陸 靜，焦艷娜，成 婧，申甜甜，朱紹華，付善良*

（長沙海關(guān)技術(shù)中心，食品安全科學技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004）

二噁英屬于多氯取代的芳香烴族化合物，是多氯代二苯并-對-二噁英（polychlorinateddibenzop-d i o x i n s，P C D D s）、多氯代二苯并呋喃（polychlomateddibenzofurans，PCDFs）和共平面多氯聯(lián)苯的統(tǒng)稱[1-3]。其中，2,3,7,8-四氯代苯并二噁英（2,3,7,8-tetrachlorinated dibenzo-p-dioxin，TCDD）是迄今為止發(fā)現(xiàn)毒性最強的化合物，比氰化鉀要毒100 倍以上；TCDD已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織判定為一級致癌物，具有生殖毒性、神經(jīng)毒性、內(nèi)分泌毒性和免疫毒性效應(yīng)等[2,4]。二噁英類物質(zhì)毒性的另一個特點是，二噁英為脂溶性化合物，易積累在生物體的脂肪組織中，不易被降解和排出，可以在人和動物體內(nèi)不斷蓄積達到較高濃度，在生物體表現(xiàn)出明顯的癥狀之前有一個漫長的潛伏過程[5-7]。

近年來，我國肉類產(chǎn)品進口和消費快速增長，肉類進口來源也呈現(xiàn)多元化。湖南作為肉類產(chǎn)品消費大省，每年肉類消費都在80萬 t以上，對進口的肉類需求也在逐年增加，每年需求量達到40萬 t以上[8]。李云秀等[9]對我國部分地區(qū)的豬肉和豬肝中的二噁英污染狀況進行調(diào)研和風險評估，肉類中二噁英的污染受到了不少專家學者的關(guān)注。目前，國內(nèi)還沒有二噁英類物質(zhì)的限量標準，根據(jù)（EU）2022/2002歐盟食品污染物限量標準[10]，豬肉中二噁英總和的最高限量值為1.0 pg/g（以脂肪計）。

二噁英分析屬于超痕量、多組分分析，其分析測定必須具備有效的提取和凈化技術(shù)、異構(gòu)體的高效分離定性定量、良好的質(zhì)量管理等技術(shù)條件[11-12]。且同位素稀釋內(nèi)標法是國際上通用的測定食品、飼料及環(huán)境樣品中二噁英質(zhì)量濃度的方法。自2014年6月起，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）成為歐盟委員會（EU）規(guī)程2017/644中的一項確證方法[13]。目前，GC-MS/MS法已廣泛用于食品、飼料及環(huán)境樣品中二噁英（dioxins，PCDD/Fs）及二噁英類多氯聯(lián)苯（dioxin like polychlorinated biphenyls，DL-PCBs）的檢測[14-17]。同時，不少學者和專家對比研究了該2 種儀器在檢測PCDD/Fs的區(qū)別。Sun Huizhong等[18]對魚、牛肉以及玉米飼料3 種基質(zhì)中的PCDD/Fs濃度進行GC-MS/MS和高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜（high resolution gas chromatography-high resolution mass spectrometry，HRGC-HRMS）儀器比對檢測，檢出含量為0.9～9.0 pg/g，2 種儀器的測定偏差為0.7%～14%。豬肉中的脂肪含量較高，而二噁英檢測的一大難點是對脂肪的提取和去除，以降低背景檢測干擾，提高檢測的準確度[19]。凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）作為除脂的常用方法和手段，在肉類食品檢測中發(fā)揮著重要作用[20-22]，然而作為超痕量的二噁英檢測，GPC的相關(guān)使用報道較少，我國也只是在相關(guān)標準中推薦使用[23-24]。本實驗擬對豬肉基質(zhì)中的二噁英相關(guān)檢測前處理方法進行探討和優(yōu)化，開發(fā)一種適合肉類食品中PCDD/Fs和DL-PCBs檢測的GC-MS/MS方法，對推動和保障動物源性食品的順利出口具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豬肉從當?shù)厥袌鲑徺I。肉樣攪碎后以冷凍干燥機干燥，計算含水量，混勻備用。

二氯甲烷、甲苯、乙酸乙酯、正己烷（均為農(nóng)殘級）iMagiLab公司；硅膠（農(nóng)殘級） 加拿大Silicycle公司；濃硫酸、無水硫酸鈉（均為優(yōu)級純） 國藥集團化學試劑有限公司；多層硅膠柱、堿性氧化鋁柱、活性炭柱 美國FMS公司。

分離度檢查標準溶液、回收率和精密度檢查標準溶液、同位素標記定量內(nèi)標標準溶液、回收率內(nèi)標標準溶液、含有天然和同位素標記的系列校正標準曲線標準溶液（濃度同國家標準中規(guī)定[25]）購于加拿大Wellington Laboratories公司；臨用時取20 μL于進樣小瓶中，備用。硅膠使用前分別用甲醇和二氯甲烷清洗，晾干后在180 ℃烘烤2 h，備用。然后以濃硫酸進行酸化，配制成質(zhì)量分數(shù)為44%的酸化硅膠。

GC-MSTQ8050型氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀日本島津公司；J2 GPC儀、Bio Beads S-X3凈化柱（700 mm×25 mm） 美國Scientific公司；R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琦公司；JF-602全自動樣品凈化系統(tǒng)北京普立泰科公司；DC801冷凍干燥機 日本雅馬拓公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 提取

提取前，在索氏提取器中裝入一支空的玻璃纖維素提取套筒，以正己烷-二氯甲烷（1∶1，V/V）為提取溶劑，預(yù)提取8～12 h，濃縮上機測定，直至儀器未檢測到本底值。

稱取8.0 g冷凍干燥后的樣品，加無水硫酸鈉研磨，制成能自由流動的粉末。將粉末全部轉(zhuǎn)移至處理好的提取套筒內(nèi)，加入13C12-PCDD/Fs和13C12-DL-PCBs標記的定量內(nèi)標溶液（GB 5009.205—2013《食品中二噁英及其類似物毒性當量的測定》附錄B.2和B.8（稀釋10 倍））各20 μL，用玻璃棉蓋住樣品，裝入索氏提取器，以正己烷-二氯甲烷（1∶1，V/V）為提取溶劑提取18～24 h。提取完成后，將提取溶液轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，恒質(zhì)量，計算前后平底燒瓶質(zhì)量差，得到脂肪含量。

1.2.1.2 凈化

將提取液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，加入100 mL正己烷，50 g酸化硅膠，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70 ℃條件下旋轉(zhuǎn)加熱20 min。靜置8～10 min后，將正己烷倒入圓底燒瓶中。再用50 mL正己烷清洗瓶中的酸化硅膠，合并上清液至茄形瓶中，重復(fù)3 次。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2～5 mL。將多層硅膠柱、堿性氧化鋁柱和活性炭柱按順序接在全自動樣品凈化系統(tǒng)上，按照洗脫程序順序洗脫，對樣品進行上樣、凈化、分離，分別收集含PCDD/Fs和DL-PCBs組分的洗脫液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至3～5 mL。

將上述濃縮液轉(zhuǎn)移至氮吹濃縮管中，氮吹濃縮到1～2 mL，氮氣流下轉(zhuǎn)移至微量進樣小瓶中，用正己烷洗滌氮吹管，一并轉(zhuǎn)入進樣瓶濃縮到約20 μL。加入PCDD/Fs回收率內(nèi)標標準溶液（GB 5009.205—2013附錄B.3）10 μL和DL-PCBs回收率內(nèi)標標準溶液（GB 5009.205—2013附錄B.10（稀釋100 倍），異辛烷）40 μL，繼續(xù)在微小氮氣流下濃縮至約20 μL。先進行PCDD/Fs的測定，完成后將其和DL-PCBs的溶液合并，氮吹至約20 μL，進行DL-PCBs的檢測。如果樣品當日不進行儀器分析，則于-10 ℃下避光保存。

1.2.2 儀器分析條件

PCDD/Fs測定條件：S H-R x i-5 S i l M S 色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度280 ℃；柱升溫程序：初始溫度1 2 0 ℃，保持1.0 m i n，以43 ℃/min升溫至220 ℃，保持15 min，再以2.3 ℃/min升溫至250 ℃，以0.9 ℃/min升溫至260 ℃，以20 ℃/min升溫至310 ℃，保持9 min；接口溫度290 ℃；載氣為氦氣（純度不小于99.999%），流量為1 mL/min，恒流模式；電子電離源；溫度230 ℃；電離能量70 eV。進樣量2 μL；溶劑延遲時間4.5 min。

DL-PCBs測定條件：S H-R x i-5 S i l M S 色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度290 ℃；柱升溫程序：初始溫度8 0 ℃，保持2.0 m i n，以15 ℃/min升溫至150 ℃，以2.5 ℃/min升溫至270 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升溫至310 ℃，保持3 min；接口溫度290 ℃；載氣為氦氣（純度不小于99.999%），流量為1.2 mL/min，恒流模式；電子電離源；溫度230 ℃，電離能量70 eV。進樣量1 μL；溶劑延遲時間6.0 min。

采集方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測模式，母離子/子離子對及其碰撞能量見表1，各化合物的總離子流圖見圖1。

圖1 二噁英類化合物校正標準溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of DL-PCBs and PCDD/Fs standards

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠色譜除脂條件優(yōu)化

先稱取1 g的豬脂肪溶于5 mL的環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液中，考察脂肪的出峰時間，見圖2a。再于5 mL的環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液中加入5 ng的DL-PCBs，考察目標物的出峰時間，見圖2b。最后于含有豬脂肪的5 mL環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液中加入5 ng DL-PCBs，考察目標物的收集時間段，見圖2c。如圖2所示，豬脂肪出峰時間為4～7.5 min，雜質(zhì)峰出峰時間為7.5～10 min，DL-PCBs出峰時間為9.5～13 min，因此目標物的收集時間為8～13 min，則凝膠色譜條件為：上樣量5 mL，流速5 mL/min，收集8～20 min的組分。

圖2 豬脂肪樣品GPC出峰圖Fig.2 GPC chromatograms of pork fat

2.2 凝膠色譜在二噁英里的應(yīng)用

取經(jīng)索氏提取后的豬脂肪2 g，以5 mL的乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，V/V）溶解，加入DL-PCBs回收率和精密度檢查標準溶液，13C12-DL-PCBs標記的定量內(nèi)標溶液，用GPC凈化除脂，收集8～20 min的組分，得到的GPC凈化圖（圖3）。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮和氮吹濃縮后有約20 μL的肉眼可見油層，然后酸化硅膠凈化1 次，濃縮后加入回收率內(nèi)標溶液，進樣測定?；厥章是闆r見圖4，DL-PCBs的回收率為88.3%～120.1%，而內(nèi)標的回收率只有42.1%～48.5%。可見直接以GPC進行除脂凈化，色譜柱容易出現(xiàn)飽和狀態(tài)，目標物出現(xiàn)跟脂肪分子重疊交叉流出的情況，導(dǎo)致脂肪沒有完全去除，從而干擾樣品的結(jié)果測定，同時也說明后續(xù)必須以多層硅膠柱、堿性氧化鋁柱和活性炭柱進一步凈化，以減少基質(zhì)干擾[26-27]。

圖4 豬肉脂肪以GPC除脂時DL-PCBs的回收率情況（n=3）Fig.4 Recoveries of DL-PCBs removed from pork fat by GPC (n = 3)

2.3 凝膠色譜除脂和酸化硅膠除脂的選擇和對比

取豬脂肪2 g，分別加入PCDD/Fs和DL-PCBs的回收率和精密度檢查標準溶液，13C12-PCDD/Fs和13C12-DLPCBs標記的定量內(nèi)標溶液。先以酸化硅膠除脂3 次，再用GPC除脂，樣液濃縮后以凈化儀凈化，最后濃縮、進樣測定。同時取另一份豬脂肪2 g，酸化硅膠除脂3 次后直接以凈化儀凈化，沒有用GPC除脂，其他操作同前?？疾旄魑镔|(zhì)的回收率情況見圖5。可知，脂肪以酸化硅膠除脂3 次基本能夠滿足要求，如果再以GPC除一次脂肪，目標物反而有所損失，降低待測物的回收率。因此，實際測定時以酸化硅膠進行除脂操作。

圖5 凝膠色譜除脂和酸化硅膠除脂的對比Fig.5 Comparison of degreasing by gel chromatography and acidified silica gel

前期實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPC容易產(chǎn)生飽和現(xiàn)象而不能完全去除脂肪，因此，考察脂肪含量對酸化硅膠以及凈化儀除脂時的過載現(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當脂肪含量超過5 g時，用酸化硅膠除脂3 次后，雖然再沒有出現(xiàn)使硅膠變色的情況（判定酸化硅膠除脂步驟已經(jīng)完成）。但是經(jīng)過凈化儀凈化后，DL-PCBs收集管濃縮后仍有40 μL左右的脂肪層，說明此時酸化硅膠除脂和凈化儀除去脂肪部分都出現(xiàn)過載現(xiàn)象。因此，建議稱樣量（以脂肪計）為2～5 g。

2.4 方法的線性、檢出限和回收率

將PCDD/Fs和DL-PCBs校正標準溶液分別按濃度由低到高的順序注入GC-MS/MS中，得到峰面積。以目標物的含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，根據(jù)內(nèi)標法定量，繪制標準曲線，求出線性相關(guān)方程，各物質(zhì)的線性方程見表2，線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.999，表明該方法在較寬的濃度范圍內(nèi)色譜峰面積與含量呈較好的線性關(guān)系。從表2可知，儀器測定時，各化合物的相對保留時間為1.000～1.001，符合國家標準的要求。相對響應(yīng)因子（relative response fact，RRF）的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.39%～16.22%，小于20%，符合國家標準對其小于20%的要求[25]。本實驗采用添加標準物質(zhì)的方法獲得方法檢出限，以空白豬肉為樣品進行方法學驗證，檢出限的測定方法為以工作曲線最低點的濃度加標，然后測定7 組平行樣的偏差，其中檢出限為3 倍標準差，得到方法檢出限[28]，本方法中各目標物的檢出限為0.020～0.172 ng/kg。

表2 PCDD/Fs和DL-PCBs的線性方程Table 2 Linear equations for quantitation of PCDD/Fs and DL-PCBs

以豬肉為例，進行分析過程的精密度和回收率實驗，加入PCDD/Fs和DL-PCBs回收率和精密度標液（GB 5009.205—2013附錄B.4（稀釋10 倍）和B.11（稀釋100 倍））各50 μL，按上述方法進行樣品前處理并分析測定。同時將PCDD/F和DL-PCBs校正標準溶液分別按濃度由低到高的順序注入GC-MS/MS中。以目標物的含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)內(nèi)標法定量。樣品設(shè)3 組平行實驗，得到的內(nèi)標回收率結(jié)果見表3，目標物的回收率結(jié)果見表4。內(nèi)標的回收率為45.3%～122.4%，RSD為1.0%～14.7%；目標物的回收率為64.9%～118.8%，RSD為1.1%～14.7%。因此，該方法準確可靠，符合標準的要求，可以滿足實際豬肉樣品中PCDD/Fs和DL-PCBs的測定要求。

表3 豬肉樣品中PCDD/Fs和DL-PCBs的內(nèi)標回收率和RSD（n=3）Table 3 Recoveries and RSD of PCDD/Fs and DL-PCBs in pork (n = 3)

表4 豬肉樣品中PCDD/Fs和DL-PCBs的回收率和RSD（n=3）Table 4 Recoveries and RSD of PCDD/Fs and DL-PCBs in pork (n = 3)

2.5 實驗系統(tǒng)空白污染情況

二噁英檢測屬于超痕量分析，除了所用的試劑、耗材要保證符合要求外，實驗所用的儀器、器皿都容易殘留二噁英類物質(zhì)，實驗發(fā)現(xiàn)DL-PCBs較PCDD/PCDFs容易殘留，這跟環(huán)境介質(zhì)中普遍存在DL-PCBs有關(guān)[29]，因而容易對實驗過程造成污染。在樣品測定前，需要對系統(tǒng)空白進行考察。二噁英檢測前處理使用的儀器主要有快速溶劑萃取儀、索氏提取儀、全自動凈化儀，以及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、氮吹儀等?？焖偃軇┹腿x和全自動凈化儀在樣品測定后進行一次空白溶劑淋洗，基本可以將殘留物去除。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在使用的過程中避免溶液爆沸；氮吹時避免氮吹針接觸樣液，且對氮吹管進行有機溶劑超聲浸泡和常規(guī)清洗，針頭現(xiàn)用現(xiàn)裝，基本可以避免旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和氮吹儀的污染。

玻璃器皿用完后當天進行清洗，先以洗滌劑進行清洗，自來水沖洗干凈后，于超聲波清洗器中超聲5 min，取出分別以自來水、去離子沖洗干凈，自然晾干。然后分別用丙酮、甲苯、正己烷、二氯甲烷各洗一遍，晾干備用。

在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，二噁英類化合物的殘留主要集中在索氏提取儀，因此對其進行了較詳細考察，實驗選取索氏提取儀的4 個提取位置為對象。待進行一次常規(guī)樣品提取后，首先以正己烷-二氯甲烷溶液（1∶1，V/V）加熱循環(huán)80 次淋洗，濃縮后上機測定（編號分別為1-1、2-1、3-1、4-1），發(fā)現(xiàn)DL-PCBs有較高的殘留。而PCDD/PCDFs殘留較低，符合標準的檢測要求。然后分別用丙酮、甲苯、正己烷、二氯甲烷進行洗滌，再以甲苯進行加熱循環(huán)80 次淋洗，濃縮后上機測定（編號分別為1-2、2-2、3-2、4-2），DL-PCBs殘留達到標準的檢測要求，同時也說明上述的洗滌方法符合測定要求。具體檢測結(jié)果見圖6，DL-PCBs的殘留主要集中在PCB-77、PCB-123、PCB-118、PCB-105、PCB-167、PCB-157、PCB-189這7 種物質(zhì)，其他5 種物質(zhì)的殘留較少，而同位素標記的化合物殘留也較少。因此，在日常檢測中，要多關(guān)注以上7 種DL-PCBs的殘留情況，當考察其在樣品的回收率情況時，也要考慮其在實驗中的系統(tǒng)空白殘留情況。

圖6 索氏提取儀系統(tǒng)空白污染情況Fig.6 Blank pollution of Soxhlet extractor system

2.6 實際樣品測定

應(yīng)用本方法對一份送檢豬肉樣品進行G C-M S/M S 方法的檢測，同時對其進行分包檢測和比對，分包單位采用的檢測方法為GB 5009.205—2013，檢測儀器為H R G C-H R M S，得到的總毒性當量（toxicity equivalence，TEQ）值為0.319 ng/kg（WHO2005-TEQ-Upperbound），應(yīng)用本方法得到的總TEQ值為0.363 ng/kg（WHO2005-TEQ-Upperbound），2 種方法得到的總TEQ值偏差為12.9%，小于15%，與相關(guān)文獻[30]報道的GC-MS/MS和HRGC-HRMS儀器比對結(jié)果一致，2 種儀器的測定偏差為0.7%～14%。說明該方法檢測結(jié)果準確，適用于豬肉中二噁英的定性和定量檢測。同時應(yīng)用本方法對市售的4 份豬肉進行二噁英含量測定，結(jié)果為0.047 8～0.305 ng/kg（WHO2005-TEQ-Upperbound），符合歐盟的限量要求。

3 結(jié) 論

對采用GC-MS/MS法測定豬肉樣品中PCDD/Fs和DLPCBs的測定步驟進行了方法優(yōu)化和探討。豬肉為高脂肪含量樣品，對比了GPC和酸化硅膠除脂2 種方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GPC除脂對PCDD/Fs和DL-PCBs的回收率影響較大，且容易存在除脂不完全的現(xiàn)象，后續(xù)還需要進一步以酸化硅膠進行除脂，降低了目標物的回收率，因此，酸化硅膠除脂更適合超痕量的二噁英類化合物的分析和檢測。高脂肪含量的樣品要減少稱樣量，避免凈化步驟出現(xiàn)過飽和現(xiàn)象。實驗對系統(tǒng)空白污染也提供了較為詳細的探討，在索氏提取儀的使用過程中要注意DL-PCBs的污染和殘留。實驗結(jié)果表明，該方法的回收率和精密度、RRF、各化合物的方法檢出限等參數(shù)都符合國家標準要求，方法具有普適性，為保障食品安全提供了很好的技術(shù)支持。