曾 波，鄒永芳，饒家權(quán)，王曉平，文 靜，黃治國(guó),3,*

（1.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000；2.舍得酒業(yè)股份有限公司，四川 射洪 629000；3.中國(guó)輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644000）

土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中不可或缺，并且通過(guò)參與固氮、氨化、硝化和反硝化等重要生態(tài)過(guò)程，調(diào)控土壤的結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)[1-2]。黑土帶因其土壤有機(jī)質(zhì)含量高和耕地肥沃被稱為我國(guó)糧食生產(chǎn)的“壓艙石”和“穩(wěn)壓器”[3]。窖泥作為微生物的載體，為釀酒微生物發(fā)酵過(guò)程中提供適宜的生存環(huán)境，而微生物種群在窖池內(nèi)的復(fù)雜物質(zhì)能量代謝，為白酒生產(chǎn)提供源源不斷的動(dòng)力，因此窖泥被稱為釀酒“微生物黃金”[4]。四川具有“川酒甲天下”的美譽(yù)，以其獨(dú)特的濃香型白酒聞名世界，長(zhǎng)期以來(lái)，泥窖被用作為發(fā)酵濃香型白酒的反應(yīng)器，窖泥在長(zhǎng)期發(fā)酵過(guò)程中形成了復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，構(gòu)建了特殊的微生態(tài)結(jié)構(gòu)[5]。關(guān)于微生物空間分布的研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)為環(huán)境因子和歷史進(jìn)化因素驅(qū)動(dòng)土壤微生物空間分布的機(jī)制上。近年，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和微生物組學(xué)的應(yīng)用，對(duì)窖泥中的微生物群落結(jié)構(gòu)有更系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。已有研究表明，窖泥微生物是白酒風(fēng)味物質(zhì)形成的主要功能微生物來(lái)源之一，優(yōu)質(zhì)窖泥發(fā)酵生產(chǎn)的白酒更好[6]。Chai Lijuan等[7]針對(duì)不同窖齡窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物物的變化規(guī)律，提出了窖泥微生物群落的定向進(jìn)化模式，并提供了一種加速窖泥微生物富集的替代方法。吳浪濤等[8]研究不同發(fā)酵時(shí)期的窖泥，證明了窖泥理化指標(biāo)、關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)和窖泥功能微生物有直接或間接的關(guān)系。Zheng Yan等[9]研究窖泥原核生物群落的變化以及相互作用，發(fā)現(xiàn)微生物之間的協(xié)同作用有助于提高窖泥的質(zhì)量。目前，關(guān)于窖泥研究多基于微生物群落結(jié)構(gòu)解析，而關(guān)于導(dǎo)致窖泥細(xì)菌群落差異的環(huán)境因子及與其相關(guān)的功能菌相對(duì)較少。

本研究以四川濃香型酒廠正常窖池（窖齡30 a以上）的窖底和窖壁泥作為樣品，測(cè)定了窖泥樣品6 個(gè)理化指標(biāo)，并借助高通量測(cè)序技術(shù)分析窖泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，比較窖底、窖壁泥理化指標(biāo)與細(xì)菌群落的差異性，解析理化指標(biāo)與關(guān)鍵菌屬的相關(guān)性以及參與酸代謝的酶類差異。旨在為進(jìn)一步探究窖泥中細(xì)菌群落在環(huán)境壓力下參與調(diào)節(jié)的機(jī)制、窖泥功能菌篩選和窖泥護(hù)養(yǎng)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自四川某濃香型白酒廠窖池的窖底泥和窖壁泥。采用五點(diǎn)取樣法，以窖底和窖壁為平面，在窖底確定對(duì)角線的中點(diǎn)作為中心抽樣點(diǎn)，再在對(duì)角線上選擇4 個(gè)與中心樣點(diǎn)距離相等的點(diǎn)作為樣點(diǎn)，如圖1所示，每個(gè)樣點(diǎn)取樣100 g，將其混合作為窖底泥樣（500 g），窖底泥樣品用D表示，取五口不同的窖池，標(biāo)號(hào)為D1、D2、D3、D4、D5；窖壁也按此方法取樣，窖壁泥樣品用B表示，取五口不同的窖池，標(biāo)號(hào)為B1、B2、B3、B4、B5。將窖泥樣品取出混勻后分成2 份裝入無(wú)菌袋并冷藏，快速送回實(shí)驗(yàn)室，貯存在4 ℃冰箱和-80 ℃冰箱，分別用于檢測(cè)理化指標(biāo)和窖泥DNA的提取。

圖1 窖泥取樣位置Fig.1 Sampling locations of pit mud

E.Z.N.A.?soil試劑盒 上海晶諾生物科技有限公司；氯化鈉、碘化汞、碘化鉀、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、氯化銨、硫酸亞鐵銨、濃硫酸、重鉻酸鉀、鄰菲啰啉、氟化銨、鹽酸、鉬酸銨、磷酸二氫鉀、氯化亞錫（均為分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2400紫外分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)H e t t i c h 公司；油浴鍋 奧斯豪儀器有限公司；NanoDrop2000微量分光光度計(jì) 美國(guó)Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥理化指標(biāo)檢測(cè)

pH值、過(guò)氧化氫酶活性用新鮮的窖泥測(cè)定，銨態(tài)氮在風(fēng)干過(guò)程中易變化，也需用新鮮的泥樣測(cè)定；將窖泥攤平在鐵盤(pán)中自然風(fēng)干，風(fēng)干后研磨成粉末，保存在干燥器中，用于測(cè)定有效磷、腐殖質(zhì)。

pH值：參照《釀酒分析與檢測(cè)》[10]，將樣品用飽和氯化鈉提取后，pH計(jì)測(cè)定；銨態(tài)氮含量：納氏試劑比色法測(cè)定[11]；有效磷含量：氟化銨-鹽酸比色法測(cè)定[12]；腐殖質(zhì)含量：油浴法測(cè)定[13]；過(guò)氧化氫酶含量：容量法測(cè)定[14]。

1.3.2 窖泥總DNA的提取

根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA提取，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對(duì)V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL：4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL引物（5 μmol/L）、0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。全部樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物送到上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用于后續(xù)分析。

1.3.4 real-time PCR法檢測(cè)樣本中16S基因的絕對(duì)含量

使用16S rDNA通用引物341F（5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和518R（5’-TTA CCG CGG CTG CTG GC-3’）擴(kuò)增窖泥宏基因組DNA，得到16S rDNA混合擴(kuò)增產(chǎn)物。具體步驟參照張會(huì)敏等[15]方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE軟件根據(jù)97%相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，并在聚類的過(guò)程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123）。利用R語(yǔ)言和Origin 2018軟件作圖。理化數(shù)據(jù)采用±s表示，窖泥理化的差異顯著性分析通過(guò)軟件SPSS實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥樣品理化指標(biāo)

由圖2可知，窖壁泥銨態(tài)氮含量顯著高于窖底泥（P＜0.05）；窖底泥的pH值、過(guò)氧化氫酶活性顯著高于窖壁泥（P＜0.05），銨態(tài)氮可以作為氮源促進(jìn)窖泥細(xì)菌的代謝；窖底泥和窖壁泥的有效磷含量、腐殖質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 窖底泥和窖壁泥的理化指標(biāo)Fig.2 Physicochemical indicators in bottom and wall pit mud

2.2 窖泥細(xì)菌群落的α多樣性分析

如表1所示，所有樣品序列數(shù)超過(guò)40 000 條，窖底和窖壁泥的序列數(shù)無(wú)顯著差異，從窖泥樣品物種豐富度（Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)）可以看出，窖壁泥中的微生物群落更豐富，多樣性更高；由圖3可知，窖壁泥的OTU種類高于窖底泥，更加證明了窖壁泥的微生物多樣性更高，窖底、窖壁泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到不同理化指標(biāo)的影響，而這些理化指標(biāo)是哪些，還需要進(jìn)一步分析研究。圖4為通過(guò)絕對(duì)定量檢測(cè)出的窖泥樣本中16S rDNA豐度，窖底泥16S rDNA拷貝數(shù)略高于窖壁泥，但都在相同數(shù)量級(jí)上，本研究老窖泥中16S rDNA拷貝數(shù)與已有研究規(guī)律一致[16]。

表1 窖底、窖壁泥細(xì)菌群落α多樣性指數(shù)Table 1 α-Diversity index of bacterial communities in bottom and wall pit mud

圖3 窖底泥和窖壁泥OTU水平Venn圖Fig.3 Venn diagram showing the number of shared and unique OTUs between bottom and wall pit mud

圖4 兩組窖泥樣本中16S rDNA拷貝數(shù)Fig.4 Number of 16S rDNA copies in two pit mud samples

2.3 窖泥細(xì)菌群落的β多樣性分析

將細(xì)菌群落與窖底窖壁泥樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），見(jiàn)圖5，提取到的PC1和PC2特征值分別是1.448和0.211，且累計(jì)方差占83.29%，說(shuō)明成分劃分合理。按照PC1和PC2的劃分，窖底泥D1、D2、D3、D4、D5在同一區(qū)域，且較集中。窖壁泥B1、B2、B3、B4、B5分布離散，窖底和窖壁泥的在PCoA圖中分布與微生物門(mén)和屬水平相對(duì)豐度圖的分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)，結(jié)果表明窖底泥相比窖壁泥，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成相似度更高。按照PC1和PC2劃分出的窖泥樣品具有一定的科學(xué)性。

圖5 細(xì)菌群落多樣性PCoA圖Fig.5 PCoA plot of bacterial community diversity

將窖泥序列進(jìn)行OTU物種注釋，得到排名前7的門(mén)以及排名前20的屬，others表示排名靠后的門(mén)和屬。由圖6a可知，窖底和窖壁泥的細(xì)菌群落中，占主導(dǎo)地位的都是厚壁菌門(mén)（Firmicutes），其中窖底泥樣品Firmicutes占79.52%～88.87%，窖壁泥樣品Firmicutes占66.65%～90.69%，細(xì)胞壁由一層較厚的含胞壁酸的肽聚糖構(gòu)成，很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽孢，它可以抵抗脫水和極端環(huán)境。擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）在窖底泥中占6.15%～12.14%，在窖壁泥中占0.35%～18.56%；互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）在窖底泥中占1.25%～7.03%，在窖壁泥中占1.77%～31.63%；變形菌門(mén)（Proteobacteria）在窖底泥中占0.2 8%～1.8 8%，在窖壁泥中占0.06%～0.43%，Proteobacteria包括很多可以進(jìn)行固氮的細(xì)菌，大多數(shù)營(yíng)兼性或者專性厭氧及異養(yǎng)生活；放線菌門(mén)（Actinobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chlorflexi）、窖底窖壁泥中的占比較少，基本一致。由圖6b所示，窖底泥和窖壁泥在屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌屬存在差異，窖底泥的優(yōu)勢(shì)菌屬為氫孢菌屬（Hydrogenispora）、產(chǎn)己酸菌屬（C a p ro i c i p ro d u c e n s）、胺桿菌屬（Aminobacter ium）、Proteiniphilum等，窖壁泥的優(yōu)勢(shì)菌屬為C a p ro i c i p ro d u c e n s、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乙酸互營(yíng)菌屬（Syntrophaceticus）、Aminobacterium、Proteiniphilum、Petrimonas、沉積菌屬（Sedimentibacter）等。

圖6 細(xì)菌群落在門(mén)水平（a）和屬水平（b）的相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of bacterial community at the phylum (a) and genus (b) levels

2.4 窖底窖壁泥的細(xì)菌群落物種差異

利用組間差異檢驗(yàn)方法，根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，運(yùn)用嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)兩組窖泥細(xì)菌群落進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)，評(píng)估物種豐度差異的顯著性水平，獲得具有顯著差異的物種信息。通過(guò)物種差異分析揭示窖底和窖壁泥在屬水平上具有顯著差異的細(xì)菌類群，圖7結(jié)果表明窖底泥中Hydrogenispora相對(duì)豐度顯著高于窖壁泥（P＜0.001），Caproiciproducens（P＜0.01）、Lactobacillus（P＜0.01）、Syntrophaceticus（P＜0.05）相對(duì)豐度顯著低于窖壁泥。理化指標(biāo)對(duì)窖底和窖壁泥中具有顯著差異的細(xì)菌群有重要影響，對(duì)白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生具有可能具有促進(jìn)作用。

圖7 物種差異兩組比較圖Fig.7 Comparison of bacterial species differences between bottom and wall pit mud

2.5 理化指標(biāo)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性

如圖8所示，對(duì)于窖底泥（D1、D2、D3、D4、D5）的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，pH值對(duì)其有較強(qiáng)的影響力，其次是有效磷含量；對(duì)于窖壁泥B4、B5的微生物群落結(jié)構(gòu)，腐殖質(zhì)對(duì)其有較強(qiáng)的影響力，且腐殖質(zhì)與過(guò)氧化氫酶對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較為相似，其次是銨態(tài)氮、有效磷、過(guò)氧化氫酶；對(duì)于窖壁泥B1、B2的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，銨態(tài)氮對(duì)其有較強(qiáng)的影響力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hydrogenispora與pH值有很強(qiáng)的正相關(guān)，一些產(chǎn)酸細(xì)菌與pH值有很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)；Lactobacillus與過(guò)氧化氫酶含量有較強(qiáng)的正相關(guān)，Petrimonas、Proteiniphilum與有效磷、腐殖質(zhì)、過(guò)氧化氫酶呈正相關(guān)；Aminobacterium與銨態(tài)氮呈正相關(guān)。冗余分析（redundancy analysis，RDA）結(jié)果證實(shí)了pH值與窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較強(qiáng)的相關(guān)性，銨態(tài)氮含量、腐殖質(zhì)含量、過(guò)氧化氫酶活性對(duì)窖壁泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有一定的相關(guān)性。

圖8 理化指標(biāo)與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性RDA圖（屬水平）Fig.8 RDA plot of correlation between physicochemical indicators and bacterial community at the genus level

由圖9可知，pH值與Ruminofilibacter、Haloplasma等9 個(gè)菌屬呈顯著正相關(guān)，與L a c t o b a c i l l u s、Caloribacterium、Atopobium等8 個(gè)菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)；腐殖質(zhì)含量與Lactobacillus、Syntrophomonas、Tissierella3 個(gè)菌屬呈顯著正相關(guān)。銨態(tài)氮含量、有效磷含量、過(guò)氧化氫酶含量其他指標(biāo)不同，與豐度前30的菌屬?zèng)]有顯著的相關(guān)性。從圖9可以直觀看出pH值與屬水平總豐度前30物種當(dāng)中的17 個(gè)菌屬具有顯著相關(guān)性，因此該環(huán)境因子對(duì)細(xì)菌群落的影響最大，與RDA中pH值對(duì)窖底泥的影響程度最大結(jié)果一致。

圖9 理化指標(biāo)與菌群相關(guān)性熱圖Fig.9 Heatmap of correlation between physicochemical indicators and bacterial flora

2.6 參與酸代謝的功能酶分析

通過(guò)PICRUSt2標(biāo)記基因序列預(yù)測(cè)窖壁和窖底泥相關(guān)酶功能和豐度信息，結(jié)合參與酸代謝的相關(guān)酶，利用氣泡圖表示窖壁泥和窖底泥酶相關(guān)豐度的差異，如圖10所示，窖壁泥中參與酸代謝的酶類相對(duì)豐度顯著高于窖底泥，在厭氧環(huán)境下，丙酮酸被L-乳酸脫氫酶（EC 1.1.1.27）氧化為乳酸；在丙酮酸激酶（EC 2.7.1.40）的作用下轉(zhuǎn)化為乙醇。窖壁泥中多種酶還參與乙酰輔酶A合成，這是酸代謝途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，有助于濃香型白酒香味物質(zhì)的生成。結(jié)果表明，窖壁泥的細(xì)菌群落具有產(chǎn)香的巨大潛力。

圖10 酸代謝途徑（a）和酶相對(duì)豐度氣泡圖（b）Fig.10 Acid metabolism pathway (a) and bubble chart of relative abundance of enzymes (b)

3 討 論

本研究比較了窖泥的5 項(xiàng)理化指標(biāo)和窖底、窖壁泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了窖底泥和窖壁泥的理化指標(biāo)差異和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布特點(diǎn)。窖泥中占主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是Firmicutes，平均含量達(dá)到78%，其他2 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為Bacteroidetes、Synergistetes，窖泥的優(yōu)勢(shì)菌屬為Caproiciproducens、Lactobacillus、Syntrophaceticus和Hydrogenispora等20 個(gè)菌屬，張明珠等[17]研究老窖泥中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，綜合理化指標(biāo)分析，這也說(shuō)明本研究樣品符合老窖泥的特征。窖壁泥和窖底泥的細(xì)菌群落在屬水平上具有顯著差異，窖底泥的優(yōu)勢(shì)菌屬Hydrogenispora，其相對(duì)豐度顯著高于窖壁泥，窖壁泥的優(yōu)勢(shì)菌屬Caproiciproducens、Lactobacillus、Syntrophaceticus，其相對(duì)豐度顯著高于窖底泥。Lactobacillus含量與窖泥質(zhì)量呈一定的負(fù)相關(guān)[18]，窖底泥中該菌的含量較低，可能是窖泥老熟過(guò)程中，窖底泥的菌群已經(jīng)成熟，代謝功能比較完善，而Lactobacillus能夠產(chǎn)乳酸，窖泥中乳酸是含量最大的有機(jī)酸，窖泥pH值的升高與其中乳酸降解有關(guān)[19]，而pH值與窖泥質(zhì)量直接相關(guān)[20]，進(jìn)一步了解Lactobacillus在窖泥中分布差異的原因，有益于提升窖泥的品質(zhì)。平行樣品之間窖底泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更具均一性，窖壁泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有一定差異性，這也是進(jìn)行窖泥樣品細(xì)菌群落的PCoA時(shí)窖壁泥樣品點(diǎn)分布離散和窖底泥樣品點(diǎn)分布集中的原因。自然環(huán)境的復(fù)雜性和大多數(shù)生境中存在的大量生態(tài)位常被用來(lái)解釋在存在競(jìng)爭(zhēng)排斥情況下微生物多樣性的維持，長(zhǎng)久的環(huán)境壓力將為頂級(jí)群落演化提供動(dòng)力[21]。窖池底部窖泥長(zhǎng)期處于厭氧和高酸環(huán)境，所以演化結(jié)果讓細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成相似度更高，窖底窖泥微生物的代謝功能更加完善。

窖壁泥中參與酸代謝的酶類相對(duì)豐度顯著高于窖底泥，并且具有相對(duì)豐度顯著高于窖底泥的產(chǎn)酸細(xì)菌，比如Caproiciproducens、Lactobacillus、Syntrophaceticus等，推測(cè)窖壁泥富集的多種細(xì)菌群落，具有產(chǎn)生參與酸代謝酶類的特性[22]，這些產(chǎn)酸細(xì)菌具有以乙醇或乳酸為底物合成丁酸己酸的潛力[23]，能為白酒釀造代謝豐富的風(fēng)味物質(zhì)，例如乙酸、丁酸、己酸等[22]。Lactobacillus在發(fā)酵過(guò)程中將糖類分解成乳酸，具有較強(qiáng)的代謝碳水化合物的產(chǎn)酸能力，乳酸可作為合成其他脂肪酸的底物，同時(shí)可以與乙醇通過(guò)酯化反應(yīng)生成濃香型白酒獨(dú)特風(fēng)味的乳酸乙酯；Caproiciproducens是窖壁泥中的優(yōu)勢(shì)菌屬，該類菌具有利用果糖、乳酸、半乳糖和木糖等為底物代謝乙酸、丁酸和己酸等短鏈脂肪酸的功能，主要是通過(guò)短鏈脂肪酸逆β-氧化代謝途徑[24-25]；窖壁泥中的Aminobacterium與銨態(tài)氮呈極強(qiáng)正相關(guān)，Aminobacterium不僅可以降解氨基酸生成乙酸和丁酸等，也可以降解氨基酸增加銨態(tài)氮的含量[26]，這可能是窖壁泥銨態(tài)氮的含量高于窖底的原因。

窖底泥和窖壁泥的理化指標(biāo)存在差異，窖底泥的pH值和過(guò)氧化氫酶活性顯著高于窖壁泥；pH值越接近中性，窖泥的窖齡越老，優(yōu)質(zhì)窖泥的pH值接近中性，新窖泥和退化窖泥的pH值偏酸性[27]。pH值與Hydrogenispora呈較強(qiáng)的正相關(guān)，Hydrogenispora可產(chǎn)生醋酸鹽、乙醇和氫氣[28]，不僅可以降低窖泥總氫相對(duì)含量，升高窖泥pH值，優(yōu)化窖泥的厭氧環(huán)境，還有利于乳酸降解菌的生長(zhǎng)代謝。Hydrogenispora在老窖泥中相對(duì)含量較高，是優(yōu)勢(shì)梭菌之一[29]。其能夠在長(zhǎng)期被黃水浸泡的窖底泥中大量繁殖，說(shuō)明該菌的耐酸性較強(qiáng)，這也可能是窖底泥微生物應(yīng)對(duì)高酸厭氧環(huán)境代謝自我調(diào)節(jié)的機(jī)制。Hydrogenispora如何調(diào)節(jié)窖泥的pH值鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，后續(xù)研究該菌對(duì)pH值調(diào)節(jié)的機(jī)理可能對(duì)濃香型白酒發(fā)酵產(chǎn)酸調(diào)控提供新的思路。RDA發(fā)現(xiàn)影響窖底和窖壁泥的理化指標(biāo)對(duì)細(xì)菌群落影響存在差異，pH值是影響窖底泥細(xì)菌群落的主要因素，特別是影響窖泥中的產(chǎn)酸細(xì)菌。發(fā)酵過(guò)程中，己酸菌會(huì)產(chǎn)生具有獨(dú)特風(fēng)味的己酸，當(dāng)pH＜4.5時(shí)，己酸菌的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制[30]。劉梅等[31]也發(fā)現(xiàn)pH值和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在較大相關(guān)性，pH值反映了窖底、窖壁泥中細(xì)菌微生物群落的差異性。張會(huì)敏等[20]證實(shí)了窖泥中乳酸與pH值的相關(guān)性很強(qiáng)，降解乳酸將是提高窖泥質(zhì)量的重要途徑。同時(shí)理化指標(biāo)在窖泥老熟時(shí)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，若能在發(fā)酵過(guò)程中及時(shí)調(diào)控會(huì)有利于白酒風(fēng)味的提升。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了濃香型白酒窖底泥和窖壁泥5 項(xiàng)理化指標(biāo)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，pH值、腐殖質(zhì)、過(guò)氧化氫酶在窖底和窖壁泥中差異顯著，pH值是對(duì)窖底泥影響力度最大的理化指標(biāo)；Firmicutes是窖泥共同的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，但在屬水平上多個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬存在顯著差異，Hydrogenispora是窖底泥的標(biāo)志性菌屬。上述研究結(jié)果表明pH值是窖壁窖底泥細(xì)菌群落差異的主要環(huán)境因素，并且與Hydrogenispora呈極強(qiáng)的顯著關(guān)系，窖壁泥和窖底泥細(xì)菌屬相對(duì)豐度的差異導(dǎo)致參與到酸代謝中酶類相對(duì)豐度的差異，后續(xù)應(yīng)深入研究細(xì)菌與理化因子之間的調(diào)節(jié)機(jī)制，為窖泥功能菌的篩選和窖池的護(hù)理提供理論參考。