王 磊，賈玉龍*，羅彥玉，鄒春霞，張 瑩

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

方竹筍因含豐富的營養(yǎng)成分而備受人們喜愛，但其含大量水分存在不易貯藏的缺點(diǎn)，針對此可采用干制、灌裝和發(fā)酵等主要的加工形式解決。其中發(fā)酵最為常用，可分為自然發(fā)酵和接種發(fā)酵，自然發(fā)酵的產(chǎn)品容易出現(xiàn)問題，產(chǎn)品質(zhì)量無法控制，而接種發(fā)酵既可以縮短發(fā)酵周期又可以保證質(zhì)量[1]。已有的研究表明乳桿菌屬，乳球菌屬，魏斯氏菌屬是竹筍發(fā)酵過程的主要優(yōu)勢菌群[2]，而植物乳桿菌是發(fā)酵竹筍制品的主要乳酸菌株，能保持竹筍的質(zhì)構(gòu)并且產(chǎn)生特殊的風(fēng)味還能抑制病原菌的生長[3]。接種發(fā)酵竹筍常用的乳桿菌多來源于植物[4]，而來源于人的乳桿菌也是一類重要的益生菌，但鮮見其發(fā)酵竹筍的相關(guān)研究。人源羅伊氏乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri）被證明有調(diào)節(jié)腸道菌群[5]、增加機(jī)體免疫[6]等功效，現(xiàn)常用于乳制品和保健食品的研發(fā)[7]等。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)薏苡仁酶解產(chǎn)物能顯著促進(jìn)人源羅伊氏乳桿菌的生長，同時其發(fā)酵薏苡仁和牛奶混合物能調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠的脂代謝紊亂[8]。此外羅伊氏乳桿菌是異型發(fā)酵菌種，有研究表明異型發(fā)酵菌種能快速啟動竹筍發(fā)酵[9]，同時改善同型乳酸菌發(fā)酵竹筍的過酸和不易貯存的問題[10]，故本實(shí)驗(yàn)選用羅伊氏乳桿菌發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿。

此外，考慮到不同形狀的竹筍發(fā)酵后產(chǎn)品品質(zhì)不同，前處理的差異也會影響發(fā)酵周期和風(fēng)味。周金沙等[11]研究表明絲狀酸筍中益生菌屬的相對豐度高于塊狀。李梅等[12]研究不同處理下毛竹筍的品質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)燙漂乳酸菌發(fā)酵能效保持竹筍的質(zhì)構(gòu)特性。所以本研究利用濕法超細(xì)粉碎技術(shù)處理方竹筍，得到的全漿更易發(fā)酵。濕法超細(xì)粉碎利用超高的剪切力對物料進(jìn)行剪切摩擦和撞擊等作用，可使物料具有更好的溶解性、分散性[13]，其已用于豆?jié){[14]、雞骨泥[15]和大蒜[16]等研究。

非靶向代謝組學(xué)是利用液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用等技術(shù)對樣本內(nèi)分子質(zhì)量小于1 000 Da的化合物進(jìn)行檢測，篩選差異代謝物進(jìn)行代謝通路的富集分析[17]，其常用于研究發(fā)酵前后的代謝差異物。張妍等[18]研究了2 種乳酸菌發(fā)酵玉米及其副產(chǎn)物的主要代謝成分是1-羥基-2-萘甲酸、兒茶素等有明顯生物活性的物質(zhì)，并富集到5 條顯著的代謝通路。Huang Pan等[19]研究發(fā)現(xiàn)以植物乳桿菌CCFM8610為發(fā)酵劑的乳制品中關(guān)鍵代謝物主要是苯甲酸、6-羥基己酸、D-苯基乳酸、馬尿酸等。但非靶向代謝組學(xué)在方竹筍發(fā)酵方面鮮有報(bào)道。為了解乳桿菌發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿的主要代謝物質(zhì)和代謝通路，本研究用2 種乳桿菌單一和混合發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿，運(yùn)用超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）非靶向代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法對發(fā)酵前后的差異代謝物進(jìn)行對比，同時用京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路富集分析。探究植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌發(fā)酵的特征代謝，以期為方竹筍超細(xì)全漿發(fā)酵的開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)際參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

方竹筍：2021年9月采于貴州遵義桐梓縣未脫殼，4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，放置在-20 ℃冰箱待用。羅伊氏乳桿菌（保藏號BNCC 186563）、植物乳桿菌（保藏號BNCC 194165） 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

甲醇（色譜級） 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Q ExactiveTMHF質(zhì)譜儀、Vanquish UHPLC色譜儀、Hypesil Gold色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm） 德國Thermo Fisher公司；D3024R低溫離心機(jī) 美國Scilogex公司；H2-16KR型臺式離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司：SW-CJ-2D超凈工作臺 浙江蘇凈凈化公司；scientz-18N型冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物技術(shù)有限公司；LDZE-75KB-II高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；QDWZ3000-18D/QDGX-18型濕法超微粉碎機(jī)無錫輕大食品裝備有限公司；JR-200型高速粉碎機(jī)東莞市新美華機(jī)電設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿的制備

方竹筍去殼洗凈、切塊，筍與水按2∶1（g/mL）比例混合，粗粉碎4 min，細(xì)粉碎1 次（樣品溫度35 ℃），冷卻分裝，-20 ℃保存。羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌活化后，單菌落接于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)到菌濃度為107CFU/mL[20-21]。100 g超細(xì)粉，105 ℃滅菌20 min，冷卻后加入5%的種子液，37 ℃發(fā)酵48 h。發(fā)酵后樣品冷凍干燥48 h，粉碎過100 目，4 ℃保藏。其中，混菌發(fā)酵組比例1∶1。非發(fā)酵組記為CK、羅伊氏乳桿菌發(fā)酵組記為LR、植物乳桿菌發(fā)酵組記為LP、混菌發(fā)酵組記為LRP。

1.3.2 基本組成及指標(biāo)測定

蛋白質(zhì)含量：參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法測定；脂肪含量：參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪測定》索氏抽提法測定；膳食纖維含量：參照GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》；灰分含量：參照GB 5009.4—2016《食品中灰分測定》；pH值使用pH計(jì)測定；可滴定酸測定參考楊維維[22]的方法。

1.3.3 代謝物提取

將2 g樣品加入液氮粉碎，取100 mg的組織樣本，放入EP管中，加入500 μL的80%甲醇溶液并充分混勻。將混合物置于冰水浴中5 min，在15 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，用質(zhì)譜級水稀釋至甲醇體積分?jǐn)?shù)為53%，15 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，進(jìn)樣進(jìn)行LC-MS分析[23]。從每個實(shí)驗(yàn)樣品中取等體積樣品，混勻制成QC樣品；53%甲醇溶液代替實(shí)驗(yàn)樣品作為空白樣品，前處理過程與實(shí)驗(yàn)樣品相同。

1.3.4 LC-MS條件

LC條件：Hypesil Gold色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫40 ℃，流速0.2 mL/min。正離子模式下：流動相A為0.1%甲酸，流動相B為甲醇；負(fù)離子模式：流動相A為5 mmol/L醋酸銨（pH 9.0），流動相B為甲醇。正、負(fù)離子模式下色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 色譜梯度洗脫條件Table 1 Chromatographic gradient elution procedure

MS條件：質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；電噴霧離子源；電壓3.5 kV；鞘氣流速35 L/min；輔助氣流速率10 L/min；離子傳輸管溫度320 ℃；離子導(dǎo)入射頻電平為60 V；輔助氣加熱器溫350 ℃；極性為正極和負(fù)極；MS/MS二級掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將下機(jī)數(shù)據(jù)（.raw）文件導(dǎo)入CD3.1搜庫軟件中進(jìn)行處理，與mzCloud、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對原始定量結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，最后得到代謝物的鑒定結(jié)果和相對定量值。

代謝物使用KEGG數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）、人類代謝組數(shù)據(jù)庫（Human Metabolome Database，HMDB）（http://hmdb.ca/metabolites）和脂質(zhì)代謝途徑研究計(jì)劃（Lipid metabolites and pathways strategy，LipidMaps）數(shù)據(jù)庫（http://www.lipidmaps.org/）注釋。使用t檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值）。差異代謝物采用多變量偏最小二乘判別分析模型的變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值，結(jié)合P值以及單變量差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）進(jìn)行篩選。

正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）使用SIMCA14.1軟件。主成分分析（principal component analysis，PCA）用Metaboanalst（http://www.metaboanalyst.ca），將數(shù)據(jù)歸一化為Z分?jǐn)?shù)進(jìn)行聚類熱圖制作?；鹕綀D基于log2FC和-lgP對上調(diào)與下調(diào)的代謝物進(jìn)行篩選，采用GraphPad Prism 9.4.0進(jìn)行圖形繪制。得到的KEGG通路具有P＜0.05、且過表達(dá)分析（overrepresentation analysis，ORA）被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集通路。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 25.0軟件，結(jié)果表示為±s，樣品3 個平行，顯著性P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本營養(yǎng)成分分析

如表2所示，發(fā)酵后的方竹筍超細(xì)全漿pH值從6.26降到4.77、4.16和4.20；可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.13%增加到0.34%、0.49%和0.53%?？傻味ㄋ岬暮坎煌赡苁且?yàn)榱_伊氏乳桿菌是異型發(fā)酵，而植物乳桿菌是同型發(fā)酵（發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸較多）。而粗蛋白含量LRP組高于其他組可能是因?yàn)樵黾恿司w蛋白所引起[24]或是發(fā)酵產(chǎn)生了更多的含氮類似物所引起[25]。此外總膳食纖維含量減少可能是因?yàn)槿闂U菌的生長代謝消耗了部分膳食纖維。

表2 乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿的基本營養(yǎng)成分Table 2 Basic nutritional composition of Lactobacillus-fermented ultra-fine whole pulp of bamboo shoot

2.2 UPLC-MS檢測

如圖1所示，在4～12 min檢測到的代謝物最多。如圖2所示，正離子和負(fù)離子模式下QC樣本相關(guān)性均大于0.992，而QC樣本相關(guān)性越高（R2越接近于1）說明整個檢測過程穩(wěn)定性越好，說明在質(zhì)譜檢測的過程中，樣品的均一度較好。

圖1 QC樣本與樣品的總離子流圖譜Fig.1 Total ion current chromatograms of QC samples and bamboo shoot samples

圖2 非靶向代謝樣本QC的Pearson相關(guān)性圖Fig.2 Pearson correlation coefficients of metabolites in QC samples analyzed in the positive and negative ion modes

2.3 代謝產(chǎn)物的PCA

使用MetaX軟件[26]對數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換及標(biāo)準(zhǔn)化處理。從表3可知，正離子模式下檢測出的代謝產(chǎn)物有948 種，負(fù)離子模式下檢測出的代謝產(chǎn)物有586 種，將代謝產(chǎn)物與KEGG、HMDB和LipidMaps數(shù)據(jù)庫對比，共檢測到正離子模式下有293、490 種和103 種；負(fù)離子模式下為192、313 種和92 種。將代謝產(chǎn)物進(jìn)行PCA，從圖3可知，正離子模式下PC1、PC2分別為47.5%、17.0%；負(fù)離子模式下PC1、PC2分別為53.33%、21.5%。CK與LR，LP和LRP組分開較遠(yuǎn)，組間明顯分離說明各組之間存在顯著差異，而各組間樣品相差不遠(yuǎn)說明組內(nèi)差異不明顯。

圖3 乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿代謝物PCA圖Fig.3 Principal component analysis plots of metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

表3 乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿代謝物的統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

2.4 代謝物的OPLS-DA

當(dāng)變量數(shù)量大于樣本個數(shù)時，使用PLS-DA所得到的模型會出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，而加入正交矯正后數(shù)據(jù)檢測出假陽性的概率會降低，使數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)建立的OPLS-DA模型中R2Y和Q2都接近于1，說明模型可靠[27]。如圖4所示，LR、LP和LRP、CK組分離較好，說明各組之間存在顯著差異；OPLS-DA置換檢驗(yàn)見圖5，置換圖反映模型是否出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象，其結(jié)果顯示正離子和負(fù)離子模式下，各實(shí)驗(yàn)組中Q2與縱軸的交點(diǎn)為負(fù)值，說明模型不存在過擬合。

圖4 乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿代謝產(chǎn)物的OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA scores of metabolites of Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

圖5 乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿代謝產(chǎn)物的OPLS-DA置換檢驗(yàn)Fig.5 Permutation test of OPLS-DA model for metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

2.5 代謝產(chǎn)物的火山圖分析

將代謝產(chǎn)物進(jìn)行單因素t檢驗(yàn)并結(jié)合綜合變異系數(shù)法可得兩組的差異化合物，且能清晰看出差異代謝物在組間是上調(diào)還是下調(diào)，其篩選條件為P＜0.05，log2FC＞1或log2FC＜-1。由圖6可知，正離子模式下CK和LR組中共篩選出差異代謝物361 種，上調(diào)178 種、下調(diào)183 種；CK和LP組中差異化合物有392 種，上調(diào)192 種、下調(diào)200 種；CK和LRP組中差異代謝物398 種，上調(diào)192 種、下調(diào)206 種；負(fù)離子模式下CK和LR組差異代謝物有268 種，上調(diào)144 種、下調(diào)124 種，CK和LP組篩選的差異化合物有304 種，上調(diào)162 種、下調(diào)142 種，CK和LRP組共篩選的差異代謝化合物有321 種，上調(diào)177 種、下調(diào)144 種。

圖6 乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿代謝產(chǎn)物的火山圖Fig.6 Volcano maps of metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

2.6 差異代謝物的篩選、分類和鑒定

采用多維統(tǒng)計(jì)VIP值大于1和單變量統(tǒng)計(jì)P＜0.05，log2FC＞1或log2FC＜-1進(jìn)行差異代謝物的篩選。如圖7所示，從Super Class分類上看，CK vs.LP組中脂類和類似脂類分子占26.44%，有機(jī)酸及其衍生物占16.11%，有機(jī)雜環(huán)化合物占16.41%，苯類占10.94%，苯丙烷和聚酮類占10.03%；CK vs.LR組中脂類和類脂類分子占27.00%，有機(jī)酸及其衍生物占17.67%，有機(jī)雜環(huán)化合物占16.00%，苯類占9.00%，苯丙烷和聚酮類占12.67%；CK vs.LRP組中脂類和類脂類分子占25.66%，有機(jī)酸及其衍生物占17.11%，有機(jī)雜環(huán)化合物占16.22%，苯類占10.62%，苯丙烷和聚酮類占10.91%。

圖7 乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿差異代謝產(chǎn)物的類別Fig.7 Categories of differential metabolites in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultrafine whole pulp

將代謝物與庫（mzCloud Re sults、m z Va ul t Results、MassList Results）進(jìn)行匹配，并將庫設(shè)置為full match[28]，選擇差異物繪制熱圖（圖8）。選擇FC（FC值大，上調(diào)越顯著；FC值小，下調(diào)越顯著）進(jìn)行物質(zhì)描述，正離子模式下，CK vs.LR組上調(diào)的主要差異化合物為組胺（FC=222.42）、胸腺嘧啶和脯氨酸等，下調(diào)的為組氨酸和腺苷（FC=0.001）等；CK vs.LP組上調(diào)的主要差異化合物為甲基腺苷（FC=30.78），植物鞘氨醇和香芹酮等，下調(diào)的為S-腺苷同型半胱氨酸（FC=0.02）和氧化苦參堿等；CK vs.LRP組上調(diào)的主要差異化合物為組胺（FC=163.07）、N6-甲基腺嘌呤和鳥氨酸等，下調(diào)的主要化合物有腺苷（FC=0.002）和胞苷等。由上述可知，核苷酸和氨基酸物質(zhì)是組間差異最顯著的物質(zhì)種類。核苷類化合物是維持生物細(xì)胞正常生命活動物質(zhì)，具有抗癲癇、抗腫瘤和抗心率失調(diào)等多種功能，近幾年，竹筍中的核苷類化合物也被鑒定出[29-30]。氨基酸類如鳥氨酸、脯氨酸和組氨酸等，乳酸菌發(fā)酵會使精氨酸通過細(xì)胞內(nèi)精氨酸脫亞胺酶途徑產(chǎn)生鳥氨酸[31]。此外，在LR組中FC最大是組胺，羅伊氏乳桿菌可以將L-組氨酸轉(zhuǎn)換為組胺，它是一種有機(jī)含氮化合物，能修復(fù)腸黏膜增強(qiáng)腸道的屏障功能[31-33]。同時Alan等[34]研究發(fā)現(xiàn)從泡菜里篩選的植物乳桿菌會產(chǎn)生組胺但不在毒性范圍。綜上，正離子模式下，羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿會產(chǎn)生組胺、核苷酸（甲基腺苷、7-甲基鳥苷等）和氨基酸（鳥氨酸、脯氨酸等）類物質(zhì)。

圖8 乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿差異代謝產(chǎn)物的聚類熱圖Fig.8 Cluster heatmap of differential metabolites in Lactobacillusfermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

負(fù)離子模式下，CK vs.LR組上調(diào)的差異化合物為D-甘露糖醇（FC=379.28）、吲哚-3-乳酸、N-乙酰甘氨酸等，下調(diào)的為鳥苷（FC=0.001）和尿苷酸等；CK vs.LP組上調(diào)的差異化合物吲哚-3-乳酸（FC=376.87）、DL-4-羥基苯乳酸和反式肉桂酸，下調(diào)的有檸檬酸（FC=0.004）和蘋果酸等；CK vs.LRP組中上調(diào)的化合物主要有吲哚-3-乳酸（FC=335.80）、DL-4-羥基苯乳酸和反式肉桂酸等，下調(diào)的主要有檸檬酸（FC=0.005）和鳥嘌呤核苷等。負(fù)離子模式下檢測的主要為有機(jī)酸及其衍生物類物質(zhì)，其中吲哚-3-乳酸在各組中是明顯上調(diào)的物質(zhì)。吲哚-3-乳酸是一種帶吲哚環(huán)的色氨酸代謝產(chǎn)物，不僅具有抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)作用，而且對糖尿病和炎癥型腸道疾病有明顯的作用[35]。Zhao Yansheng等[36]利用UPLC-HMRS的方法研究植物乳桿菌dy-1發(fā)酵大麥提物的代謝物，發(fā)現(xiàn)吲哚-3-乳酸、苯乳酸和咖啡醇等物質(zhì)在發(fā)酵后含量明顯增加。4-羥基苯乳酸是苯乳酸的羥基衍生物，研究發(fā)現(xiàn)，其與苯乳酸一樣有很好的抑菌效果[37]。沐萬孟等[38]用HPLC檢測乳桿菌SK007發(fā)酵液中4-羥基苯乳酸的最大質(zhì)量濃度為75 μg/mL。除了上述的差異代謝物外，D-甘露糖醇是羅伊氏菌發(fā)酵產(chǎn)生的FC最大的物質(zhì)。D-甘露糖醇是多元醇，具有抑制腫瘤保護(hù)肝臟等作用[39]；且有研究表明羅伊氏乳桿菌發(fā)酵薏苡仁會產(chǎn)生D-甘露糖醇[21]。負(fù)離子模式下，羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿能產(chǎn)生吲哚-3-乳酸、D-甘露糖醇、DL-4-羥基苯乳酸等生物活性作用的物質(zhì)。

2.7 代謝差異物的分類和功能注釋

將組間有KEGG ID的差異代謝物與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配，獲得差異代謝物參與通路，對富集分析得到差異物較多的通路進(jìn)行分析。圖9顯示了差異代謝物富集的通路，顏色深淺代表通路的重要性。正離子模式下，各組間富集到的代謝通路有所不同，但其主要的代謝通路為嘧啶代謝、嘌呤代謝、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂的代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝、β-丙氨酸的代謝、VB6的代謝、組氨酸代謝、苯丙氨酸代謝和核黃素代謝等。負(fù)離子模式下，主要的代謝通路為檸檬酸循環(huán)、苯丙氨酸代謝、嘧啶代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，酪氨酸和色氨酸生物合成及酪氨酸代謝等。

差異代謝物在某個通路中顯著富集，但仍不知道這些代謝物在這個代謝通路中是否起到關(guān)鍵作用，代謝物對代謝通路究竟有多大影響，拓?fù)浞治隹梢杂?jì)算關(guān)注的代謝物在代謝通路中的作用大小（用影響因子衡量）[40]。圖10為拓?fù)浞治鼋Y(jié)果虛線右側(cè)表明代謝通路越重要，結(jié)果表明，正離子模式下，CK vs.LR組中嘌呤代謝和嘧啶代謝是顯著的通路，CK vs.LP組和CK vs.LRP組中嘧啶代謝是顯著的通路；負(fù)離子模式下，各組中檸檬酸循環(huán)、苯丙氨酸代謝和嘧啶代謝是顯著的通路。從表4、5可以看出，嘌呤代謝主要參與的代謝物為鳥嘌呤、腺苷和2’-脫氧鳥苷等；胸腺嘧啶、胞嘧啶和胞苷等是嘧啶的代謝主要差異物；檸檬酸、富馬酸和異檸檬酸是檸檬酸循環(huán)的主要差異物；苯丙氨酸代謝中主要差異物質(zhì)為苯甲酸、苯乙醛和反式肉桂酸等。

圖10 乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿差異代謝產(chǎn)物顯著富集的代謝通路拓?fù)浞治鯢ig.10 Topological analysis of significantly enriched metabolic pathways for differential metabolites of Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultra-fine whole pulp

表4 正離子模式下乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿富集到KEGG通路中差異化合物Table 4 KEGG pathway enrichment of differential compounds in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultrafine whole pulp in the positive ion mode

表5 負(fù)離子模式下乳桿菌發(fā)酵竹筍超細(xì)全漿富集到KEGG通路中差異化合物Table 5 KEGG pathway enrichment of differential compounds in Lactobacillus-fermented bamboo shoot ultrafine whole pulp in the negative ion mode

有研究表明，有降解嘌呤能力的乳桿菌中就包括羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌[41]，所以這兩株菌發(fā)酵方竹筍后能下調(diào)其嘌呤的含量。嘧啶類化合物是構(gòu)成細(xì)胞中核糖核酸和脫氧核糖核酸的重要組成，而且許多嘧啶類藥物被證明有抗腫瘤活性[42]；嘧啶代謝往往會與氨基酸代謝聯(lián)系，如5-甲基胞嘧啶和胸腺嘧啶會參與纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解。檸檬酸循環(huán)是生物體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)供能的重要途經(jīng)。張妍等[18]研究了2 種乳酸菌發(fā)酵飲料并用非靶向代謝組學(xué)手段研究其差異代謝物與相關(guān)代謝通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檸檬酸循環(huán)是較為顯著的代謝通路。苯丙氨酸是人體所必需的氨基酸，人體不能合成只能從外界攝取，苯丙氨酸分解產(chǎn)生的酪氨酸不僅可以參與甲狀腺激素的合成，還可以被分解為富馬酸和乙酰乙酸，參與其他的生物途徑[43]。乳酸菌可以利用苯丙氨酸生成苯乳酸即苯丙氨酸通過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成苯丙酮酸，苯丙酮酸會提高苯乳酸的產(chǎn)量[44]。KEGG分析表明，羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌中富集到的嘌呤代謝途徑下調(diào)方竹筍超細(xì)全漿中的嘌呤含量，檸檬酸循環(huán)會產(chǎn)生更多的有機(jī)酸和風(fēng)味物質(zhì)，從而提升方竹筍超細(xì)全漿的品質(zhì)。

3 結(jié) 論

用羅伊氏乳桿菌和植物乳桿菌單一和混合發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿，利用非靶向代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合多元分析手段研究差異代謝物與代謝通路。以VIP值大于1，P值小于0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，各組中顯著的差異代謝物主要為脂類和類似脂類分子、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)雜環(huán)類化合物、苯類、苯基丙酸類和聚酮類化合物；將代謝物與庫（mzCloud Results、mzVault Results、MassList Results）進(jìn)行匹配發(fā)現(xiàn)正離子模式下差異代謝物主要為組胺、甲基腺苷、鳥氨酸和脯氨酸等，負(fù)離子模式下差異代謝物主要為D-甘露糖醇、吲哚-3-乳酸和DL-4-羥基苯乳酸等。差異代謝物所富集到代謝途徑表明，嘌呤代謝、嘧啶代謝、檸檬酸循環(huán)和苯丙氨酸代謝是較顯著的通路。乳桿菌發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿會通過上述代謝通路產(chǎn)生核苷酸和有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，會賦予其更多的風(fēng)味和營養(yǎng)。綜上，通過對乳桿菌發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿的代謝產(chǎn)物分析，探究了其差異代謝產(chǎn)物與代謝途徑，為乳桿菌發(fā)酵方竹筍超細(xì)全漿的進(jìn)一步研究提供理論參考。