李博然，成璐瑤，曹智鴻，程 楠,2,*，羅云波,2,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

過氧化氫是一種重要的無機化工材料[1-2]。隨著我國食品級過氧化氫生產(chǎn)技術(shù)的提升，過氧化氫愈加廣泛的應用在食品加工生產(chǎn)設(shè)備和包裝的消毒以及水發(fā)牛百葉、泡椒鳳爪等食品的漂白中[3-4]。自20世紀80年代起，國內(nèi)外就有諸多研究表明過氧化氫進入到人體中會發(fā)生氧化應激反應產(chǎn)生大量自由基，導致細胞凋亡和病變、加速人體的衰老，引發(fā)阿爾茲海默癥、癌癥等[5-8]，在國內(nèi)也有多起由食品中過氧化氫殘留引發(fā)中毒的報道[9-10]。在GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中規(guī)定過氧化氫作為食品加工助劑，應在食品中盡量除去，在GB 5009.226—2016《食品中過氧化氫殘留量的測定》中，H2O2在食品中的含量被嚴格限制在3 mg/kg以下[11-13]。以化學分析法和儀器檢測法為代表的傳統(tǒng)過氧化氫檢測方法存在儀器體積大、耗時長、需要專業(yè)人員操作等弊端，難以對食品樣品的現(xiàn)場即時檢測。試紙法因具有檢測快速靈敏、操作簡便、便于攜帶、價格低廉等優(yōu)點，在現(xiàn)場即時食品安全檢測領(lǐng)域展示出了較好的應用前景[14-16]。

目前，已廣泛報道的過氧化氫殘留快速檢測試紙均采用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）作為生物活性物質(zhì)進行檢測，但是其作為一種蛋白質(zhì)存在穩(wěn)定性較差的缺點，易受溫度、pH值、無機離子等外界因素的影響變性失活，導致相應過氧化氫殘留快速檢測試紙穩(wěn)定性差、貨架期短。近年來，納米材料模擬酶催化活性的研究發(fā)展迅速，引起了生物學、醫(yī)學等學科的廣泛研究興趣。與天然酶不同的是納米酶能夠避免生物酶易失活的弱點，已被廣泛證明能夠在水或緩沖溶液中表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和良好的催化性能，使其在食品安全快速檢測領(lǐng)域具有廣泛的應用前景[17-18]。本研究分析幾種納米材料的類過氧化物酶活性，系統(tǒng)性優(yōu)化顯色劑成分與制備工藝，制備過氧化氫快速檢測試紙并驗證其分析檢測性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡椒系列產(chǎn)品均購自北京五道口佳美樂購物超市。

四氯鉑（I I）酸鉀（K2P t C l4）、四氯金酸（H A u C l4）、抗壞血酸、聚乳酸納米粒子（PluronicF127）與葡萄糖 美國Sigma-Aldrich公司；四氯鈀酸鈉（Na2PdCl4）、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB） 上海麥克林生化科技有限公司；二甲基亞砜 上海阿拉丁生化科技有限公司；鹽酸、檸檬酸 北京化工廠；所用試劑均為分析純。

過氧化氫快速檢測試紙條 德國默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YM-0405超聲波清洗機 深圳方奧微電子有限公司；Varioskan Flash酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；D3024離心機、MX-S混勻儀、HB120-S金屬浴 美國塞洛捷克公司；101-3BS電熱鼓風干燥箱 天津市宏諾儀器有限公司；InPro3100 pH計 美國梅特勒-托利多公司；Tecnai G2 F30透射電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 納米酶顆粒的制備

1.3.1.1 鈀@鉑納米酶

取20 mg Pluronic F127超聲溶解于含有1.8 mL 20 mmol/L的K2PtCl4、0.2 mL 20 mmol/L的Na2PdCl4以及44 μL 6 mol/L的HCl的水溶液中。隨后加入2 mL 100 mmol/L的抗壞血酸超聲處理4 h至溶液均勻分散[19]。

1.3.1.2 金@鉑納米酶

取20 mg Pluronic F127超聲溶解于含有1.8 mL 20 mmol/L的K2PtCl4、0.2 mL 20 mmol/L的HAuCl4以及44 μL 6 mol/L的HCl水溶液中。隨后加入2 mL 100 mmol/L的抗壞血酸超聲處理4 h至溶液均勻分散。

1.3.1.3 金-鈀-鉑納米酶

取20 mg Pluronic F127超聲溶解于含有0.2 mL 20 mmol/L的HAuCl4、0.2 mL 20 mmol/L的Na2PdCl4、1.8 mL 20 mmol/L的 K2PtCl4以及44 μL 6 mol/L的HCl的水溶液中。隨后加入2 mL 100 mmol/L的抗壞血酸超聲處理4 h至溶液均勻分散。

1.3.2 納米酶的類過氧化物酶動力學測試

部分納米材料具有類過氧化物酶活性，可以催化H2O2產(chǎn)生羥自由基將TMB氧化為氧化態(tài)TMB（oxTMB），其在652 nm波長處有最大紫外吸收峰[20-21]。具有類過氧化物酶活性的納米材料的酶活動力學遵循Michaelis-Menten方程：v＝vmax[S]/(Km＋[S])，其中，v表示反應速率，[S]表示底物濃度，vmax表示反應的最大速率；Km表示米氏常數(shù)。采用標準檢測方法測試得到不同時間下反應溶液在652 nm的吸光度，進行非線性方程擬合，計算得到Km，以判斷納米酶與底物親和力的大小。Km值小，表示用很低的底物濃度即可達到最大反應速度的一半，說明酶與底物親和力大。

將1.3.1節(jié)中已制備好的3 種納米酶材料超聲1 h至均勻分散后進行百倍稀釋。取10 μL百倍稀釋的納米酶溶液、32 μL 30%的H2O2和不同體積的20 mmol/L TMB的二甲基亞砜溶液溶于pH 4.6的醋酸緩沖液中，配制成200 μL反應體系，使體系TMB濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mmol/L。檢測加入納米酶后，反應體系在652 nm條件下吸光度在反應前后60 s的變化。應用GraphPad Prism 9.3.0軟件擬合米氏方程得到兩個關(guān)鍵參數(shù)米氏常數(shù)Km與反應的最大速度vmax以分析納米酶的類過氧化物酶活性[22]。

1.3.3 納米酶的類過氧化物酶活性測試

納米酶的類過氧化物酶活性主要通過比色法分析。依據(jù)bnanozyme＝V/（ε×l）×（ΔA/Δt），ananozyme＝bnanozyme/[m]計算納米材料類過氧化物酶活性。一個b單位定義為在37 ℃每分鐘催化生成1 μmol產(chǎn)物的納米酶量；V為反應溶液總體積（μL）；ε為反應產(chǎn)物的摩爾吸收系數(shù)（39 000 L/（mol?cm））；L為光程，本實驗中為0.622 cm；ΔA為吸光度變化值，ΔA/Δt為652 nm處吸光度的初始變化率（min-1），以計算納米酶活性ananozyme，[m]為換算的納米酶質(zhì)量（mg）。通過計算即可得到3 種納米酶活性ananozyme[22]。

將3 種納米酶材料超聲1 h以混勻。分別取3 種納米材料各1.5 mL，于15 000 r/min離心15 min，棄去上清液，干燥至呈干粉狀，稱量，測得3 種納米材料的質(zhì)量。

將32 μL 30%的H2O2、32 μL 20 mmol/L的TMB的二甲基亞砜溶液和不同體積的百倍稀釋納米酶溶液溶于pH 4.6的醋酸緩沖液中，配制成200 μL溶液，使納米材料體積分數(shù)分別為0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%。檢測加入納米酶后反應體系在652 nm波長處吸光度的變化，每10 s測一次，共檢測400 s。

1.3.4 pH值對納米酶催化活性的影響

經(jīng)1.3.2節(jié)及1.3.3節(jié)兩步驟篩選出一種類過氧化物酶活性最佳的納米酶材料用于后續(xù)實驗。將32 μL 30%的H2O2、32 μL 20 mmol/L的TMB的二甲基亞砜溶液，16 μL百倍稀釋的催化效果最佳的納米酶溶液、溶于pH值分別為2.6、3.6、4.6、5.6、6.6、7.6、8.6、9.6的醋酸鹽緩沖液中，配制成200 μL溶液。檢測加入納米酶后反應體系在652 nm的吸光度變化，pH值對催化效果最佳的納米酶材料活性的影響并篩選出最佳反應pH值。

1.3.5 溫度對納米酶催化活性的影響

將32 μL 30%的H2O2、32 μL 20 mmol/L的TMB的二甲基亞砜溶液，16 μL百倍稀釋的催化效果最佳的納米酶溶液、溶于120 μL pH 4.6的醋酸-醋酸鹽緩沖液中，配制成200 μL溶液。檢測加入納米酶后反應體系在4、25、35、45、55、65 ℃，652 nm條件下反應60 s前后的吸光度的變化，溫度對催化效果最佳的納米酶材料活性的影響并篩選出最佳反應溫度。

1.3.6 過氧化氫殘留快速檢測試紙的制備

首先，將納米酶材料、TMB溶液及醋酸-醋酸鹽緩沖溶液混合制成納米酶顯色溶液；其次，將Whatman No.1濾紙裁剪成10 cm×10 cm的小塊浸泡在裝有納米酶顯色液密閉培養(yǎng)皿中10 s后放入已預熱至50 ℃烘箱中恒溫烘干；最后，采用打孔器將烘干后的試紙打孔制成直徑為6 mm的活性試紙片，制成呈現(xiàn)均勻白色的過氧化氫殘留快速檢測試紙。

1.3.7 顯色液中TMB質(zhì)量濃度對顯色結(jié)果的影響

將25 μL催化效果最佳的納米酶材料與不同體積20 mmol/L的TMB的二甲基亞砜溶液溶于pH 4.6的醋酸緩沖液中，制成TMB質(zhì)量濃度分別為0、0.036、0.072、0.108、0.144、0.180、0.216 mg/mL的顯色液。采用

1.3.6節(jié)中方法制備過氧化氫殘留快速檢測試紙。使用不同TMB質(zhì)量濃度梯度的試紙片對10 μL 30%的H2O2標準液進行檢測，以篩選出最佳的顯色液TMB質(zhì)量濃度。用智能手機拍攝得到試紙的顯色情況進行定性分析，使用Image J軟件進行灰度定量分析，通過定性定量分析選出顯色液的最佳TMB質(zhì)量濃度[23-24]。

1.3.8 顯色液中納米酶質(zhì)量濃度對顯色結(jié)果的影響

將不同體積催化效果最佳的納米酶材料溶于60 μL 20 mmol/L的TMB溶液與pH 4.6的醋酸-醋酸鹽緩沖液的混合溶液中，制成催化效果最佳的納米酶質(zhì)量濃度分別為0、0.004 5、0.013 5、0.018 0、0.022 5、0.027 0、0.031 5 mg/mL的顯色液。采用1.3.6節(jié)中方法制備過氧化氫殘留快速檢測試紙。使用不同催化效果最佳的納米酶質(zhì)量濃度梯度的試紙片對10 μL 30%的H2O2標準液進行檢測，以篩選出最佳的顯色液納米材料質(zhì)量濃度。用智能手機拍攝得到試紙的顯色情況進行定性分析，使用Image J軟件進行灰度定量分析，通過定性定量分析選出顯色液的最佳納米酶質(zhì)量濃度。

1.3.9 試紙在顯色液中浸泡時間對顯色結(jié)果的影響

以1.3.7節(jié)和1.3.8節(jié)兩步驟所得最佳條件制備納米酶顯色液，將Whatman No.1濾紙裁剪成10 cm×10 cm小塊紙片浸泡在裝有納米酶顯色液密閉培養(yǎng)皿中，分別浸泡10、20、30、40、50、60 s后放入已預熱至50 ℃烘箱中恒溫烘干；采用打孔器將烘干后的試紙打孔制成直徑為6 mm的活性試紙片，制成呈現(xiàn)均勻白色的過氧化氫殘留快速檢測試紙。使用不同顯色液浸泡時間的試紙片對10 μL 30%的H2O2標準液進行檢測，用智能手機拍攝得到試紙的顯色情況進行定性分析，使用Image J軟件進行灰度定量分析，通過定性定量分析選出顯色液的最佳TMB濃度。

1.3.10 試紙檢測時間對顯色結(jié)果的影響

以1.3.7～1.3.9節(jié)所得最佳條件制備過氧化快速檢測試紙片，使用10 μL 30%的H2O2標準液對其進行檢測，使用智能手機拍攝記錄試紙顯色情況隨檢測時間的變化，每30 s記錄一次，使用Image J軟件進行灰度定量分析，通過定性定量分析選出最佳的試紙檢測時間。

1.3.11 試紙檢測靈敏度的測試

以1.3.7～1.3.9節(jié)所得最佳條件制備過氧化快速檢測試紙片，配制濃度為0.1～10 mmol/L的過氧化氫標準溶液，測試試紙的靈敏度，同時建立一定過氧化氫濃度范圍內(nèi)過氧化氫濃度與試紙顯色后灰度值的定量關(guān)系。

1.3.12 試紙檢測特異性的測試

以1.3.7～1.3.9節(jié)所得最佳條件制備過氧化快速檢測試紙片，選取過氧化氫檢測中常見的幾種干擾物質(zhì)：檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖、山梨酸鉀、Zn2＋、Mn2＋，均配制成1 mol/L溶液進行試紙的特異性測試，以1 mol/L過氧化氫標準溶液作為陽性對照，醋酸鹽緩沖液作為陰性對照觀察試紙的顏色變化，測試所制備試紙的特異性[25-27]。

1.3.13 試紙實際樣品的檢測

選取市面常見可能存在過氧化氫殘留的泡椒類食品：A品牌脆嫩筍尖（泡椒味）、B品牌山椒筍尖、C品牌脆筍（泡椒味）、D品牌脆泡豬皮、E品牌野山椒鳳爪、F品牌泡椒鳳爪、G品牌山椒味鳳爪進行實際樣品檢測。均稱取各樣品可食部位混合物5 g溶于50 mL水中制成實際樣品提取液，在最佳實驗條件下進行檢測。

1.3.14 試紙陰性樣品的加標回收實驗

將過氧化氫標準溶液加到過氧化氫檢測結(jié)果陰性的實際樣品液中，配制成濃度分別等同于0.05、0.1、0.2 mmol/L的加標樣品液。在最佳實驗條件下測試其過氧化氫殘留量。用智能手機拍攝得到試紙的顯色情況進行定性分析，使用Image J軟件進行灰度定量分析，與建立的過氧化氫濃度——試紙顏色（灰度值）定量數(shù)學模型進行比對，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米酶的制備與表征

制備鈀@鉑納米酶、金@鉑納米酶、金-鈀-鉑納米酶3 種納米酶，通過電子顯微鏡觀察其形貌（圖1）。鈀@鉑納米酶平均直徑約為30 nm，金@鉑納米酶平均直徑約為20 nm，金-鈀-鉑納米酶平均直徑約為35 nm。3 種納米酶形態(tài)均具有高度枝狀和介孔性質(zhì)，均勻分布在納米晶表面形成了特殊的分散結(jié)構(gòu)。

圖1 納米酶的電子顯微鏡圖像Fig.1 Transmission electron microscopic images of nanozymes

2.2 納米酶類酶動力學評價

測試鈀@鉑納米酶、金@鉑納米酶、金-鈀-鉑納米酶3 種納米酶的類酶動力學，擬合得到3 種納米酶的米氏常數(shù)曲線，綜合比較3 種納米材料的動力學常數(shù)可以得出，相同測試條件下鈀@鉑納米酶與金@鉑納米酶的Km相近，高于金-鈀-鉑納米酶，且金@鉑納米酶的vmax最大。表明鈀@鉑納米酶與金@鉑納米酶類過氧化物酶活性較優(yōu)（圖2）。

圖2 納米酶米氏方程擬合結(jié)果Fig.2 Michaelis-Menten plots of nanozymes

2.3 納米酶類過氧化物酶活性測試

通過測定3 種納米材料類酶活性可以得出，金@鉑納米酶活性為27.538 U/mg，鈀@鉑納米酶和金-鈀-鉑納米酶活性分別為4.233 U/mg和3.955 U/mg（圖3C），金@鉑納米酶活性最強。綜合米氏方程擬合結(jié)果選擇出活性最優(yōu)的納米酶，即金@鉑納米酶用于后續(xù)過氧化氫快速檢測試紙的制備。

圖3 納米酶類酶活性Fig.3 Catalytic activity of nanozymes

2.4 反應溫度及pH值對納米酶催化活性的影響

如圖4所示，溫度對納米酶的活性影響較小，在所測溫度范圍內(nèi)，納米酶始終保持著較優(yōu)的活性，均在60%～100%相對活性范圍內(nèi)波動，且在30～50 ℃間有最大催化活性，因此得出37 ℃為反應最適溫度（圖4A）。相較于溫度對納米酶催化活性的影響，pH值對納米酶催化活性的影響更加顯著，當pH 4.6時，金@鉑納米酶有最大的催化活性，當pH值高于6.6時，酶幾乎失去催化活性，因此得出pH 4.6為反應最適pH值（圖4B）。

圖4 環(huán)境因素對納米酶催化活性的影響Fig.4 Effects of environmental factors on catalytic activity of nanozymes

2.5 顯色液成分優(yōu)化

隨著TMB添加量的加大，顯色效果更加明顯，利于肉眼觀察，但是高質(zhì)量濃度TMB的試紙很容易被空氣氧化變色而使試紙失去其使用效果（圖5A）。綜合考慮，TMB在顯色液中的最佳質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL。此質(zhì)量濃度制成的試紙為均勻的白色，且響應迅速，梯度明顯。

圖5 顯色液組分對試紙顯色結(jié)果的影響Fig.5 Effect of TMB and nanozyme concentrations on results of color development

隨著金@鉑納米酶添加量的加大，在較低濃度條件下，試紙的顯色程度會更加明顯，但是當金@鉑納米酶大于0.018 mg/mL后，增加金@鉑納米酶濃度對試紙的顯色程度幾乎無影響，金@鉑納米酶此時濃度已經(jīng)達到飽和（圖5B）。綜合考慮，金@鉑納米酶在顯色液中的最佳質(zhì)量濃度為0.018 mg/mL。

2.6 試紙工藝優(yōu)化

試紙在顯色液中浸泡時間超過10 s后，隨著浸泡時間的延長，試紙顯色程度無明顯變化，無需再延長浸泡時間；當浸泡時間小于10 s時，肉眼觀察到試紙未浸透（圖6A）。因此，選擇10 s為試紙在顯色液中的最佳浸泡時間。

圖6 試紙工藝優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Results of optimization of soaking and reaction time of test strip

隨著過氧化氫與試紙反應時間的延長，在3 min內(nèi)，試紙顯色效果逐漸明顯。當反應時間超過3 min后，顯色深淺程度在一段時間內(nèi)幾乎不變，當反應時間超過8 min后顯色效果隨反應時間延長逐漸下降，確定3 min為試紙與過氧化氫反應的最快穩(wěn)定時間（圖6B）。后續(xù)檢測中選擇3 min為試紙與過氧化氫的反應時間。

2.7 試紙性能測試

2.7.1 靈敏度測試

當過氧化氫標準液濃度大于或等于0.01 mmol/L，即0.34 mg/kg時，肉眼可以很容易辨別試紙呈現(xiàn)的藍色。因此，最終確定試紙的靈敏度為0.01 mmol/L（圖7）。當過氧化氫標準液濃度為0.05～0.5 mmol/L時，試紙顯色灰度值與過氧化氫濃度有較好的線性關(guān)系（R2＝0.993 1），擬合得到過氧化氫濃度——試紙顏色（灰度值）定量數(shù)學模型：y＝17 735x＋3 028.4，可用來進行過氧化氫的定量檢測，過氧化氫快速檢測試紙的比色卡見圖8。

圖7 試紙靈敏度測試Fig.7 Sensitivity of test strip

2.7.2 特異性測試結(jié)果

檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖、山梨酸鉀、Zn2＋對試紙均無陽性響應，而Mn2＋則會使試紙呈現(xiàn)灰色（表1）。

表1 試紙?zhí)禺愋詼y試結(jié)果Table 1 Specificity of test strip

2.8 試紙性能測試結(jié)果

7 種樣品檢驗時與空白對照均無差異（表2），均未檢出過氧化氫，對樣品進行陰性加標實驗，回收率為93.10%～108.63%（表3）。

表2 實際樣品測試結(jié)果Table 2 Results of test strips for actual samples

表3 泡椒鳳爪實際樣品陰性加標回收實驗Table 3 Recoveries of spiked negative chicken feet with pickled pepper

3 討 論

目前對于過氧化氫的檢測方法主要包括滴定分析法、比色分析法、化學發(fā)光法和電化學分析法等[28-31]。常見的滴定分析法包括碘量法和高錳酸鉀滴定法，其作為一種廣泛應用的經(jīng)典方法具有較為精確快捷等優(yōu)點，碘量法是現(xiàn)行的國家標準中規(guī)定的食品中過氧化氫殘留量的測定方法，但滴定分析法受操作人員及環(huán)境影響較大且操作繁瑣[28-29]。傳統(tǒng)的比色法如鈦鹽比色法同樣是國標中規(guī)定的食品中過氧化氫殘留量的測定方法，其檢測精確，不易受鈣鐵離子及其他過氧化物的影響，但需要濃硫酸以提供強酸性環(huán)境、耗費時間較長、濃硫酸的使用會干擾某些體系的檢測以及需要依靠分光光度計檢測等弊端[28-29]。化學發(fā)光法本身的分析選擇性較差，不適用于分析復雜樣品和同時檢測多種待測物，從而局限了其應用范圍，常與毛細管電泳、高效液相色譜等聯(lián)用以滿足實際檢測需要，儀器昂貴且操作也較為復雜[30-31]。相較于以上方法，試紙法具有靈敏、快速、便攜、樣品用量小且能夠短時間批量檢測等優(yōu)點，本研究中的金@鉑納米酶過氧化氫殘留快速檢測試紙?zhí)娲藗鹘y(tǒng)HRP作為生物活性物質(zhì)進行檢測，對溫度、pH值等外界因素影響的抗性提高，是一種穩(wěn)定性更好的新型檢測技術(shù)，適用于實驗室的初篩及現(xiàn)場大樣本測定監(jiān)督，但多用于半定量和定性檢測，檢測精確度仍待提高。

4 結(jié) 論

本研究制備的試紙在具有類過氧化物酶活性的金@鉑納米材料作用下，檢測過氧化氫時能夠?qū)o色物質(zhì)TMB氧化成為藍色物質(zhì)oxTMB，從而實現(xiàn)過氧化氫的比色法檢測。基于上述原理，本研究建立了一種以金@鉑納米材料類過氧化物酶活性為基礎(chǔ)的可視化半定量過氧化氫快速檢測試紙，該試紙可以在3 min內(nèi)對樣品中過氧化氫殘留量進行快速檢測，檢出限為0.34 mg/kg。通過在泡椒雞爪中加入不同濃度的過氧化氫測定其回收率，結(jié)果表明該試紙準確性高、檢測速度快、無需復雜的樣品處理，具有應用于食品殘留過氧化氫快速現(xiàn)場檢測中的潛力。