寧 霄，張景然，金紹明,*，曹 進(jìn),*

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.SCIEX中國，北京 100015）

農(nóng)藥作為一類有機(jī)污染物，很容易通過食用受污染的飼料或環(huán)境接觸等多種途徑遷移至動(dòng)物體內(nèi)[1-2]。大多數(shù)農(nóng)藥都具有高親脂性，因此更容易在牛乳這種高脂肪產(chǎn)品中蓄積[3-4]。據(jù)報(bào)道，牛奶和牛奶衍生產(chǎn)品中可能含有多種有機(jī)磷、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥[5]，對(duì)動(dòng)物及人體產(chǎn)生長期、微量、慢性毒性效應(yīng)，甚至潛在致癌作用[6-9]。嬰幼兒配方乳粉（infant and young children formula，IFM）主要基于對(duì)牛乳稀釋、脫脂并強(qiáng)化維生素和礦物質(zhì)而生產(chǎn)[10]。由于原料生產(chǎn)鏈的潛在污染，殘留農(nóng)藥可能遷移至IFM中。IFM作為一種在兒童喂養(yǎng)過程中必不可少的食品，質(zhì)量安全至關(guān)重要。因此，近年來歐盟和食品法典委員會(huì)等多國政府和國際機(jī)構(gòu)[11-14]紛紛對(duì)此類產(chǎn)品中的農(nóng)藥制定了嚴(yán)格的最大殘留限量（maximum residue limits，MRLs），以降低對(duì)健康造成危害的風(fēng)險(xiǎn)。我國GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》針對(duì)牛乳規(guī)定了125 種農(nóng)藥的MRLs[15]，其中涉及GB 23200.39—2016《食品中噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[16]和GB 23200.49—2016《食品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》[17]等18 種國家標(biāo)準(zhǔn)及SN/T 2234—2008《進(jìn)出口食品中丙溴磷殘留量檢測方法 氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法》等7 種出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等[18]。上述方法前處理方法各異，檢測技術(shù)不盡相同，且能夠檢測的農(nóng)藥及其代謝物數(shù)量仍然不能覆蓋所有對(duì)殘留量有規(guī)定的組分。

可見，與限量標(biāo)準(zhǔn)配套的檢測方法尚不完善。同時(shí)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)限定的農(nóng)藥數(shù)量有限，亟需建立一個(gè)靈敏、準(zhǔn)確、高通量的農(nóng)藥殘留檢測分析平臺(tái)，高效評(píng)估多類別農(nóng)藥的暴露風(fēng)險(xiǎn)。目前，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是農(nóng)藥殘留分析最受關(guān)注的兩種方法[19-21]。對(duì)于多數(shù)農(nóng)藥極性、非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定等特點(diǎn)，后者作為一種適用范圍廣，前處理簡便的技術(shù)，被更加廣泛地應(yīng)用于各類基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的分析[22-24]。然而上述兩種低分辨率技術(shù)受到分析速度和掃描模式限制無法達(dá)到高通量篩查檢測和確證的要求，且需要實(shí)時(shí)配備使用參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[25]。

本研究針對(duì)現(xiàn)有方法的不足，基于超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）在質(zhì)量精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)可溯源性和數(shù)據(jù)庫檢索等方面的優(yōu)勢(shì)[26-27]，針對(duì)牛乳及IFM開發(fā)并驗(yàn)證了一種同步定性篩查和定量分析的農(nóng)藥殘留檢測方法[28]。該方法采用QuEChERS提取和Captiva EMR-Lipid萃取柱凈化的穩(wěn)定可靠工作流程，有效降低了復(fù)雜基質(zhì)中共流出物對(duì)待測組分的干擾。同時(shí)利用ZenoTOF? 7600系統(tǒng)的碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation，CID）和電子激活解離（electron activated dissociation，EAD）碰撞室，極大豐富了二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，進(jìn)一步提高了篩查確證的準(zhǔn)確性；借助Zeno SWATH DIA采集模式，快速獲得多種農(nóng)藥化合物定性篩查和定量分析的完整數(shù)據(jù)，并通過Zeno trap的富集功能在不改變?cè)胍粼鲆娴那闆r下顯著提升農(nóng)藥二級(jí)碎片的響應(yīng)值，從而顯著改善了定量分析的靈敏度和重復(fù)性。該研究通過單針進(jìn)樣既可掌握法規(guī)限定農(nóng)藥的殘留情況，又能捕捉樣品中盡可能多的農(nóng)藥殘留信息[29]，目標(biāo)農(nóng)藥種類覆蓋我國GB 2763—2021、歐洲和北美多個(gè)地區(qū)的食品安全法規(guī)限定指標(biāo)，以期為相關(guān)食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及質(zhì)控、監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品（n＝1 4）購自本地超市；I F M 樣品（n＝36）購自中國北京、廣東、呼和浩特、陜西、遼寧等地超市；牛乳于0～4 ℃保存，IFM密封常溫保存。質(zhì)控樣品購自上海博尼生物技術(shù)有限公司。

所有農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥9 8%） 德國D r.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸銨（均為質(zhì)譜純）Thermo Fisher公司；甲酸（質(zhì)譜純） 美國Fluka公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》一級(jí)水要求）；Na2SO4、MgSO4、NaCl（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N-丙基乙二胺吸附劑（primary secondary amine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18） 美國Supelco公司；Captiva EMR-Lipid 6 mL萃取柱 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ExionLCTM 2.0 HPLC系統(tǒng)和ZenoTOFTM7600系統(tǒng)美國AB SCIEX公司；十萬分之一天平 瑞士Mettler Toledo公司；CF 16RXII離心機(jī) 日本Hitchi公司；DKZ-450A振蕩提取儀 上海森信科技股份有限公司；PRO200組織勻漿儀 上海博誼生物科技有限公司；XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；Mili-Q Advangtage A10純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取2 g乳粉樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL 40 ℃水溶解后吸取5 mL（液體牛乳直接稱取2 g），加入5 mL乙腈，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min，再加入鹽包（含1 g NaCl和4 g Na2SO4），渦旋振蕩1 min后，在4 ℃、5 000 r/min離心5 min。將上清液4.8 mL轉(zhuǎn)移至新的15 mL聚丙烯離心管中，加入1.2 mL水，輕輕混勻，上樣至Captiva EMR-Lipid 6 mL萃取柱上，并進(jìn)行重力自流，結(jié)束后，將1.5 mL溶劑（乙腈-水（4∶1，V/V））加入Captiva EMR-Lipid萃取柱中，并進(jìn)行重力自流，收集全部洗脫液，在40 ℃氮?dú)獯蹈珊螅?00 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm微孔過濾后，待測。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品1 0 m g（精確至0.01 mg），分別置于10 mL棕色容量瓶中，根據(jù)其溶解性選擇甲醇、乙腈、丙酮等溶劑溶解并定容至刻度，得到單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃避光保存，供配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液使用；實(shí)驗(yàn)中用甲醇逐級(jí)稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，于4 ℃保存。

1.3.2.2 空白基質(zhì)提取液

樣品按照1.3.1節(jié)條件進(jìn)行前處理后進(jìn)行儀器分析，當(dāng)目標(biāo)組分的定性與定量離子信噪比均小于3時(shí)，樣品確定為空白基質(zhì)?？瞻谆|(zhì)按照1.3.1節(jié)條件前處理，獲得空白基質(zhì)提取液。

1.3.2.3 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，供UPLC-QTOF-MS測定。

1.3.3 色譜條件

Luna Omega Polar C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm），柱溫40 ℃；進(jìn)樣體積1 μL；流動(dòng)相：A為2 mmol/L甲酸銨和0.01%甲酸溶液，B為2 mmol/L甲酸銨和0.01%甲酸-甲醇溶液；流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～1 min，97% A、3% B；1～1.5 min，9 7%～7 5% A、3%～2 5% B；1.5 ～2.5 m i n，8 5%～5 0% A、1 5%～5 0%；2.5 ～1 8 m i n，5 0%～3 0% A、5 0%～7 0% B；1 8 ～2 3 m i n，77%～2% A、70%～98% B；23～27 min，2% A、98% B；27～27.1 min，2%～97% A、98%～3% B；27.1～30 min，97% A、3% B。弱洗針溶液：10%甲醇溶液；強(qiáng)洗針溶液：80%甲醇溶液，用于清洗進(jìn)樣針的外壁，避免殘留。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式；離子化電壓5 500 V；離子源溫度350 ℃；碰撞氣流量9 psi；氣簾氣壓力30 psi；霧化氣GS1壓力50 psi；輔助氣GS2壓力50 psi；掃描模式：Zeno SWATH DIA。

1.3.5 數(shù)據(jù)庫的建立

將500 種目標(biāo)化合物配制成質(zhì)量濃度為2 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，品種涵蓋殺真菌劑、殺蟲劑、除草劑等農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物。應(yīng)用UPLC在上述色譜分離條件下進(jìn)行色譜分離，應(yīng)用QTOF在預(yù)設(shè)的低、中、高碰撞能量（20、35、50 eV）下，采用動(dòng)態(tài)背景扣除功能自動(dòng)扣除背景離子完成數(shù)據(jù)采集，即可獲得目標(biāo)化合物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜信息。其中，一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：去簇電壓60 V，質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z70～1 000，累積時(shí)間0.1 s。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z50～1 000，根據(jù)實(shí)際分布，共拆分成10 段。進(jìn)樣過程中每隔5 個(gè)樣品進(jìn)行一次自動(dòng)校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

考慮到本方法中500 種目標(biāo)農(nóng)藥的性質(zhì)和極性差異較大，為兼顧極性與疏水化合物的平衡保留，本研究選擇Luna Omega Polar C18色譜柱：通用型C18配體可以提供疏水相互作用，同時(shí)，極性基團(tuán)修飾的顆粒表面增強(qiáng)了其極性保留能力，且使之水相穩(wěn)定。這些特性使這種新型UPLC固定相增強(qiáng)了強(qiáng)極性化合物保留能力，也成為極性與疏水化合物平衡保留的選擇。

2.2 流動(dòng)相的選擇

在使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀器分析農(nóng)藥殘留時(shí)，多采用水和甲醇的流動(dòng)相體系，同時(shí)為保證方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，需要在水和甲醇溶液中加入等量的酸或者緩沖鹽。部分農(nóng)藥（如菊酯類農(nóng)藥）在液質(zhì)離子化的過程中，母離子常以[M＋NH4]＋峰響應(yīng)情況最好，本研究首先在水和甲醇溶液中加入不同濃度的甲酸銨（2、5、10 mmol/L）作為流動(dòng)相，考察化合物的響應(yīng)情況。結(jié)果表明，在相同梯度、相同色譜柱條件下，隨著甲酸銨濃度的升高，大部分化合物都有響應(yīng)下降的情況（圖1A中縱坐標(biāo)以流動(dòng)相中甲酸銨濃度2 mmol/L時(shí)農(nóng)藥響應(yīng)為基準(zhǔn)100%，分別統(tǒng)計(jì)不同鹽濃度下農(nóng)藥響應(yīng)的百分比），因此最終選定流動(dòng)相中甲酸銨濃度為2 mmol/L。為了增加農(nóng)藥的離子化效率，繼續(xù)嘗試在水和甲醇中加入不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸（0%、0.01%、0.05%、0.10%），結(jié)果表明，隨著流動(dòng)相中甲酸的加入，大部分農(nóng)藥的響應(yīng)呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢(shì)（圖1B中縱坐標(biāo)為流動(dòng)相中不加甲酸時(shí)農(nóng)藥響應(yīng)為基準(zhǔn)100%，分別統(tǒng)計(jì)不同甲酸體積分?jǐn)?shù)下農(nóng)藥響應(yīng)的百分比），因此最終選擇甲酸的加入體積分?jǐn)?shù)為0.01%。

圖1 流動(dòng)相中甲酸銨濃度（A）和甲酸體積分?jǐn)?shù)（B）對(duì)化合物響應(yīng)的影響Fig.1 Effect of ammonium formate (A) and formic acid (B)concentrations in mobile phase on responses to pesticide compounds

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

乙腈在多種類別的農(nóng)藥化合物中體現(xiàn)出優(yōu)異的提取效率，且在肉、蛋、水產(chǎn)品等復(fù)雜基質(zhì)樣品中的去除脂肪、蛋白質(zhì)和糖分等雜質(zhì)效果好，并且揮發(fā)性低，因此本研究選擇乙腈作為提取溶劑，以添加量為10 μg/kg的IFM為研究對(duì)象，以提取回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察純乙腈、含體積分?jǐn)?shù)分別為0.1%、1%和2%的甲酸-乙腈以及含體積分?jǐn)?shù)2%的氨水乙腈，以考察提取劑酸堿度對(duì)多組分農(nóng)藥的提取效果。結(jié)果表明，2%氨水乙腈對(duì)多種類農(nóng)藥的提取效果普遍不理想，這可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥在堿性條件下不穩(wěn)定，易分解；當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，部分農(nóng)藥的提取回收率相比于酸化前略有上升（如敵瘟磷、樂果和吡唑醚菌酯等回收率提高4%～9%），但對(duì)多數(shù)農(nóng)藥無明顯影響，甚至甲脒類殺蟲劑等回收率顯著下降（如雙甲脒從92%降至3%、殺蟲脒從94%降至67%），且隨著酸化程度的增加回收率下降趨勢(shì)更加明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)選取乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 提取方法的選擇

以IFM為研究對(duì)象，準(zhǔn)確稱量2.0 g樣品，添加量為10 μg/kg時(shí)，分別考察乙腈體積為2、5、10 mL時(shí)對(duì)農(nóng)藥殘留的提取效果。結(jié)果表明，采用5 mL乙腈能達(dá)到充分提取目標(biāo)分析物的目的，繼續(xù)增加乙腈體積，提取效果未見明顯改善。

2.4 凈化方法的優(yōu)化

牛奶及乳粉中農(nóng)藥的最大殘留限量通常遠(yuǎn)低于普通水果和蔬菜。因此，分析此類樣中的農(nóng)藥殘留對(duì)樣品前處理方法去除基質(zhì)干擾的能力提出更高的要求?？紤]到牛奶中脂肪、蛋白質(zhì)和碳水化合物的含量[30]分別為3.25%、3.15%和4.80%，其余都為水分。本實(shí)驗(yàn)首先考察了使用鹽包（含1 g NaCl和4g Na2SO4）或僅用純乙腈提取后化合物的響應(yīng)值變化情況，結(jié)果如圖2所示，使用QuEChERS方法提取多數(shù)農(nóng)藥的響應(yīng)值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中11%的化合物響應(yīng)值上升幅度超過20%，因此確定在使用乙腈提取后加入鹽包去除部分水分及水溶性干擾物。

圖2 QuEChERS鹽析對(duì)化合物響應(yīng)增加情況分布Fig.2 Distribution of QuEChERS salting-out response to increase in pesticide compounds

以回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)使用Captiva EMRLipid萃取柱和QuEChERS dSPE技術(shù)的凈化效果進(jìn)行考察。在常用的QuEChERS凈化吸附劑中，PSA通過陰離子交換吸附蛋白質(zhì)、脂肪酸、糖類和極性較高的有機(jī)酸性物質(zhì)；C18吸附脂肪和脂類等非極性干擾物。因此本研究選擇C18和PSA作為凈化吸附劑，并加入適量無水MgSO4進(jìn)一步去除提取液中的水分。通過對(duì)3 種凈化材料配比（組合1：300 mg C18、50 mg PSA、1.5 g MgSO4；組合2：100 mg C18，150 mg PSA、1.5 g MgSO4）進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，采用組合2凈化后的所有組分回收率均低于50%，尤其是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的回收率更低。分析原因?yàn)榇蠖鄶?shù)農(nóng)藥為親脂性，PSA在清理脂質(zhì)雜質(zhì)的同時(shí)可能吸附待測組分。此外擬除蟲菊酯類農(nóng)藥與蛋白質(zhì)之間具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，PSA對(duì)蛋白質(zhì)的吸附也可能造成此類化合物回收率的損失。因此降低PSA的用量，增加C18的用量彌補(bǔ)對(duì)脂類等干擾物的凈化后，在凈化和回收之間獲得了相對(duì)理想的平衡效果，然而氯氨吡啶酸、咪唑煙酸等回收率仍低于5%，苯嘧磺草胺、噻草酮等回收率仍低于40%。進(jìn)而嘗試使用Captiva EMR-Lipid萃取柱凈化。

隨后研究Captiva EMR-Lipid萃取柱凈化步驟的回收率，對(duì)通過兩個(gè)連續(xù)洗脫萃取物步驟洗脫的總量進(jìn)行測定。二次洗脫前后牛奶和IFM中加標(biāo)量為10 μg/kg的農(nóng)藥總體回收率比較圖見圖3，回收率數(shù)據(jù)箱線圖中，方框的中間點(diǎn)（×）表示回收率中位值，方框底部和頂部的線分別代表下四分位回收率值和上四分位回收率的值。箱線（垂直線）從方框的兩端延伸至最小值和最大值?？傮w而言，二次洗脫可明顯提高農(nóng)藥的回收率。因此，在經(jīng)過初始樣品混合物洗脫后，應(yīng)用1.5 mL溶劑（乙腈-水（4∶1，V/V））進(jìn)行二次洗脫。

圖3 Captiva EMR-Lipid萃取柱洗脫次數(shù)對(duì)農(nóng)藥及其代謝物回收率的影響Fig.3 Effect of number of elution cycles in Captiva EMR-lipid cleanup on recoveries of pesticide and metabolites

對(duì)使用上述兩種凈化技術(shù)得到的農(nóng)藥回收率進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，Captiva EMR-Lipid萃取柱在不使用堿性吸附劑PSA的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了理想的凈化效果，有效避免了酸性農(nóng)藥的大量損失。

圖4 不同凈化技術(shù)對(duì)酸性農(nóng)藥回收率的影響Fig.4 Effects of different purification techniques on recoveries of acidic pesticides

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.5.1 掃描模式的選擇

選擇Zeno SWATH DIA的采集模式，利用Zeno trap富集功能與TOF加速器離子脈沖相匹配，解決了傳統(tǒng)Q-TOF系統(tǒng)低質(zhì)量端離子利用率低的問題，從而改善了定量分析的靈敏度和重復(fù)性。由圖5可見，Zeno阱富集后小分子農(nóng)藥化合物在TOF加速器中的豐度明顯改善，使得78%的目標(biāo)組分峰面積增加至10～20 倍。以莠滅凈為例（圖6），開啟Zeno trap功能后峰面積增加至12.6 倍，信噪比增加至13.7 倍，可見在不改變?cè)胍粼鲆娴那闆r下顯著提高了莠滅凈的二級(jí)碎片響應(yīng)值。

圖5 Zeno功能開啟對(duì)化合物響應(yīng)增加倍數(shù)分布圖Fig.5 Effect of Zeno function activation on fold of increase in responses to pesticide compounds

圖6 Zeno功能開啟對(duì)莠滅凈響應(yīng)增加效果譜圖Fig.6 Zeno function activation increased the response to atrazine

2.5.2 一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫的建立

在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下，對(duì)500 種化合物先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，獲得目標(biāo)物的一級(jí)信息，其中481 種化合物母離子加合形式為[M＋H]＋，19 種化合物加合形式為[M＋NH4]＋。在軟件中輸入化合的名稱、保留時(shí)間、分子式、精確相對(duì)分子質(zhì)量、母離子m/z、質(zhì)量偏差以及離子化形式等信息，建立一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫。

2.5.3 二級(jí)譜圖庫的建立

選擇Zeno TOF 7600系統(tǒng)的EAD碰撞室，基于自由基解離機(jī)制，針對(duì)農(nóng)藥的單電荷小分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)采用EIEIO高能量碎裂模式，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)QTOF中CID裂解不充分的缺陷，極大豐富了二級(jí)質(zhì)譜碎片信息。以苯硫威為例，由圖7可見，經(jīng)CID碎裂僅獲得一個(gè)碎片離子，與數(shù)據(jù)庫匹配到多個(gè)結(jié)果，而經(jīng)EAD碎裂獲得了豐富的二級(jí)碎片離子，顯著增加了匹配結(jié)果的準(zhǔn)確性，有效降低假陽性率。當(dāng)目標(biāo)物在保留時(shí)間窗口的響應(yīng)值超過閾值，則自動(dòng)觸發(fā)在EAD碎裂模式下采用不同碰撞能量（（35±15）eV）采集并疊加的二級(jí)碎片譜圖，由此建立該化合物的二級(jí)信息譜庫。

圖7 EAD碎裂技術(shù)對(duì)苯硫威二級(jí)碎片對(duì)比圖Fig.7 Comparison of secondary benthiocarb fragments without and with EAD

2.5.4 基于譜庫的定性篩查和確認(rèn)

參照歐盟2002/657/EC規(guī)定：當(dāng)使用高分辨質(zhì)譜確證時(shí)，至少需要2 個(gè)定性位點(diǎn)（1 個(gè)高分辨母離子及 1 個(gè)特征碎片離子），且質(zhì)量偏差≤5×10-6。本實(shí)驗(yàn)篩查確認(rèn)規(guī)則為：母離子和碎片離子的質(zhì)量偏差絕對(duì)值小于5×10-6，保留時(shí)間誤差小于0.5 min，差異同位素比小于10%，譜庫相似程度大于80%，以上4 個(gè)因子占比分別為30%、30%、10%、30%。

為考察所建立的篩查方法的可靠性，本實(shí)驗(yàn)采用已建立的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫和二級(jí)譜圖庫對(duì)添加了500 種農(nóng)藥的牛乳樣品進(jìn)行自動(dòng)檢索。目標(biāo)農(nóng)藥化合物的綜合得分為90.4～99.4 分，所得結(jié)果均大于定性篩查的最低限（90 分）。由此可見，本實(shí)驗(yàn)建立的篩查方法準(zhǔn)確可靠，能夠在無對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品的情況下完成所有目標(biāo)農(nóng)藥的篩查與確證。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）

普遍存在于質(zhì)譜分析中，主要由目標(biāo)分析物的共提取組分互相作用，影響分析物電離所致。計(jì)算公式如下：ME/%＝[（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）-1]×100。結(jié)果越接近100%，則ME越小。考察125 種限制農(nóng)藥在牛乳和IFM中的ME，結(jié)果如圖8所示，兩種樣品中只有個(gè)別農(nóng)藥出現(xiàn)了基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其余農(nóng)藥的ME值均為負(fù)，體現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。其中，牛乳和IFM中表現(xiàn)為中等（50%＞|ME|≥20%）或強(qiáng)抑制效應(yīng)（|ME|≥50%）的數(shù)量占總數(shù)的比例分別為53%和79%，可見樣品具有較強(qiáng)的ME，尤其是經(jīng)過強(qiáng)化維生素和礦物質(zhì)之后的IFM更加明顯。為克服ME，常用的方法有基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法、采用性質(zhì)相近或穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法、減小進(jìn)樣量等。其中，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法不但效果良好，成本低，而且對(duì)于本研究具有的易于獲得，可操作性強(qiáng)的特點(diǎn)。因此本研究使用配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法降低ME。

圖8 待測組分在牛乳和IFM樣品中ME分布Fig.8 Matrix effect distribution of tested components in milk and infant formula milk powder samples

2.7 農(nóng)藥在樣品提取液中的穩(wěn)定性

采用空白基質(zhì)提取液中加標(biāo)的方法，考察2 種基質(zhì)提取液中103 種限制農(nóng)藥及其代謝物在40 h內(nèi)的穩(wěn)定性。加標(biāo)量為10 μg/kg（5 μg/L）時(shí)，分別測定目標(biāo)化合物在第0、4、8、12、24、40小時(shí)的濃度，若計(jì)算得出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于20%則認(rèn)為沒有發(fā)生明顯降解。結(jié)果表明，40 h內(nèi)所有目標(biāo)農(nóng)藥在2 種樣品基質(zhì)提取液中均未發(fā)生顯著降解，可以滿足分析要求。

2.8 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.8.1 線性范圍、檢出限和定量限

在優(yōu)化的分析條件下，配制103 種農(nóng)藥及其代謝物的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)UPLC-QTOF-MS測定后，以農(nóng)藥定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，農(nóng)藥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以RSN=3的添加量為方法檢出限，以RSN=10的添加量為方法定量限。所有組分在相應(yīng)線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。當(dāng)牛乳稱取2 g時(shí)，檢出限為0.025～0.5 μg/kg，定量限為0.15～3 μg/kg，當(dāng)IFM稱取2 g時(shí)，檢出限為0.075～1.25 μg/kg，定量限為0.15～2.5 μg/kg，均小于GB 2763—2021標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定相應(yīng)化合物農(nóng)藥在牛乳中的MRLs，可滿足快速篩查及確證的需要。

2.8.2 精密度與精密度

在牛乳和IFM 2 種空白樣品中添加適量目標(biāo)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，3 個(gè)添加水平中，每個(gè)水平均進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，所有化合物的平均加標(biāo)回收率在72.7%～114.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～13.6%之間，滿足國際上對(duì)食品中痕量藥物殘留檢測的需要，方法具有較好的回收率和重復(fù)性，適用于2 種動(dòng)物源性食品中103 種農(nóng)藥殘留的同時(shí)測定。

2.9 方法應(yīng)用

2.9.1 質(zhì)控樣品的分析

為驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，分別應(yīng)用建立的方法和國標(biāo)方法對(duì)Fapas嬰兒配方乳粉質(zhì)控樣品（編號(hào)T05157QC）中二嗪農(nóng)、環(huán)氧唑菌、苯銹啶、豐索硫磷、滅多威、亞硫磷、氧樂靈進(jìn)行分析，結(jié)果見表1，所有目標(biāo)組分檢測值均分布在|Z|≤2的范圍內(nèi)，說明該方法的定量結(jié)果與質(zhì)控樣品的實(shí)際含量相吻合。兩種方法測定結(jié)果t值均小于95%置信區(qū)間查表值（2.13），可見該方法與國標(biāo)方法檢測結(jié)果無顯著性差異。

表1 質(zhì)控樣品分析結(jié)果Table 1 Results of analysis of quality control samples

2.9.2 實(shí)際樣品的分析

應(yīng)用本方法對(duì)市售的牛乳樣品（n＝14）和IFM樣品（n＝36）中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速篩查檢測，結(jié)果表明，在14 份牛乳樣品中共檢出2 種化合物，分別為吡蟲啉和啶蟲脒。吡蟲啉和啶蟲脒屬于新煙堿類殺蟲劑，并且在我國應(yīng)用非常廣泛。我國對(duì)牛奶中啶蟲脒和吡蟲啉的MRLs分別為0.02 mg/kg和0.1 mg/kg。在14 份牛乳樣品中6 份（占比42.8%）檢出啶蟲脒，4 份（占比28.6%）檢出吡蟲啉，但檢出值均未超過MRLs。牛奶中殺蟲劑的檢出說明在奶牛養(yǎng)殖過程中可能會(huì)使用殺蟲劑控制奶牛養(yǎng)殖環(huán)境，或者在飼料原料中可能存在農(nóng)藥殘留，通過飼喂而遷移到牛奶中。樣品中檢出農(nóng)藥的綜合檢索得分均高于70。檢測的共36 份IFM樣品均未檢出目標(biāo)農(nóng)藥，可見在2016年10月1日《嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)品配方注冊(cè)管理辦法》正式施行后，推動(dòng)企業(yè)質(zhì)量控制能力的加強(qiáng)，有效保障了嬰配粉的質(zhì)量安全。下一步工作將擴(kuò)大樣品采集規(guī)模，為持續(xù)有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

3 結(jié) 論

利用UPLC-QTOF-MS的高質(zhì)量精度、高掃描速率、寬線性范圍、高靈敏度等特點(diǎn)，在30 min的儀器分析時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了牛乳及IFM農(nóng)殘定性篩查和定量分析數(shù)據(jù)的同時(shí)采集。該方法通過建立基于質(zhì)量偏差、保留時(shí)間偏差、差異同位素比、譜庫相似程度4 個(gè)因子的篩查數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)了500 種農(nóng)藥殘留的定性篩查，通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)定量，開發(fā)并驗(yàn)證了一種采用QuEChERS提取和Captiva EMR-Lipid萃取柱凈化的工作流程，在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了103 種限制農(nóng)藥的定量分析。本方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定，方法學(xué)考察指標(biāo)均能滿足痕量分析要求，為牛乳及IFM中多未知農(nóng)殘的篩查及定量提供了高效可靠的技術(shù)手段，對(duì)進(jìn)一步加強(qiáng)此類生產(chǎn)中農(nóng)藥的監(jiān)控，確保質(zhì)量安全具有重要意義。