亞洲國(guó)家人群的喜愛(ài)[2]。在米酒的發(fā)展歷程中，相關(guān)從業(yè)人員對(duì)其釀造工藝進(jìn)行了許多創(chuàng)新，例如在米酒制作中添加其他原料，增添營(yíng)養(yǎng)組分或提升風(fēng)味[3]；使用酵母和酶制劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)米酒曲進(jìn)行純種發(fā)酵，減少能耗，提高效率[4]。除了釀造工藝，微生物對(duì)米酒品質(zhì)的形成亦發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5]，因而許多科研人員開(kāi)始解析米酒和米酒曲中的微生物群系。通過(guò)比較江蘇蘇州與湖北宜昌地區(qū)米酒的微生物類(lèi)群，Lu Yucai等[6]發(fā)現(xiàn)蘇州米酒中的真菌以扣囊覆膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和米根霉（Rhizopus oryzae）為主，宜昌米酒以米根霉和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）為主；兩個(gè)地區(qū)米酒中的細(xì)菌均以檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）和微小桿菌屬（Exiguobacterium）為主，且細(xì)菌多樣性要顯著大于真菌多樣性。Zhao Xinxin等[7]對(duì)湖北、四川和廣西地區(qū)米酒曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的細(xì)菌組成較為相似，均以魏斯氏菌屬（Weissella）為主，但在細(xì)菌結(jié)構(gòu)上，湖北和四川地區(qū)的米酒曲更為相似，廣西地區(qū)較為不同。此外，日本的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，即便在使用以酵母為主的發(fā)酵劑發(fā)酵時(shí)，米酒中仍存在著較多的細(xì)菌類(lèi)群[8]。上述研究表明米酒和米酒曲中的微生物形成可能受到了原料來(lái)源、地域環(huán)境和發(fā)酵過(guò)程等多重因素的影響，且細(xì)菌在米酒的發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮了不可或缺的作用。

我國(guó)四川省大竹縣擁有“醪糟之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，當(dāng)?shù)孛拙票涣腥朐谖覈?guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品名列之中。然而目前針對(duì)大竹米酒的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道，因而全面解析大竹米酒的品質(zhì)以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)十分必要。隨著技術(shù)的不斷更新，電子舌等一系列仿生設(shè)備憑借其檢測(cè)快速和數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)逐漸取代了冗長(zhǎng)而費(fèi)力的常規(guī)檢測(cè)方法，在食品質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域占據(jù)了極大的優(yōu)勢(shì)[9]。Illumina MiSeq是實(shí)現(xiàn)測(cè)序高效、準(zhǔn)確且低成本的理想平臺(tái)，亦是使用最為廣泛的第二代測(cè)序平臺(tái)之一，在醫(yī)學(xué)、生物和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域均被廣泛應(yīng)用[10]。目前也作為解析大曲[11]、泡菜[12]和黃酒[13]等眾多發(fā)酵食品微生物類(lèi)群的主要方法之一。

本研究在使用電子舌對(duì)大竹米酒滋味品質(zhì)實(shí)現(xiàn)數(shù)字化評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，對(duì)其有機(jī)酸和游離氨基酸種類(lèi)及含量進(jìn)行測(cè)定，采用純培養(yǎng)法對(duì)其中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定和保藏，結(jié)合MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)解析其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并對(duì)細(xì)菌菌群與滋味品質(zhì)間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行探究，最后將大竹米酒與恩施米酒的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及菌群功能進(jìn)行比較分析，以期為推動(dòng)當(dāng)?shù)孛拙频漠a(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供一定的理論參考依據(jù)，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品推廣起到一定的積極影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米酒于2 0 2 1 年5 月采集自四川省大竹縣（E106°59’～107°32’，N30°20’～31°00’）西門(mén)綜合市場(chǎng)和興光農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

M R S 合成培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；宏基因組DNA提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN公司；10×Buffer、dNTP緩沖液、TaqDNA聚合酶和T 載體 寶生物工程（大連）有限公司；正/反向引物3 3 8 F/8 0 6 R（正向引物序列3 3 8 F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；反向引物序列806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’） 上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SA402B電子舌（配備傳感器CA0、C00、AE1、CT0、AAE、GL1和2 個(gè)參比電極） 日本Insent公司；PHS-3C數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì) 上海越平科學(xué)儀器有限公司；L C-2 0 A D X R 高效液相色譜儀 日本島津公司；Biochrom 30＋全自動(dòng)氨基酸分析儀 英國(guó)Biochrom公司；Vetiri梯度基因擴(kuò)增儀 美國(guó)AB公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；R930機(jī)架式服務(wù)器 美國(guó)Dell公司；MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及處理

從四川大竹縣西門(mén)綜合市場(chǎng)和興光農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)共采集米酒樣品7 份，編號(hào)為DZ1～DZ7。所采集的樣品均為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶(hù)家庭制作，制作步驟如下：首先將糯米浸泡6 h，然后進(jìn)行蒸飯、攤涼和淋飯，待其溫度降至32 ℃時(shí)加入研磨成粉的米酒曲拌勻，之后將米飯裝入容器中鋪平并輕輕壓實(shí)，中心處挖一個(gè)洞，接著在容器口蓋上紗布，最后用棉被包裹整個(gè)容器保溫發(fā)酵2～3 d。當(dāng)米酒發(fā)酵好后，中心的洞會(huì)盛有汁水。將采集到的樣品分別裝入無(wú)菌采樣袋中低溫下運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，置于-40 ℃冰箱中備用。

1.3.2 米酒滋味品質(zhì)的數(shù)字化評(píng)價(jià)

樣品預(yù)處理：稱(chēng)取30 g米酒樣品于燒杯中，加入120 mL純水，攪拌均勻后轉(zhuǎn)移至200 mL離心杯，5 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行抽濾，將收集到的濾液置于-40 ℃?zhèn)溆?。之后參照王玉榮等[14]方法使用電子舌對(duì)米酒的滋味指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 米酒pH值和有機(jī)酸組分及其含量測(cè)定

參照酸度計(jì)使用說(shuō)明書(shū)，使用pH 6.86和pH 4.00的標(biāo)定液對(duì)酸度計(jì)進(jìn)行兩點(diǎn)標(biāo)定，繼而測(cè)定米酒的pH值。有機(jī)酸含量測(cè)定樣品前處理：稱(chēng)取10.0 g米酒樣品置于研缽中研碎后，將其轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，使用流動(dòng)相（0.01 mol/L K2HPO4溶液）定容，充分混勻后吸取1.5 mL勻液至2 mL EP管中，12 000 r/min離心3 min，取上清液使用0.22 μm濾膜過(guò)濾備用。參照王丹丹等[15]的方法制備7 種有機(jī)酸（草酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對(duì)有機(jī)酸組分及含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 氨基酸組分及其含量測(cè)定

樣品前處理方法參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》，預(yù)處理完成后參照馬佳佳等[16]的方法將樣品上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5 乳酸菌分離、純化和鑒定

參照張振東等[17]的方法對(duì)米酒中乳酸菌菌株進(jìn)行初步篩分并保藏，提取疑似乳酸菌菌株DNA，對(duì)序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增、產(chǎn)物清潔和連接轉(zhuǎn)化，最后挑取陽(yáng)性克隆子送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序返回的序列上傳至NCBI網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)確定其物種信息。

1.3.6 樣品宏基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

使用試劑盒提取米酒中細(xì)菌的宏基因組DNA，提取的DNA置于-20 ℃?zhèn)溆?。在?duì)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，先在引物中添加核苷酸標(biāo)簽（barcode），之后參照王玉榮等[18]的方法對(duì)總DNA的16S rRNA V3～V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，將檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序。

1.3.7 生物信息學(xué)分析

本研究采用QIIME平臺(tái)（v1.9.0）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先將測(cè)序返回的雙端序列進(jìn)行拼接和歸并，剔除錯(cuò)配率≥0.2、引物堿基錯(cuò)配數(shù)≥2 bp或barcode堿基有錯(cuò)配的低質(zhì)量序列[19]，使用UCLUST兩步法對(duì)有效序列按照100%和97%相似度構(gòu)建可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）[20]，刪除含有嵌合體的OTU[21]，選取代表性序列在數(shù)據(jù)庫(kù)[22-24]中進(jìn)行比對(duì)并確立其生物分類(lèi)學(xué)地位；計(jì)算各樣品中細(xì)菌類(lèi)群的α多樣性指數(shù)，基于非加權(quán)的UniFrac距離解析大竹米酒與恩施米酒細(xì)菌類(lèi)群的β多樣性；采用PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件對(duì)大竹米酒與恩施米酒的細(xì)菌基因功能進(jìn)行預(yù)測(cè)[25]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用R軟件（v 4.1.1）繪制小提琴圖、氣泡圖、熱圖和啞鈴圖；使用MAGE7軟件構(gòu)建乳酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；使用Origin 2019軟件制作主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）散點(diǎn)圖和主成分分析（principal component analysis，PCA）得分圖；使用SAS（v8）軟件計(jì)算優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與滋味品質(zhì)間的相關(guān)性系數(shù)，并使用Cytoscape（v3.7.2）軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖；利用在線(xiàn)作圖網(wǎng)站（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）制作LEfSe圖；采用Mood-median檢驗(yàn)法計(jì)算顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 大竹米酒滋味品質(zhì)評(píng)價(jià)及有機(jī)酸和氨基酸種類(lèi)和含量分析

首先利用電子舌對(duì)大竹米酒的滋味品質(zhì)進(jìn)行數(shù)字化評(píng)價(jià)，繼而對(duì)其有機(jī)酸及游離氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定。由圖1A可知，大竹米酒在咸味、酸味和苦味指標(biāo)上的差異較大，而在后味A、后味B和豐味指標(biāo)上的差異較小。由圖1B可知，大竹米酒的pH值在3.59～4.06之間；乳酸是大竹米酒中含量最豐富的有機(jī)酸，平均含量達(dá)8.82 mg/g，其次為乙酸、琥珀酸和檸檬酸，平均含量分別為6.27、3.75 mg/g和2.63 mg/g，而蘋(píng)果酸和草酸含量較低。由圖1C可知，在7 份米酒中共檢測(cè)出15 種氨基酸，平均氨基酸總量達(dá)39.6 mg/g。其中包含7 種必需氨基酸，累計(jì)平均含量為14.5 mg/g，非必需氨基酸累計(jì)平均含量為25.1 mg/g；谷氨酸是大竹米酒中含量最高的氨基酸（8.06 mg/g），其次為亮氨酸（4.10 mg/g）和天冬氨酸（3.94 mg/g）等，纈氨酸含量最低（0.576 mg/g）。

圖1 大竹米酒各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度（A）、有機(jī)酸（B）和氨基酸（C）含量分析Fig.1 Relative intensity of taste attributes (A), and organic acid (B)and amino acid (C) contents of Dazhu rice wine

2.2 基于純培養(yǎng)技術(shù)大竹米酒中乳酸菌的分離和鑒定

本研究進(jìn)一步對(duì)大竹米酒中的乳酸菌進(jìn)行分離，并對(duì)菌株進(jìn)行純化保藏和鑒定。從7 份大竹米酒中共分離出14 株疑似乳酸菌菌株，樣品DZ1～DZ7中分別分離出1、1、3、4、1、2 株和2 株。選取了其中3 株分離株的菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)進(jìn)行呈現(xiàn)，并依據(jù)所有分離株的鑒定序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖2A可知，米酒中的分離株菌落顏色均為白色，表面光滑且濕潤(rùn)，但形狀各異。菌株DZ2-1菌落呈圓形，較扁平，周?chē)该魅^大；菌株DZ3-3菌落呈圓形，較隆起，周?chē)该魅^小；菌株DZ4-4菌落呈水滴形，較隆起，周?chē)鸁o(wú)明顯透明圈。由圖2B可知，菌株DZ2-1細(xì)胞形態(tài)為球形，菌株DZ3-3為短桿狀，而菌株DZ4-4為短棒狀。由圖2C系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，14 株分離株共鑒定到5 個(gè)種，2 株被鑒定為副干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus paracasei），2 株被鑒定為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum），4 株被鑒定為發(fā)酵黏液乳桿菌（Limosilactobacillus fermentum），2 株被鑒定為假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides），4 株被鑒定為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），均屬于乳酸菌類(lèi)群。

2.3 基于MiSeq技術(shù)大竹米酒細(xì)菌類(lèi)群解析

在對(duì)大竹米酒中乳酸菌進(jìn)行了初步分析后，進(jìn)一步采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，7 份米酒樣品通過(guò)測(cè)序共得到345 083 條序列，經(jīng)質(zhì)控后去除2 399 條低質(zhì)量序列，余下342 684 條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣品約含有48 954 條序列。所有高質(zhì)量序列共鑒定到了14 個(gè)門(mén)、39 個(gè)綱、61 個(gè)目、123 個(gè)科和194 個(gè)屬，分別從細(xì)菌門(mén)和屬水平上進(jìn)行了解析，并將相對(duì)含量大于1.0%的細(xì)菌門(mén)和屬定義為優(yōu)勢(shì)門(mén)和屬。由圖3A可知，大竹米酒中有2 個(gè)優(yōu)勢(shì)門(mén)，分別為厚壁菌門(mén)（Firmicutes，91.65%）和變形菌門(mén)（Proteobacteria，5.28%），累計(jì)相對(duì)含量達(dá)96.93%，且Firmicutes為DZ2、DZ6和DZ7樣品中唯一優(yōu)勢(shì)門(mén)。由圖3B可知，大竹米酒中有6 個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus，66.83%）、Pediococcus（9.23%）、Weissella（5.42%）、乳球菌屬（Lactococcus，4.47%）、明串珠菌屬（Leuconostoc，2.17%）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter，1.31%），累計(jì)相對(duì)含量達(dá)89.43%，但僅有Lactobacillus在所有樣品中的相對(duì)含量均大于1.0%。除了在樣品DZ2中以Pediococcus（56.74%）為含量最高的菌屬，其他樣品中含量最高的菌屬均為L(zhǎng)actobacillus。需要說(shuō)明的是，Zheng Jinshui等[26]對(duì)Lactobacillus進(jìn)行重新分類(lèi)后劃分出了23 個(gè)新屬，其中就包括在2.2節(jié)出現(xiàn)的Limosilactobacillus、Lacticaseibacillus和Lactiplantibacillus，然而這些信息目前還未在QIIME分析平臺(tái)的RDA、Greengenes和SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行更新，因而本研究基于MiSeq高通量測(cè)序注釋出的Lactobacillus包含了所有新屬。

圖3 大竹米酒中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)（A）和屬（B）分布情況及相對(duì)含量Fig.3 Distribution and relative content of dominant bacterial phyla (A) and genera (B) in Dazhu rice wine

我國(guó)湖北省恩施土家族苗族自治州生態(tài)環(huán)境良好，物種資源豐富，當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)發(fā)酵食品種類(lèi)眾多，例如醬豆[27]、米酒曲[28]和米酒[19]等，因而本研究在MG-RAST數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了團(tuán)隊(duì)此前研究的10 份恩施米酒樣品序列[19]，進(jìn)一步比較分析大竹地區(qū)與恩施地區(qū)米酒菌群結(jié)構(gòu)的α多樣性和β多樣性。如圖4A、B可知，大竹米酒與恩施米酒的平均Chao1指數(shù)分別為1 111和506，平均Shannon指數(shù)分別為4.18和1.90，兩地區(qū)米酒Chao1指數(shù)差異極顯著（P＜0.001），Shannon指數(shù)差異顯著（P＜0.05）。由圖4C可知，在非加權(quán)UniFrac距離的PCoA，兩個(gè)地區(qū)的米酒在空間排布上呈現(xiàn)出了明顯的分離趨勢(shì)。大竹米酒均分布在橫坐標(biāo)的正半軸上，且大多集中在縱坐標(biāo)的零點(diǎn)附近，而恩施米酒均分布在橫坐標(biāo)的負(fù)半軸和縱坐標(biāo)的整個(gè)坐標(biāo)軸上。由此可見(jiàn)，大竹米酒在細(xì)菌豐度和多樣性上差異較大。如圖5所示，在線(xiàn)性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）閾值得分為3.0時(shí)，兩個(gè)地區(qū)米酒中共有9 個(gè)菌群類(lèi)別存在顯著差異。大竹米酒中存在5 個(gè)差異類(lèi)群，其生物標(biāo)志物為L(zhǎng)actobacillus，恩施米酒中存在4 個(gè)差異類(lèi)別，其生物標(biāo)志物為Pediococcus。

圖4 大竹和恩施米酒的Chao1指數(shù)（A）、Shannon指數(shù)（B）及基于非加權(quán)的UniFrac距離PCoA（C）比較分析Fig.4 Comparative analysis of Chao1 index (A), Shannon index (B) and PCoA based on unweighted UniFrac distance (C) of Dazhu and Enshi rice wine

圖5 LDA圖Fig.5 Linear discriminant analysis

在比較了兩個(gè)地區(qū)米酒菌群結(jié)構(gòu)的差異后，對(duì)兩者細(xì)菌菌群的基因功能亦進(jìn)行了比較分析。將序列上傳至PICRUSt軟件比對(duì)共得到了4 402 個(gè)直系同源集（clusters of orthologous groups，COG），所有COG共注釋到了23 個(gè)功能類(lèi)別，如圖6所示。所有樣品中的菌群均在E、G、J、K、L和M功能上有較高的表達(dá)，而在A、B、N和Z上的表達(dá)量較低。由聚類(lèi)可知，兩個(gè)地區(qū)的米酒在菌群功能上沒(méi)有明顯的分離趨勢(shì)。然而，經(jīng)Mood-median檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)地區(qū)的米酒在B、F和J功能上差異顯著（P＜0.05），在G和K功能表達(dá)上差異非常顯著（P＜0.01）。

圖6 大竹和恩施米酒的細(xì)菌功能預(yù)測(cè)（a）及功能差異分析（b）Fig.6 Prediction of bacterial functions (a) and analysis of functional differences (b) between Dazhu and Enshi rice wine

2.4 大竹米酒各滋味指標(biāo)與細(xì)菌類(lèi)群的關(guān)聯(lián)性分析

進(jìn)一步針對(duì)菌群結(jié)構(gòu)和滋味品質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)性分析。由圖7A可知，在基于非加權(quán)UniFrac距離的PCA中，7 份米酒樣品在整個(gè)空間中呈現(xiàn)出了2 個(gè)明顯的聚類(lèi)，一個(gè)聚類(lèi)由DZ2、DZ4和DZ5組成，另一個(gè)聚類(lèi)由DZ3、DZ6和DZ7組成，而DZ1距離這2個(gè)聚類(lèi)均較遠(yuǎn)。由圖7B可知，基于滋味指標(biāo)7 份樣品被分成了3 個(gè)聚類(lèi)，一個(gè)聚類(lèi)為樣品DZ2、DZ3、DZ6和DZ7，一個(gè)聚類(lèi)為樣品DZ1和DZ5，另一個(gè)聚類(lèi)為樣品DZ4。結(jié)合圖7A、B可發(fā)現(xiàn)，在基于OTU水平和基于滋味指標(biāo)的兩個(gè)空間分布中，樣品呈現(xiàn)出的聚類(lèi)趨勢(shì)有部分重疊。因而本研究進(jìn)一步探討了優(yōu)勢(shì)菌屬和滋味指標(biāo)間的相關(guān)性。由圖7C可知，Lactobacillus和Lactococcus與各項(xiàng)滋味指標(biāo)更多呈正相關(guān)，而Pediococcus和Weissella與滋味指標(biāo)更多呈負(fù)相關(guān)，Leuconostoc和Acinetobacter與各項(xiàng)滋味指標(biāo)的相關(guān)性系數(shù)均較小。相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Weissella與后味A、澀味和苦味指標(biāo)間呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

圖7 基于OTU水平的非加權(quán)UniFrac距離PCoA（A）、基于滋味指標(biāo)的PCA得分圖（B）及優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與各滋味指標(biāo)的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖（C）Fig.7 Unweighted UniFrac distance PCoA based on OTU level (A),PCA score plot based on taste indicators (B) and correlation network plot of dominant bacterial genera with taste indicators (C)

3 討論與結(jié)論

本研究采用電子舌評(píng)價(jià)了米酒的酸、苦、澀、咸和鮮5 個(gè)基本味與后味A、后味B和豐味3 個(gè)回味，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大竹米酒在咸味指標(biāo)上較為突出，而酸味指標(biāo)較弱。通過(guò)Kang等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，韓國(guó)米酒與大竹米酒有相似的滋味特征。眾所周知，有機(jī)酸和游離氨基酸是食品中間重要的呈味物質(zhì)[30]。因而本研究進(jìn)一步檢測(cè)了米酒中的有機(jī)酸和游離氨基酸，結(jié)果顯示有機(jī)酸以乳酸和乙酸為主，游離氨基酸以谷氨酸、亮氨酸和天冬氨酸為主。乳酸菌發(fā)酵是碳水化合物代謝產(chǎn)生乳酸和乙酸的主要途徑[31]，這間接表明了乳酸菌是米酒發(fā)酵過(guò)程中較為活躍的細(xì)菌類(lèi)群，然而納入本研究的米酒其酸味卻較弱，這或許是因?yàn)槊拙频陌l(fā)酵周期通常較短，僅有2 d左右，大部分的糖還未被代謝成酸。此外，谷氨酸和天冬氨酸在酸性食品中可作為鮮味物質(zhì)的前體物質(zhì)，而亮氨酸本身呈現(xiàn)苦味，它們或許是構(gòu)成米酒中鮮味和苦味的原因之一。

在對(duì)米酒理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)的基礎(chǔ)上，采用純培養(yǎng)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的手段分別解析了大竹米酒中的乳酸菌與細(xì)菌類(lèi)群，結(jié)果表明由Firmicutes和Proteobacteria構(gòu)成了優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；Lactobacillus、Pediococcus和Weissella等乳酸菌類(lèi)群構(gòu)成了優(yōu)勢(shì)菌屬；乳酸菌菌種分別由L.fermentum、Pediococcus pentosaceus、L.paracasei、L.plantarum和L.pseudomesenteroides構(gòu)成。Kang等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在米酒發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中都占據(jù)主導(dǎo)地位，在發(fā)酵前期，它們能起到抑制腐敗菌的作用，這也為后期乙醇發(fā)酵提供了良好環(huán)境。值得注意的是，納入本研究的樣品中出現(xiàn)了Lactobacillus和Pediococcus含量分布不均一的現(xiàn)象。米酒曲作為米酒釀造的發(fā)酵劑，是米酒中微生物的主要來(lái)源，通常亦會(huì)含有部分Pediococcus[7]，因而米酒中菌群不均一的現(xiàn)象可能是由于曲中菌群不均一引起。此外，Weissella與后味A、澀味和苦味指標(biāo)之間呈顯著負(fù)相關(guān)，這表明適當(dāng)提高Weissella含量可能改善米酒中不適口的滋味品質(zhì)。發(fā)酵食品中呈現(xiàn)的苦澀味大多與具有高含量疏水性氨基酸的苦味肽有關(guān)[32]，在發(fā)酵過(guò)程中這些苦味肽通常由微生物分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生。有研究表明Weissella具有高產(chǎn)胞外多糖的特性[33]，它們產(chǎn)生的胞外多糖在加熱或不同pH值條件下均能夠與大豆分離蛋白結(jié)合產(chǎn)生更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[34]，還能在酸面團(tuán)的冷凍過(guò)程中降低面筋蛋白的解聚[35]。因而，米酒發(fā)酵在過(guò)程中，Weissella可能亦產(chǎn)生了胞外多糖并與原料中的蛋白質(zhì)發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)，阻礙了其他微生物對(duì)蛋白的分解，從而減少了部分苦味肽的產(chǎn)生。

利用PCoA對(duì)大竹米酒與恩施米酒的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 個(gè)地區(qū)米酒的細(xì)菌豐度和多樣性均存在顯著差異。使用LDA進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)大竹和恩施地區(qū)米酒中共存在9 個(gè)差異菌群類(lèi)別，生物標(biāo)志物分別為L(zhǎng)actobacillus和Pediococcus。從不同地域采集的同類(lèi)樣品其微生物類(lèi)群存在顯著差異這一現(xiàn)象在眾多發(fā)酵食品中均有所體現(xiàn)，例如大曲[36]、泡菜[37]和奶酪[38]等。因而，后續(xù)在針對(duì)發(fā)酵食品菌群的研究中可進(jìn)行多區(qū)域或是跨區(qū)域的樣品采集，亦可從發(fā)酵過(guò)程以及遺傳學(xué)上進(jìn)行多方面的綜合研究。功能預(yù)測(cè)結(jié)果顯示兩地區(qū)米酒中菌群的基因功能表達(dá)較為相似，僅在少數(shù)幾個(gè)功能上有差異。經(jīng)過(guò)發(fā)酵，糯米中的蛋白質(zhì)和淀粉等物質(zhì)逐漸被微生物分解利用，這也使得其細(xì)菌菌群在氨基酸和碳水化合物的運(yùn)輸與代謝功能上的表達(dá)普遍較高[39]。綜上所述，大竹米酒咸味突出，富含多種有機(jī)酸和氨基酸，其細(xì)菌類(lèi)群主要以乳酸菌為主，優(yōu)勢(shì)菌群與滋味指標(biāo)間存在一定的關(guān)聯(lián)性。